công nghệ enzyme

Cách gọi tên enzyme Đối với các nhóm enzyme cùng xúc tác một loại phản ứng, người ta lấy tên của phản ứng enzyme thêm đuổi từ “ase”, ví dụ những enzyme xúc tác sựoxy hóa được gọi là oxyd

CÔNG NGHệ ENZYME

Tiến sỹ: Đỗ Lê Hữu Nam Viện Công nghệ sinh học và Môi trường,

Bộ môn: Công nghệ sinh học

NHỮNG CHỦ ĐỀ CỦA HỌC PHẦN

 Ch.đề 2 Xác định hoạt độ enzyme

 Ch.đề 3 Tách chiết và tinh sạch enzyme

 Ch.đề 4 Sản xuất enzyme từ vi sinh vật

Enzyme là các chất xúc tác của hệ thống sinh học.Chúng có khả năng xúc tác đặc biệt, mạnh hơn nhiều sovới các chất xúc tác tổng hợp Tác dụng xúc tác củachúng mang tính đặc hiệu cao với cơ chất, phản ứng xảy

ra ở điều kiện nhiệt độ và pH êm dịu

1.1NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN

đường thành rượu gọi là ferment có trong tế bào nấmmen.

• 1877, Wilhelm Kuhne, sinh lý học người Đức đầu tiên dùng thuật ngữ enzyme.

• Thế chiến thứ 1, Weitzman sản xuất aceton ở Anh.

Lịch sử phát triển enzyme

• 1897, Eduard Buchner phát hiên khả năng lên men của dịch chiết nấm men 1907, ông nhận nobel prize cho phát minh “cell free fermentation”.

• 1926, James B Sumner kết tinh enzyme urease và 1937 cho enzyme catalase.

• 1930, Northrop và Staley kết tinh enzyem pepsin.

• Thế chiến thứ 2, sản xuất kháng sinh theo qui mô công nghiệp.

Lịch sử phát triển enzyme

 •Lysozyme là enzyme được xác định cấu trúc đầu tiên

và năm 1965.

 •1969, xây dựng qui trình công nghiệp sản xuất amino

acid sử dụng enzyme.

 •1972, Boyer et al áp dụng kỹ thuật di truyền trong

công nghệ enzyme.

 •1973, sản xuất aspartic acid bằng lên men cố định tế

bào.

 •1984 đến nay, phát hiện hàng trăm loại enzyme khác

nhau và ứng dụng rộng rãi.

Cách gọi tên và phân loại

enzyme

Cách gọi tên enzyme

Trong thời gian đầu khi ngành enzyme học chưa phát triển, người ta thường gọi tên enzyme một cách tùy tiện, tùy theo tác giả Ví dụ như các tên pepsin, trypsin, chimotrypsin hiện nay vẫn được dùng gọi là tên thường dùng.

Sau đó, người ta thường gọi tên enzyme bằng cách lấy tên

cơ chất đặc hiệu của enzyme cộng thêm đuôi từ “ase”

Ví dụ: urease là enzyme tác dụng vào ure, proteinase là enzyme tác dụng vào protein, lipase là enzyme tác dụng vào lipid, amylase là enzyme tác dụng vào tinh bột (amidon).

1.1NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN

Cách gọi tên enzyme

Đối với các nhóm enzyme cùng xúc tác một loại

phản ứng, người ta lấy tên của phản ứng enzyme

thêm đuổi từ “ase”, ví dụ những enzyme xúc tác sựoxy hóa được gọi là oxydase, những enzyme khử

hydrogen được gọi là dehydrogenase

Tên gọi đầy đủ, chính xác theo quy ước quốc tế

-tên gọi hệ thống của enzyme được gọi theo -tên cơchất đặc hiệu của nó cùng với tên của kiểu phản

ứng mà nó xúc tác, cộng thêm đuôi “ase”

Cách gọi tên enzyme

ví dụ: enzyme xúc tác cho sự thủy phân ure (carbamid):

H2N - CO - NH2 + H2O  CO2 +2NH3

có tên hệ thống là Carbamid - amidohydrodase(Tên thường dùng là urease)

3

Phân loại enzyme

Mục đích của phân loại enzyme là để nhấn mạnh một cách chính xác và tổng quát, mối quan hệ và những điều giống nhau của một loại enzyme.

Tiểu ban về enzyme (The enzyme Commission EC)được tổ chức bởi Hội hóa sinh quốc tế (The

internationl Union of Biochemistry, IUB)đã đưa ra

cách phân loại thống nhất dựa trên các loại phản

ứng và cơ chế phản ứng Theo cách phân loại này

thì enzyme được chia ra làm sáu lớp lớn đánh số từ

1 đến 6 Các số thứ tự này là cố định cho mỗi lớp

Các l ớ p enzyme

1. Oxydoreductase:

Các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa

-khử Trong nhóm này có tất cả các enzyme có

các tên thông thường đã biết như

dehydrogenase, oxydase, cytochromreductase

và peroxydase Trong các phản ứng do chúngxúc tác xảy ta sự vận chuyển hydrogen, sự

chuyển electron, sự oxy hóa bởi oxy phân tử, bởihydrogen peroxide hoặc bởi các chất oxy hóa

khác

6

enzyme tổng hợp DNA và RNA).

Thuộc vào lớp này có các enzyme được gọi là hydratase, aldolase, decarboxylase cũng như một số desaminase.

alaninracemase) mà cả các enzyme xúc tác cho các phản ứng ví dụ sự chuyển hóa aldose thành cetose

(glucosophosphate isomerase, trước kia gọi là

phosphohexoisomerase) hoặc biến đổi vị trí của liên kết este bên trong phân tử (ví dụ phosphoglucomutase)

Ở đây cần chú ý thêm là các enzyme phân cắt được phân

loại với tên “lyase” Nếu cân bằng chuyển dịch về phía tổng hợp thì enzyme đó cũng có thể được gọi là “synthase”.

Ngược lại chúng ta gọi các enzyme xúc tác cho phản ứng kết hợp 2 phân tử có sự tham gia của ATP hoặc các nucleotide triphosphate tương tự hoặc có sử dụng mối liên kết giàu

năng lượng là synthetase Tên gọi theo hệ thống phân loại của lớp này là “ligase” để tránh sự đổi tráo với tên

“synthase” đã nói ở trên.

Mỗi lớp (class) lại được chia thành nhiều lớp phụ

(sub-class) và phân lớp phụ (sub-sub-class), rồi sau

đó thứ tự của enzyme trong phân lớp phụ (cũng

có tài liệu phân chia theo: loại (lớp), tổ, nhóm

và thứ tự enzyme)

Như vậy, mỗi enzyme trong hệ thống được phân

loại và đặt tên theo mã 4 chữ số biểu thị phản ứng

xúc tác: con số đầu chỉ lớp, số thứ hai chỉ lớp phụ,

số thứ ba chỉ phân lớp phụ, số thứ tư chỉ rõ số bậc

thứ tự của enzyme.

Ví dụ: enzyme xúc tác cho phản ứng:

Ethanol + NAD+ acetaldehyde + NADH + H+

có tên gọi là alcohol dehydrogenase (ADH), tên

quốc tế theo khóa phân loại là: Alcohol: NAD

oxydoreductase, EC 1.1.1.1

Trong đó, mã số 1 đầu tiên biểu thị tên lớpenzyme là oxydoreductase (lớp 1); mã số 1 thứ haibiểu thị lớp phụ 1: tác dụng lên nhóm CH - OH của

các chất cho; mã số 1 thứ ba biểu thị phân lớp phụ

1: chất nhận là NAD hay NADP và mã số 1 cuối

cùng chỉ số thứ tự của enzyme

Như vậy, trong cách gọi hệ thống của enzyme ADH trên có tên của cơ chất và của coenzyme cũng như tên của quá trình chuyển

hóa hóa học được xúc tác với tận cùng “ase”.

Sau tên của enzyme là số của nó theo danh sách các enzyme do tiểu ban về enzyme đề

ra (enzyme commission, EC).

Như vậy, trong cách gọi hệ thống của enzyme ADH trên có tên của cơ chất và của coenzyme cũng như tên của quá trình chuyển

hóa hóa học được xúc tác với tận cùng “ase”.

Sau tên của enzyme là số của nó theo danh sách các enzyme do tiểu ban về enzyme đề

ra (enzyme commission, EC).

*** Proteins là gì?

Proteins là những phân tử

sinh học có vai trò tối quan

trọng đối với hoạt động của

cơ thể sống

 Thực hiện nhiều chức

năng khác nhau

4

27th November 2008, University of Warwick

Proteins cấu trúc: Những đơn vị cơ bản xây dựng cơ thể, vd.

collagen, móng, tóc, da, cơ v.v

Enzymes: được ví như ‘động cơ sinh học’, xúc tác cho hàng loạt các phản ứng hóa sinh trong cơ thể.

Protein vận chuyển qua màng (transmembrance): là những ‘ người gác cổng’ của tế bào, ví dụ Bằng cách điều chỉnh kích cỡ TB, chất dinh dưỡng và

gradien ion từ môi trường ngoại bào có thể đi vào bên trong

nội bào ( vd Na/K)

5

 Nắm được cấu trúc protein là chìa

khóa để hiểu chức năng

and hoạt động khác thường

6

Cấu tử của Proteins

 Thành phần:

− Amino Acids

− Đơn vị cơ bản chung

Livingstone and Barton:(1993)

• Distinct “side chains”

• 20 Amino Acid Types

27th November 2008, University of Warwick 7

27th November 2008, University of Warwick

Cấu tử của Proteins

8

27th November 2008, University of Warwick 8

Cấu tử của Proteins

• Hàng ngàn tính chất hóa sinh, lý sinh khác nhau (AAIndex)

• Do đó proteins là những tổ hợp diệu kỳ!

 Cấu trúc Protein

− Chuỗi cuộn lại thành

Những cấu trúc đặc biệt hơn

 Cấu trúc cuộn là ngẫu nhiên

27th November 2008, University of Warwick

 Các enzyme là những protein được cấu tạo từ 20

L- α amino acid ( đúng hơn 19 a.a và 1 imino acid

prolin)

 Các a.a kết hợp với nhau qua liên kết peptid

(-CO-NH-) được tạo thành do phản ứng kết hợp giữa

nhóm α –carboxyl của a.a đứng trước với nhóm α

–amin của a.a tiếp theo, loại đi một phân tử nước

 Phân biệt ‘đầu N’ (dấu +), ‘đầu C’ (dấu -) chuỗi a.a

33

Isoleucine (I), methionine (M), proline (P)

Cũng như: Tyrosin (Y)

Lysine (K) Cũng như

Arginine (R ) and histidine (H)

Cũng như

Threonine (T) and Cysteine (C)

Tính chất Amino Acid

Nhóm chức Ưa nước - H liên kết với nước

ở môi trường Bên ngoài protein

Nhóm chức kỵ nước-Tương tác kỵ nước ở

môi trường BÊN TRONG protein

Cấu trúc 3D của ENZYME

PEPTIDES POLYPEPTIDES PROTEINS

Tăng độ phức tạp của cấu trúc

4 Bậc cấu trúc của enzyme

Cấu trúc bậc 1

Chuỗi AMINO ACID (AAS)

Tương tác duy nhất giữa AAs là lk peptide Không có tương tác hoặc lk làm bền khác

2 dạng của cấu trúc bậc 2

Chuỗi peptide cuộn

Những nhóm R hướng ra ngoài từ trục

Liên kết H giữa CO và NH cách nhau 4

2 Phiến Beta ( Phiến β)

Chuỗi Polypeptide được trải rộng

Liên kết H giữa CO và NH trên các chuỗi

polypeptide khác nhau

Những chuỗi có thể chạy cùng 1 hướng

( phiến β song song) hoặc theo các hướng ngược nha (phiến β song song ngược )

Song song ngược

Tơ lụa - phiến β

Cấu trúc bền vững

Cấu trúc 3D

của myoglobin

Liên kết H (ser, thr nhóm OH)

Tương tác tĩnh điện giữa các nhóm mang điện (lys, arg, his, glu, asp)

Tương tác kỵ nước Hydrophobic (leu, val, phe

Liên kết Van der Waals

Cầu nối Disulphide giữa cysteine

Các loại liên kết

Liên kết cấu trúc

Bậc 3

Cấu trúc bậc 4

Phức của 2 hoặc nhiều chuỗi polypeptide

(đã có cấu trúc bậc 3)

Mỗi chuỗi polypeptide thành viên gọi là

phần dưới đơn vị-subunits gắn với nhau nhờ liên kết hóa trị , phi hóa trị

Được gọi là E oligomer

***Phân loại enzyme theo cấu tạo

 Enzyme đơn giản (một thành phần), phức tạp (hai

thành phần-holoenzyme)

 Holoenzyme gồm apoenzyme và coenzyme

 Apoenzym hay apoprotein: chỉ có protein trong

thành phần cấu tạo của nó.

 Coenzym: enzym có protein kết hợp với phân tử

kim loại tạo thành phức hữu cơ – kim loại.

 Các đồng yếu tố được gọi là nhóm ngoại

prosthetic.

58

 Trong cấu trúc phân tử của enzyme, tính chất

tinh vi và phức tạp không chỉ giới hạn ở phạm vi

từng phân tử, từ thành phần cấu tạo và các bậc

cấu trúc cho đến cấu tạo của trung tâm hoạt động

cùng với vai trò của các nhóm chức năng mà còn

thể hiện ở tính đa dạng của các phân tử enzyme.

được phát hiện ở các cơ thể sống khác nhau từ

người, động vật, thực vật đến vi sinh vật.

59

- Những enzyme xúc tác cùng một phản ứng hóa

học và có cùng tính đặc hiệu cơ chất nhưng có

nguồn gốc khác nhau nên thể hiện nhiều tính

chất khác nhau:

Vd: Aldolase có nguồn gốc từ nấm men có

nhiều tính chất khác với aldolase của mô động

vật; pepsin, trypsin, chymotrypsin, xanthin

-oxydase và lysozyme cũng có những dạng phân

tử khác nhau.

60

-Nhiều enzyme tương tự nhau thu được từ

cùng một loại mô nhưng của những loài khác

nhau cũng có những tính chất khác biệt nhau:

α - amylase của dịch nước bọt và dịch tụy

của người th giống nhau, nhưng chúng khác

với α - amylase thu được từ tụy lợn về độ

hòa tan, về pH thích hợp và một số tính chất

khác

61

 Những enzyme có nguồn gốc từ những mô khác

nhau của cùng một loài, tuy xúc tác cùng một

loại phản ứng hóa học, nhưng khác nhau rất rõ

rệt về tính đặc hiệu cơ chất như trường hợp của

những cholinesterase

 Các enzyme xúc tác những phản ứng chuyển hóa

giống nhau trong các tế bào của nhiều mô khác

nhau có tính chất đặc hiệu cơ quan, ví dụ lactat

dehydrogenase của cơ tim và cơ xương khác

nhau r õ rệt về tốc độ di chuyển điện di và nhiều

tính chất khác.

62

 Ngay trong một mô hay một cơ quan, cũng

tồn tại những dạng phân tử khác nhau:

 Trong cơ tim ít nhất cũng có hai dạng phân tử của

lactat dehydrogenase có tốc độ di chuyển điện di

khác nhau, từ nấm men có thể tách ra được bốn

dạng phân tử của phosphoglyceraldehyde

dehydrogenase

Trong một tế bào, một enzyme nào đó cũng có thể

có những dạng phân tử khác nhau tồn tại trong các

bộ phần khác nhau của tế bào, ví dụ aspartat

aminotransferase có dạng phân tử trong ty lạp thể

khác với dạng phân tử của enzyme này ở bào

Các dạng phân tử khác nhau của cùng một

enzyme, tuy cùng có chức năng xúc tác một

phản ứng hóa học giống nhau nhưng vì cấu

trúc phân tử của chúng đều ít nhiều có khác

nhau, do đó chúng có những tính chất khác

nhau về hóa học, vật lý, miễn dịch thậm

chí ngay cả động học và tính đặc hiệu của

phản ứng enzyme.

64

Theo kiến nghị chính thức của ủy ban thường

trực về enzyme của Hội Hóa sinh Quốc tế,

danh từ isoenzyme được dùng để chỉ những

dạng phân tử khác nhau của một enzyme tồn

tại trong một loài; ngoài danh từ này, danh từ

isozyme cũng được quen dùng.

65

 Theo một số tác giả, khi phân loại các dạng phân

tử khác nhau của enzyme, phải phân biệt giữa

isoenzyme và heteroenzyme

 Danh từ isoenzyme chỉ dành cho những dạng

phân tử của một enzyme có nguồn gốc từ cùng

một cơ quan và mô cũng như phải có cùng hoạt

động xúc tác như nhau;

 Danh từ heteroenzyme dành cho những dạng

phân tử cùng có hoạt động xúc tác giống nhau

nhưng có thể có nguồn gốc từ các cơ quan hoặc

loài khác nhau

66

*** site) Trung tâm hoạt động enzyme (active

 Trung tâm hoạt động: nhóm hóa học tiếp xúc trực

tiếp cơ chất; nhóm hóa học không tiếp xúc cơ

chất nhưng tác dụng trực tiếp đến quá trình xúc tác

Có tính đặc hiệu lớn cho những cơ chất nhất định

và xúc tác cho sự chuyển hóa chúng thành những

sản phẩm đặc biệt.

 Gồm các amino acid có nhóm hoá học hoạt động

mạnh; ion kim loại; nhóm chức của coenzyme.

 Enzyme thể có một, hai, thậm chí 4 trung tâm hoạt

 Ở các enzyme một thành phần, trung tâm hoạt

động thường bao gồm một tổ hợp các nhóm

chức năng của amino acid không tham gia tạo

thành trục chính của sợi polypeptide.

 Ví dụ nhóm - SH của cysteine - OH của serine,

threonine và tyrosine, e - NH2 của lysine,

-COOH của glutamic acid, aspartic, vòng

imidazol của histidine, indol của tryptophan,

nhóm guanidin của arginine.

70

 Các nhóm này có thể ở xa nhau trong mạch

polypeptide nhưng lại gần nhau trong không

gian, được định hướng xác định trong không gian

cách nhau những khoảng cách nhất định sao cho

chúng có thể tương tác với nhau trong quá trình

xúc tác.

 Trung tâm hoạt động của các enzyme hai thành

phần thường bao gồm nhóm ngoại (vitamin, ion

kim loại ) và các nhóm chức năng của các

amino acid ở phần apoenzyme.

71

Giữa cơ chất và trung tâm hoạt động tạo

thành nhiều tương tác yếu, do đó có thể dễ

dàng bị cắt đứt trong quá trình phản ứng để

giải phóng enzyme và sản phẩm phản ứng.

Trung tâm hoạt động của các enzyme có cấu

trúc bậc 4 có thể nằm trên một phần dưới đơn

vị hoặc bao gồm các nhóm chức năng thuộc

các phần dưới đơn vị khác nhau.

72

PHƯƠNG PHÁP THĂM DÒ VÀ PHÁT HIỆN CÁC NHÓM

CHỨC NĂNG TRONG TRUNG TÂM HOẠT ĐỘNG CỦA

ENZYME

 Đây là việc khó khăn và phức tạp, phải sử dụng

hàng loạt phương pháp khác nhau.

 Muốn thăm dò, phát hiện và xác định các nhóm chức

năng của phân tử enzyme, người ta thường dùng các

phương pháp vật lý, hóa học, xác định hằng số ion

hóa của các nhóm chức năng và tốt nhất là kết hợp

với việc nghiên cứu cấu trúc phân tử của enzyme và

của trung tâm hoạt động.

 Thông thường người ta khóa, phá huỷ, hoặc đánh

dấu các nhóm chức năng đó bằng các thuốc thử hóa

học như chất ức chế đặc hiệu, cơ chất hoặc

coenzyme

74

- Phương pháp dùng chất ức chế:

+ Đối với một số enzyme oxy hóa khử có nhóm hoạt

động là ion sắt người ta dùng xyanua (cyanide CN)

để phát hiện vai trò của ion sắt đối với hoạt tính của

enzyme với CN kết hợp với ion sắt làm cho enzyme

mất khả năng vận chuyển điện tử.

+ Một số enzyme cần có ion kim loại tham gia vào

qu.tr xúc tác hoặc để giữ ổn định cấu trúc phân tử

enzyme Để thăm dò phát hiện đặc tính cần kim loại

của chúng, người ta dùng chất kết hợp kim loại như

EDTA (Ethylen diamino tetraacetate) hoặc

orthophenantrolin Nếu là enzyme cần kim loại thì