công nghệ ENZYME, DNA polymerase

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH  TIỂU LUẬN CÔNG NGHỆ ENZYME BÀI DỊCH 6.5.2 DNA polymerase Bảng 47 liệt kê thuộc tính polymerase DNA quan trọng A 6.5.2.1 Escherichia coli DNA polymerase I Enzym E coli polymerase I, gọi deoxynucleoside triphosphate: deoxynucleotidyltransferase DNA (DNA-trực tiếp) (EC 2.7.7.7) [9012-90-2], lấy từ Escherichia coli Tính chất Escherichia coli DNA poylmerase I bao gồm polypeptide với khối lượng phân tử 109× 103 dalton [1679] chứa ion Zn + phân tử [1678] Enzyme bao gồm hai vùng tham gia protease nhạy cảm liên kết peptide [1680], [1681], protein hồn chỉnh có dạng hình cầu với đường kính 6500 pm [1682], [1683] Escherichia coli DNApolymerase I có nhóm mercapto tự để tạo thành phức hợp phân ly với Hg + Protein carboxymethylated mà khơng hoạt tính [1684] Một đơn vị E coli DNA polymerase I định nghĩa hoạt động enzyme kết hợp với 10 nmol nucleotide để tạo thành axit kết tủa 30 phút 370C [1685] Sử dụng Escherichia coli DNApolymerase I sử dụng chủ yếu ống nghiệm cho đánh dấu DNA dịch chuyển từ điểm cắt [1476] Một số thủ tục công bố tất theo nguyên tắc chung (Hình 100) Hàm lượng DNase I (xem Phần 6.5.4.1) đưa điểm cắtvào DNA không đánh dấu, phơi bày nhóm 3’hydroxyl bên Những hoạt động E coli DNApolymerase I di chuyển phía điểmcuối 3’ Đầu tiên, enzyme loại bỏ nucleotide đầu 5’ điểm cắt Trong phản ứng kết hợp sau đó, nucleotide cắt thay nucleotide có đánh dấu điểm cuối 3’ điểm cắt Hoạt động lặp lặp lại E coli polymerase I thay tất nucleotide với nucleotide có đánh dấu phía cuối từ điểm cắt Dưới 22 0C, phản ứng không tiếp tục tồn trao đổi đầy đủ sợi DNA khơng đánh dấu việc có đánh dấu mình, thể hình 100 Hình 100 Sử dụng DNA enzyme RNA-sửa đổi tổng hợp DNA tái tổ hợp Cho viết tắt, xem văn Theo tỷ lệ DNA, DNase I, E coli DNA polymerase I, khoảng 2040% nucleotide có đánh dấu đưa vào sản phẩm, với suất mật độ đánh dấu 108-109 dpm i microgram DNA Có 20-30% đánh dấu kết hợp thường tìm thấy DNA foldback [1686] Số lượng DNA foldback thường cao đoạn DNA không đánh dấu tương đối nhỏ (> A ~T >> G [ 1770 ] Sử dụng: Exonuclease III sử dụng chủ yếu cho hệ sợi đơn vùng cuối dsDNA cách hoạt động 3’-5’- exonucleaza ADN biến đổi theo cách sử dụng chất cho nhãn DNA với enzyme Klenow cho nghiên cứu trình tự [ 1771 ], [ 1768 ], [ 1769 ] Một ứng dụng khác exonuclease III để rút ngắn dần hai sợi dsDNA tiêu hóa bổ sung exonuclease III tạo đuôi sợi đơn với nuclease S1 [ 1772 ] Exonuclease sử dụng để xác định ổn định bệnh tích quy định trình tự DNA [.1773 ] 6.5.4.3 Nuclease S1 Nuclease S1 , gọi Aspergillusnuclease S1 (EC 3.1.30.1 ) , thu từ Aspergillus oryzae Đặc tính: Nuclease S1 protein monomeric có khối lượng phân tử 38 ×103 dalton [ 1774 ], [ 1775 ] Enzyme glycoprotein có chứa 18% carbohydrate lượng dư [ 1774 ] Điểm đẳng điện pH 4,3-4,4 [ 1776 ] 15 Một đơn vị nuclease S1 định nghĩa hoạt động enzyme cho 1mg deoxynucleotides acid hoà tan từ DNA biến tính phút 37 0C [ 1775 ] PH tối ưu 4,0-4,3 pH tối đa 3.3 4.9 pH giá trị cao ( 4,6-5,0 ) sử dụng nhằm tránh điểm cắt chất DNA depurination Enzyme đòi hỏi Zn2 +cho hoạt động tối ưu Các ion Co +và Hg2 + thay Zn2 +, hiệu [ 1775 ] Nuclease S1 hoạt động tối ưu nồng độ NaCl 0,1 mol / L tương đối không bị ảnh hưởng sức mạnh ion 0,01 0,2 mol / L NaCl [ 1777 ] Enzyme ổn định biến tính với urê, natri dodecyl sulfate , Formamide [ 1778 ] sử dụng enzyme nồng độ cao để ngăn chặn điểm không đặc hiệu nồng độ muối phải đủ cao ( > 0,2 mol / L) [ 1779 ] Sử dụng: Ở điều kiện tối ưu , tỉ lệ nuclease S1- xúc tác thủy phân axit nucleic đơn kép ước tính khác theo hệ số 75 000 [ 1780 ] Như vậy, việc ứng dụng nuclease S1 cắt sợi đơn kết thúc DNA RNA để nhơ mà khơng phải sợi đơi kết thúc [1781 ], [ 1782 ] Lập đồ sản phẩm phiên mã thực cách phân tích S1kháng đoạn RNA- DNA lai gel agarose kiềm polyacrylamide biến tính [ 1783 ], [ 1784 ] Độ phân giải cao việc lập đồ thu sau kết thúc ghi nhãn DNA với 32P cách phân tích S1- kháng đoạn DNA gel giải trình tự [ 1786 ] Sử dụng phương pháp cho phép lập đồ đầu 5’ 3’ mRNA [ 1787 ] Trái ngược với exonuclease VII, vòng sợi đơn lai dsDNA RNA - DNA tiêu hóa nuclease S1 [ 1788 ], [ 1789 ] Do đó, lập đồ intron gen sinh vật nhân chuẩn cách tiêu hóa lai mRNA trưởng thành 32P- dán nhãn sợi DNA gen mã hoá với nuclease S1 (Hình 104) Một ứng dụng để tận dụng tài sản tiêu hóa kẹp tóc cấu trúc q trình tổng hợp cDNA [ 1719 ] Một đồ S1đã dựa phân tích hai chiều gel điện mơ tả [ 1790 ] 16 Phương pháp lập đồ S1 sử dụng thành công để nghiên cứu quy định gen nhân giới thiệu để vào tế bào nhân chuẩn [ 1791 ] 6.5.4.4 Nuclease Bal 31 Nuclease Bal 31 , gọi exodeoxyribonuclease (EC 3.1.11 ) , thu từ Alteromonas espejiani Đặc tính: Nuclease Bal 31 làm giảm hai sợi dsDNA từ kết thúc vào phía Enzyme có hoạt tính endonuclease ssDNA cụ thể mà phân cắt DNA supercoiled để mang lại , ví dụ , hình thức tuyến tính Khơng dsDNA cụ thể hoạt tính endonuclease liên kết với enzyme Một đơn vị nuclease Bal 31 xác định hoạt động enzyme tạo 600 cặp bazo 10 phút 300C từ 2mg pUR222 DNA tuyến tính[ 1792 ] Hoạt động enzyme cần phải có Ca2 +và Mg2 +.Và nồng độ NaCl tối ưu 0,6 mol/L Nuclease Bal 31 không bị ức chế natri dodecyl sulfate urê Những mảnh vỡ DNA ngắn với nuclease Bal 31 thắt dễ dàng với T4 DNA ligase hay trực tiếp sau điền vào cuối sợi đơn với enzyme Klenow Sử dụng Nuclease Bal 31 sử dụng để lập đồ DNA với enzyme hạn chế [ 1793 ] Đoạn DNA ánh xạ rút ngắn đến độ dài khác với nuclease Mỗi mẫu sau tiêu hóa với hạn chế endonuclease tương ứng, mảnh vỡ kết phân tích điện di Cùng với rút ngắn 17 Hình 104 Bản đồ intron gen thuộc sinh vật nhân chuẩn phân huỷ lai mRNA trưởng thành mã hóa sợi DNA với nuclease S1 Khác sử dụng nuclease Bal 31 chuyển giao trang web hạn chế nằm liền kề với vị trí chọn trước [ 1794 ] Cụ thể ssDNA hoạt động endonuclease nuclease Bal 31 khai thác để điều tra cấu trúc thứ cấp DNA cực xoắn cấu trúc xoắn ốc thay đổi DNAkhông cực xoắn sản xuất chất gây ung thư tác nhân gây đột biến [ 1538 ] 6.5.5 RNA nucleases Bảng danh sách 47 nucleases RNA quan trọng D 18 6.5.5.1 RNase H Enzyme RNase H , gọi endoribonuclease (EC 3.1.26.4 ) , thu từ Escherichia coli Đặc tính: Hoạt động enzyme tìm thấy E.coli, RNase H định thủy phân RNA RNA – DNA lai, có hoạt động chống lại RNA RNA Song lập RNA gọi RNase III [ 1795 ] Một đơn vị RNase H hoạt động enzyme tạo nmol axit hòa tan ribonucleotides từ 3H- poly ( A) - poly ( dT) 20 phút 37 0C [ 1796 ] RNase H hoạt động endoribonuclease làm giảm sợi RNA RNA -DNA lai có nguồn gốc tự nhiên , phức hợp tổng hợp poly ( A) nhiều poly ( DT ) RNase H tạo ribonucleotides với 5’-phosphate điểm cuối 3’-hydroxyl Hầu khơng có hoạt động phát với poly ribonucleotides polyme ủ để ribopolymer bổ sung họ Để hoạt động tối ưu, RNase H đòi hỏi Mg2 + mà thay có phần Mn + Các enzyme có hoạt động tối đa có diện hợp chất chứa nhóm mercapto bị ức chế BYN - ethylmaleimide độ pHtối ưu 7.5 9.1 RNase H hoạt động tương đối nhạy cảm với muối ; 50% hoạt động giữ lại diện NaCl 0,3 mol / L [ 1797 ] Sử dụng: Ngoài việc sử dụng vào E coli RNase H dùng cho việc nghiên cứu thể với chức RNA- DNA tổng hợp mồi [ 1796 ] , RNase H áp dụng trình tổng hợp cDNA kết hợp tổng hợp sợi cổ điển với tổng hợp tiểu thuyết sợi đôi trung gian tạm biệt E.coli DNApolymerase I, E coli RNase H E coli DNA ligase [ 1798 ], [ 1724] Hơn nữa, RNase H sử dụng để phát vùng RNADNA dsDNA từ nguồn gốc tự nhiên [ 1799 ], [ 1707 ] Một ứng dụng enzyme đólà loại bỏ poly ( A) trình tự mRNA , dẫn đến tăng tính đồng mRNA điện di gel [ 1800 ] RNase H 19 sử dụng cho enzyme tách vùng cụ thể RNA Với phương pháp , oligomer DNA lai tổng hợp để bổ sung vùng sợi đơn phân tử RNA, phân huỷ RNase H vùng cụ thể [ 1801 ] 6.5.5.2 Điểm đặc hiệu RNase 6.5.5.2.1 RNase A Enzyme RNase A, gọi ribonuclease, (EC 3.1.27.5 ) , thu từ tuyến tụy bò Đặc tính: RNase A endonuclease phân cắt RNA không DNA Enzyme đặc biệt xâm chiếm nucleotide pyrimidine cách tách 3’phosphodiester liền kề liên kết Py / pN Khối lượng phân tử 13,7 ×10 dalton pH tối ưu 7,0-7,5 [ 1867 ], [ 1802 ] Vòng 2’, 3’-pyrimidin nucleotide thu từ trung gian Pyrimidin 3’- phốt phát oligonucleotide với nhóm pyrimidin phosphate sản phẩm cuối Một đơn vị RNase A định nghĩa hoạt động enzyme mà sản xuất tổng số RNA chuyển đổi chất phút 250C Việc giảm hấp thụ A0 để tương ứng với A1 tổng chuyển đổi, A1được hấp thụ cuối [ 1803 ] RNase A sử dụng A- RNase G- cụ thể RNA trình tự [ 1804 ], [ 1806 ] 6.5.5.2.2 RNase CL3 Enzyme RNase CL3 , gọi endoribonuclease (EC 3.1.27.1 ) , thu từ gan gà RNase CL3 phân cắt RNA chủ yếu liên kết Cp / N tạo các đoạn với đầu 3’- cytidine phosphate Liên kết loại Ap / N Gp / N cắt thường xuyên, Up / N cắt đến mức độ nhỏ [ 1804 ] Khối lượng phân tử 16,85×103 dalton; pH tối ưu 6,5-7,5 [ 1805 ].Một đơn vị RNase CL3 định nghĩa hoạt động enzyme giải phóng lượng đủ oligonucleotide axit hòa tan để tạo chất hấp thụ tăng 1,0 260 nm 15 phút 370C [ 1805 ] Một đơn vị tương ứng với phân hủy poly ( C) 40µg ca RNase CL3 sử dụng trừ -U- cụ thể RNase 20 RNA trình tự [ 1804 ], [ 1806 ] Các Cp / N phân cắt hiệu có diện urê 500C , tức điều kiện cấu trúc thứ cấp RNA bị phá hủy [ 1806 ], [ 1807 ] Dưới điều kiện biến tính , khoảng 5-10 lần so với enzyme sử dụng, chủ yếu C- cụ thể thu từ phân cắt 6.5.5.2.3 RNase T1 Ribonuclease T1 (EC 3.1.27.3 ) , gọi endoribonuclease , thu từ Aspergillus oryzae RNase T1là endonuclease mà phân cắt RNA không DNA Các enzyme đặc biệt công 3’liên kết phosphodiester Gp / N Do RNase T1 sử dụng RNase G- cụ thể trình tự RNA [ 1804 ], [ 1806 ] Khối lượng phân tử 11,1× 10 3dalton , pH tối ưu 7,4 [ 1808], [ 1809 ] vòng 2’, 3’- guanosine nucleotides thu trung gian, guanosine 3’- phốt phát oligonucleotide với nhóm cuối guanosine 3’phosphate sản phẩm cuối Một đơn vị RNase T1được định nghĩa hoạt động enzyme giải phóng đủ lượng oligonucleotide axit hòa tan với chất hấp thụ 1,0 260 nm với DNA biến tính 15 phút 37 0C[ 1808 ] RNase T1được sử dụng đặc biệt cho chuỗi RNA trình tự RNA vân tay 6.5.5.2.4 RNase U2 Ribonuclease U2 (EC 3.1.27.4 ) , gọi endoribunuclease , thu từ Ustilago sphaerogena RNase U2 endonuclease mà phân cắt RNA không DNA Các enzyme đặc biệt xâm chiếm nucleotide purine cách tách 3’ -phosphodiester liền kề liên kết Pu / pN [ 1829 ] Khối lượng phân tử 10× 103 dalton , pH tối ưu 3,5 Vòng 2’, 3’- purine nucleotide thu trung gian Purine 3’-phốt phát oligonucleotide với nhóm cuối purine 3’phosphate sản phẩm cuối đảo ngược bước cuối sử dụng để tổng hợp APN GPN [ 1810 ] Một đơn vị RNase U2 định nghĩa hoạt động enzyme có giải phóng lượng đủ oligonucleotide để 21 sản xuất chất hấp thụ tăng 1,0 260 nm với DNA biến tính 15phút 370C [ 1810 ] RNase U2 sử dụng cụ thể A- G- RNase RNA trình tự [ 1804 ], [ 1806 ] 6.5.5.2.5 Nuclease S7 Nuclease S7 , gọi endonuclease (EC 3.1.31.1 ) , thu từ Staphylococcus aureus Nuclease S7 endonuclease mà gắn bó DNA RNA Các sản phẩm thu sau phân cắt RNA DNA với nuclease S7 oligo - mononucleotides với nhóm cuối 3’-phosphate Enzyme thể A U đặc biệt RNA phân huỷ pH 7,5 [ 1811 ] Một đơn vị nuclease S7 định nghĩa hoạt động enzyme có tạo lượng đủ oligonucleotide axit hòa tan để sản xuất chất hấp thụ tăng 1,0 260 nm với DNA biến tính 30 phút 370C [ 1811] Enzyme sử dụng rộng rãi để tối ưu hóa tiêu chuẩn lysate thỏ hồng cầu lưới Các hệ thống tổng hợp protein mRNA phụ thuộc vào số thấp nội sinh RNA thu cách ủ bệnh lysate với enzyme diện CaCl [ 1812 ] Vì phụ thuộc chặt chẽ nuclease ion Ca2 + , dễ dàng bị bất hoạt tác nhân hoá cụ thể axit Ethylenediaminetetraacetic Khi ủ 50 0C pH 7,5 diện CaCl2 urê, liên kết NPA NPU cắt Do Nuclease S7 sử dụng cụ thể A- U- RNase RNA trình tự [ 1806 ] Phản ứng tạo đoạn cuối RNA với 3’-phosphate Như vậy, giải trình tự gel, đoạn RNA tạo để thay đổi điểm cuối nucleotide so với đoạn RNase T1 RNase U2 có chiều dài giống hệt 22 23 ...BÀI DỊCH 6.5.2 DNA polymerase Bảng 47 liệt kê thuộc tính polymerase DNA quan trọng A 6.5.2.1 Escherichia coli DNA polymerase I Enzym E coli polymerase I, gọi deoxynucleoside... cho T4 DNA polymerase Polymerase khơng thể sử dụng DNA đơi có chứa điểm cắt mẫu mồi Tuy nhiên, bổ sung T4 gene 32 protein tạo điều kiện cho chuyển sợi, cho phép T4 DNA polymerase tái tạo DNA đôi... hợp sản phẩm phiên mã cDNA chuỗi RNA cụ thể ống nghiệm (Hình 102) Tổng hợp sợi DNA xúc tác RNA - phụ thuộc vào hoạt động DNA polymerase DNA phụ thuộc vào hoạt động DNA polymerase có trách nhiệm