bài giảng công nghệ enzyme

Trường Cao Đẳng Kinh tế Công nghệ TPHCM Khoa Công nghệ Sinh học ************************** C C Ô Ô N N G G N N G G H H Ệ Ệ E E N N Z Z Y Y M M E E (Tài liệu lưu hành nội bộ) CBDG: ThS. Lê Thanh Hải HIAST TPHCM, 03/2013 CÔNG NGHỆ ENZYME i MỤC LỤC 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Lịch sử nghiên cứu và phát triển công nghệ enzyme 1 1.2. Khái niệm về enzyme 2 1.2.1. Bản chất sinh học của enzyme 3 1.2.2. Bản chất hóa học của enzyme 4 1.2.3. Cấu trúc của enzyme 5 1.3. Cơ chế tác dụng của enzyme 7 1.3.1. Cơ chế xúc tác của enzyme 7 1.3.2. Năng lượng xúc tác 8 1.3.3. Sự tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất 8 1.3.4. Động học của phản ứng enzyme 9 1.3.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng enzyme 10 1.3.5.1. Nhiệt độ 10 1.3.5.2. pH 11 1.3.5.3. Chất kìm hãm 11 1.3.5.4. Chất hoạt hóa 12 1.3.6. Tính chất đặc hiệu của enzyme 13 1.4. Phân loại enzyme 13 1.4.1. Danh pháp quốc tế của enzyme 13 1.4.2. Phân loại enzyme 14 1.4.2.1. Oxydoreductase 14 1.4.2.2. Transpherase 14 1.4.2.3. Hydrolase 15 1.4.2.4. Lipase 15 1.4.2.5. Isomerase 15 1.4.2.6. Ligase 15 1.5. Phương pháp tách và làm sạch enzyme 15 1.5.1. Các phương pháp phá vỡ tế bào 15 1.5.2. Phương pháp gây biến tính chọn lọc 16 1.6. Phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme 17 1.6.1. Các nhóm phương pháp xác định khả năng xúc tác của E 17 1.6.2. Đơn vị hoạt độ 17 2. KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG CÔNG NGHỆ ENZYME 18 2.1. Ý nghĩa của kỹ thuật tinh sạch trong công nghệ enzyme 18 CÔNG NGHỆ ENZYME ii 2.2. Kỹ thuật cơ bản 19 2.2.1. Các phương pháp cơ học tách enzyme 19 2.2.2. Các phương pháp phá vỡ tế bào sinh vật 19 2.2.2.1. Phá vỡ tế bào bằng phương pháp cơ học: 20 2.2.2.2. Phá vỡ tế bào bằng phương pháp không phải cơ học: 20 2.2.2.3. Các phương pháp cô đặc 21 2.2.2.4. Các phương pháp tinh sạch enzyme 21 2.2.2.5. Tạo sản phẩm enzyme 21 3. ENZYME CỐ ĐỊNH 22 3.1. Chuyển hóa sinh học 22 3.1.1. Chuyển hóa vật chất do enzyme tự do hay enzyme hòa tan 22 3.1.2. Chuyển hóa vật chất bằng enzyme không hòa tan 22 3.1.3. Chuyển hóa vật chất do các quá trình lên men 23 3.1.4. Chuyển hóa vật chất do tế bào cố định 23 3.2. Đặc điểm của enzyme cố định 23 3.3. Phương pháp tạo enzyme cố định 23 3.3.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến enzyme cố định 23 3.3.2. Phương pháp cố định enzyme 25 3.3.2.1. Chất mang dùng để cố định enzyme 25 3.3.2.2. Phương pháp cố định enzyme 25 3.4. Ứng dụng của enzyme cố định 26 3.4.1. Sản xuất fructose nhờ enzyme glucose isomerase 27 3.4.2. Sản xuất L-amino acid nhờ enzyme aminoacylase cố định 28 4. THU NHẬN ENZYME 28 4.1. Chọn nguồn nguyên liệu 28 4.2. Thu nhận enzyme 31 5. ỨNG DỤNG CỦA ENZYME 32 5.1. Tình hình ứng dụng enzyme trong công nghiệp trên thế giới 32 5.2. Ứng dụng trong y học 34 5.3. Ứng dụng trong hóa học 34 5.4. Ứng dụng trong công nghiệp 34 5.4.1. Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm 34 5.4.2. Ứng dụng trong công nghiệp dệt 36 5.4.3. Ứng dụng trong công nghiệp thuộc da 36 5.5. Ứng dụng trong nông nghiệp 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 CÔNG NGHỆ ENZYME 1 1. MỞ ĐẦU 1.1. Lịch sử nghiên cứu và phát triển công nghệ enzyme Enzyme học là môn học nghiên cứu về vật chất phân tử có hoạt tính sinh học. Môn học này phát triển rất mạnh nhờ những thành tựu của môn hóa sinh học, vi sinh vật học, di truyền học và cả những tiến bộ của ngành hóa học và vật lý học. Bảng 1.1. Những cột mốc quan trọng trong nghiên cứu và phát triển môn enzyme học[2] STT Năm Nội dung nghiên cứu, phát triển 1 1833 Payen và Persoz tách được diastase từ malt 2 1874 Hansen là người đầu tiên tách được rennet từ bao tử cừu 3 1876 Kiihne là người đầu tiên đề nghị gọi chất xúc tác sinh học là enzyme 4 1897 Hai anh em nhà Buchner chứng minh dịch chiết từ nấm men có thể chuyển hóa đường glucose thành cồn và CO 2 5 1900 Rohm sử dụng enzyme protease trong công nghệ thuộc da 6 1913 Rohm là người đầu tiên sử dụng enzyme trong chất tẩy rửa 7 1917 Boidin và Effront nghiên cứu α-amylase của B.subtilis và ứng dụng trong ngành dệt 8 1920 – 1928 Will Slitter tinh sạch được enyzme 9 1926 Samner kết tinh được enyme urease Northrop kết tinh được protease 10 1928 Fleming phát hiện ra penicilline 11 Thế chiến II Bắt đầu sản xuất kháng sinh theo mô hình công nghiệp, sử dụng amyloglucosidase đường hóa tinh bột. Sử dụng penicillineacylase trong sản xuất penicilline 12 1969 Tanabec co đã xây dựng quy trình công nghiệp sản xuất amino acid. Sử dụng glucose isomerase trong sản xuất dịch đường giàu fructose CÔNG NGHỆ ENZYME 2 13 1972 Boyer et al. đưa ra kỹ thuật di truyền. Kỹ thuật này có tác động tích cực trong công nghệ enzyme 14 1973 Tanobe co sản xuất aspartic acid bằng lên men cố định tế bào Winter và Ferch đưa ra công nghệ sản xuất protein 15 1984 Nito xác lập quá trình cơ bản tạo acrylamide và một loại quá trình sản xuất có sự tham gia của enzyme 16 1984 - nay Đã phát hiện hàng trăm loại enzyme khác nhau, đưa vào sản xuất công nghiệp và ứng dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất và đời sống. kỹ thuật enzyme cố định, tế bào cố định đã đưa công nghệ enzyme đạt được nhiều kết quả cao Diastase: là enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân tinh bột thành maltose. Diastase là enzyme đầu tiên được phát hiện ra. Nó được chiết tách từ malt vào năm 1833 bởi Anselme Payen và Jean-Francois Persoz – nhà Hóa học tại nhà máy đường của Pháp. Tên “diastase” xuất phát từ tiếng Hy Lạp (diastasis), trong dịch nha nóng, các enzyme này thủy phân tinh bột trong hạt đại mạch thành các đường hòa tan và vì thế có thể tách phần bỏ malt với phần còn lại của hạt. Ngày nay, diastase là α, β hoặc γ-amylase. Rennet là enzyme được sản xuất trong dạ dày của động vật có vú khi còn trong giai đoạn bú sữa mẹ và thường được sử dụng để làm phomai. Rennet là một hỗn hợp enzyme, bao gồm: các enzyme thủy phân protein (protease) gây đông tụ sữa, có thể tách phần sữa đông (phần chất rắn) và phần huyết thanh sữa (phần chất lỏng). Những enzyme hoạt động trong dạ dày bê được gọi là chymosin hoặc rennin. Ngoài ra, cũng có những enzyme quan trọng khác như: pepsin và lipase. Protease: (còn gọi là peptidase hoặc proteinase) là enzyme thủy phân protein α αα α -amylase là enzyme thủy phân liên kết alpha của phân tử polysaccharide như tinh bột và glycogen thành glucose và maltose. Alpha amylase được tìm thấy chủ yếu ở người và động vật có vú khác, ngoài ra, chúng còn có mặt trong các loại hạt có chứa tinh bột và được tiết ra bởi một số loại nấm. Urease: là enzyme xúc tác phản ứng thủy phân ure thành carbon dioxide (CO 2 ) và amoniac (NH 3 ), hiện diện trong vi khuẩn đường ruột. Urease được tìm thấy trong vi khuẩn, nấm men và thực vật. 1.2. Khái niệm về enzyme Sinh vật được phân ra 2 nhóm dựa vào cấu tạo cơ thể của chúng: sinh vật đơn bào và sinh vật đa bào. Mặc dù chúng có sự khác biệt rất lớn về cấu tạo cơ thể và những đặc điểm sinh lý khác nhau nhưng chúng đều giống nhau về trao đổi chất với môi trường bên ngoài và một số đặc điểm về biến dị di truyền. Sinh vật được xem như là một hệ thống mở có liên quan chặt chẽ đến quá trình trao đổi chất của cơ thể ở trong tế bào và giữa tế bào với môi trường ngoài. Quá trình trao đổi chất bên trong tế bào và giữa tế bào với môi trường bên ngoài là biểu hiện sinh động nhất của sự sống. Sự khác nhau giữa tế bào sống và vật chất không phải sự sống chính là khả năng trao đổi chất này. Khi cơ thể không còn khả năng trao đổi chất thì cơ thể sẽ chết. Do đó mối quan hệ giữ cơ thể với bên ngoài là mối quan hệ hữu cơ. Quá trình trao đổi chất bao gồm quá trình dị hóa và quá trình đồng hóa. Quá trình dị hóa là quá trình phân giải vật chất để cung cấp cho tế bào năng lượng và vật liệu xây dựng tế bào, quá trình này có thể xảy ra trong tế bào hoặc ngoài tế bào. Quá trình di hóa xảy ra trong tế bào là quá trình cung cấp năng lượng, vật chất cho quá trình tổng hợp vật chất để tạo ra sinh khối nhằm làm đổi mới vật chất tế bào. Quá trình dị hóa ngoài tế bào phần lớn chỉ đáp ứng như cầu về vật chất, giúp cho tế bào tổng hợp các chất trong tế bào. Năng lượng tạo ra từ quá trình dị hóa ngoài tế bào thường được giải phóng ở dạng nhiệt năng. CÔNG NGHỆ ENZYME Quá trình tổng hợp vật chấ t cho t lượng từ các phản ứ ng do quá trình d của sinh vật đối với môi trườ ng xung quanh. Hình Sản phẩm của quá trình trao đổ i ch  Sản phẩm bậc 1  Sản phẩm bậc 2 Sản phẩm bậc 1: là các sản phẩ m đư Các sản phẩm này sẽ đượ c tham gia tr Sản phẩm bậc 2: là các sản phẩ m c bào. Trong quá trình tổng hợ p, m theo mà sẽ thoát ra khỏi tế bào. Hi sinh tổng hợp thừa có liên quan ch truyền, nhiều khi điều chỉnh hệ gen s chất được tạ o ra do quá trình phân gi (quá trình dị hóa ngoài tế bào). M dị hóa trong tế bào) Quá trình trao đổi chất liên tụ c đư chấ t trong thiên nhiên. Quá trình chuy nhiều chu trình chuyể n hóa các ch không chỉ ở trong tế bào sinh vậ t mà c này được xúc tác bởi một loạ i protein đ bào được gọi là enzyme ngoạ i bào. Các enzyme th nội bào và enzyne ngoại bào đề u đư 1.2.1. Bản chất sinh học củ a enzyme Nhiều nhà khoa học đã nghiên c ứ sinh vật sống tổng hợ p nên và tham gia vào cá Như vậy, bản chất sinh học củ a enzyme là s sinh hóa trong và ngoài tế bào sinh v  Enzyme được tạo ra trong t ế tạp và được điều khiển, kiể m soát r  Enzyme tham gia phản ứ ng c  Enzyme tham gia phản ứ ng trong đi enzyme được tổng hợ p và ho độ của cơ thể và của tế bào sinh v động trong khoảng 30 - 40 o C t cho t ế bào chỉ xảy ra trong tế bào. Quá trình này th ư ng do quá trình d ị hóa. Như vậy, quá trình trao đổi chất đượ c xem như h ng xung quanh. Hình 1.1. Hệ thống mở của tế bào sinh vật i ch ất tạo ra 2 dạng sản phẩm: m đư ợc tạo ra cả trong quá trình phân giải và cả trong quá trình t c tham gia tr ực tiếp nên vật chất tế bào và tham gia các các quá trình t m c ũng được tạo ra từ quá trình tổng hợp và quá trình phân gi p, m ột số vật chất được tạ o ra không tham gia vào quá trình trao bào. Hi ện tượng này được coi như quá trình sinh tổ ng h có liên quan ch ặt chẽ đến hệ di truyền có trong tế bào. Do đó, vi gen s ẽ thu được lượng lớn các sản phẩm sinh tổ ng h o ra do quá trình phân gi ải sẽ không tham gia vào quá trình trao đổ i ch bào). M ột số vật chất khác thoát ra khỏi tế bào vào môi trư c đư ợc xảy ra giữa trong và ngoài tế bào, tạo nên sự t trong thiên nhiên. Quá trình chuy ển hóa theo con đường sinh vật đóng vai tr ò r n hóa các ch ất có trong thiên nhiên. Các phản ứng sinh h ọ t mà c ả ở ngoài môi trường, bao quanh tế bào đó. Các ph i protein đ ặc biệt gọ i là enzyme. Các enzyme tham gia các ph i bào. Các enzyme th ực hiện trong tế bào gọ i là enzym u đư ợc tổng hợp trong tế bào. a enzyme ứ u về enzyme và đã đi đến thống nhất: enzyme là m p nên và tham gia vào cá c phản ứng sinh học a enzyme là s ản phẩm của các quá trình sinh họ c và th bào sinh v ật. Các loại enzyme đều có những đặ c tính chung như sau: ế bào sinh vật: quá trình tổng hợp enzyme là mộ t quá trình h m soát r ất chặt chẽ ng c ả trong tế bào sống và cả khi enzyme đượ c tách kh ng trong đi ều kiện nhiệt độ ôn hòa. V ì trong quá trình s p và ho ạt động trong điều kiện nhiệt độ của tế bào và nhi bào sinh v ật thường là nhiệt độ thấp. Phần lớn nhiệ t đ C 3 ư ờng phải thu nhận năng c xem như h ệ thống mở trong quá trình t ổng hợp. bào và tham gia các các quá trình t ế bào. quá trình phân gi ải của tế o ra không tham gia vào quá trình trao đổi chất tiếp ng h ợp thừa. Hiện tượng bào. Do đó, vi ệc điều chỉnh hệ di ng h ợp thừa. Môi số vật i ch ất nằm ở ngoài tế bào bào vào môi trư ờng (quá trình trình biến đổi liên tục của vật ò r ất quan trọng trong rất ọ c xảy ra thường xuyên bào đó. Các ph ản ứng sinh học i là enzyme. Các enzyme tham gia các ph ản ứng ngoài tế i là enzym e nội bào. Cả enzyme enzyme là m ột loại protein được c và th ực hiện các phản ứng c tính chung như sau: t quá trình h ết sức phức c tách kh ỏi tế bào sống ì trong quá trình s ống của tế bào, bào và nhi ệt độ của cơ thể. Nhiệt t đ ộ cơ thể sinh vật dao CÔNG NGHỆ ENZYME 4  Enzyme có thể tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài cơ thể từ giai đoạn đầu đến giai đoạn giải phóng hoàn toàn năng lượng dự trữ trong các hợp chất hóa học. Quá trình chuyển hóa này được thực hiện theo chuỗi phản ứng, mỗi phản ứng được xúc tác bởi một loại enzyme. Các enzyme này lần lượt thay thế nhau xúc tác để các phản ứng lần lượt xảy ra, để cuối cùng tạo thành CO2, H2O, một số chất khác và giải phóng năng lượng. Cũng có thể chuỗi phản ứng sẽ tạo thành chu kỳ chuyển hóa khép kín. Trong chuỗi chuyển hóa hở hay chuỗi chuyển hóa khép kín, sản phẩm của phản ứng trước sẽ là cơ chất cho phản ứng sau  Enzyme có thể thực hiện một phản ứng: Các phản ứng thường xảy ra ở ngoài tế bào (khi ta thực hiện chúng trong ống nghiệm). Trong tế bào thường không xảy ra phản ứng enzyme đơn (một phản ứng) mà thường xảy ra các phản ứng theo chuỗi phản ứng.  Phản ứng enzyme là những phản ứng tiêu hao năng lượng rất ít. Trong khi đó, các phản ứng hóa học được xúc tác vởi các chất xúc tác hóa học đòi hỏi năng lượng rất lớn. Nhờ có hoạt động xúc tác của enzyme, các phản ứng sinh hóa xảy ra liên tục trong điều kiện năng lượng ôn hòa.  Enzyme chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng. Gen quyết định tổng hợp ra một loại enzyme. Mỗi một enzyme quyết định một phản ứng sinh hóa. Các nhà khoa học đưa ra cơ chế sau: Một gen => một enzyme => một phản ứng Như vậy, gen quyết định bản chất sinh học và bản chất hóa học của enzyme. Cơ chế này có một ý nghĩa rất lớn trong việc điều khiển tổng hợp enzyme trong tế bào sinh vật. 1.2.2. Bản chất hóa học của enzyme Nếu tách enzyme ra khỏi tế bào và tiến hành phân tách thành phần hóa học của chúng, ta sẽ thấy chúng thuộc 2 nhóm: 1. Nhóm enzyme đơn cấu tử: Thuộc nhóm này bao gồm những enzyme chỉ được cấu tạo một thành phần hóa học duy nhất là protein. Những enzyme được tạo thành chỉ từ protein duy nhất được gọi là enzyme đơn cấu tử 2. Nhóm enzyme đa cấu tử Thuộc nhóm này bao gồm những enzyme có 2 thành phần:  Apoprotein hay apoenzyme: Phần protein thuần  Agon: Phần thứ 2 là thành phần không phải protein. Phần này thường là những chất hữu cơ đặc hiệu có vai trò thúc đẩy quá trình xúc tác. Ở những enzyme đa cấu tử, phần apoenzyme đóng vai trò xúc tác nhưng nếu thiếu thành phần thứ hai (các chất hữu có đặc hiệu) thì enzyme không thể hoạt động được. Chính vì thế, chất hữu cơ đặc hiệu này còn được gọi là chất cộng tác (cofactor). Các chất hữu cơ đặc hiệu này có thể gắn rất chặt với phần protein, cũng có thể gắn rất lỏng với phần protein. Ta có thể dễ dàng tách chúng ra khi tiến hành thẩm tích qua màng. Ở đây xảy ra 2 hiện tượng:  Những chất hữu cơ đặc hiệu gắn chặt với protein bằng liên kết đồng hóa trị được gọi là nhóm phụ (prosthetic)  Những chất hữu cơ đặc hiệu gắn không chặt với protein và dễ dàng tách chúng ra khỏi protein được gọi là coenzyme Tuy nhiên, sự phân biệt này chỉ mang tính chất tương đối. Ngoài ra các nhà khoa học cũng cho thấy, trong thành phần của những enzyme có sự hiện diện của một số kim loại. Các kim loại này thường là một trong những thành phần của chất hữu cơ đặc hiệu Ví dụ: trong hệ enzyme cytochrome, catalase, peroxydase, sắt (Fe) gắn chặt với nhân porphyrin. Các kim loại có trong thành phần của enzyme thường rất dễ tách ra khỏi enzyme. Trong trường hợp enzyme mất kim loại, chúng sẽ mất hoạt tính. Khi ta đưa các kim loại tương ứng vào các enzyme, hoạt tính enzyme lại được khôi phục. Tính chất này mang tính chất thuận nghịch. Vai trò của kim loại trong hoạt động của enzyme vẫn chưa được làm sáng tỏ. Tuy nhiên các nhà khoa học cũng cho rằng, có thể kim loại đóng vai trò liên kết giữa enzyme và cơ chất, liên kết giữa apoenzyme và coenzyme, tham gia trực tiếp vào quá trình vận chuyển điện tử như vai trò của sắt trong cytochrome và peroxydase. CÔNG NGHỆ ENZYME 5 Bảng 1.2. Một số enzyme có chứa kim loại [2] STT Enzyme Kim loại 1 Hệ cytochrome, catalase, peroxydase Sắt (Fe) 2 Polyphenoloxydase Đồng (Cu) 3 Carbonic anhydrase Kẽm (Zn) 4 Peptidase Mangan (Mn), Sắt (Fe), Magie (Mg) 5 Phosphatase Magie (Mg) 6 Arginase Mangan (Mn) 1.2.3. Cấu trúc của enzyme Enzyme là protein đặc biệt. Ngoài cấu trúc giống như cấu trúc bình thường của một protein, enzyme còn có cấu trúc rất đặc biệt liên quan đến hoạt động của enzyme. Không phải toàn bộ các phần của enzyme đều tham gia vào hoạt động xúc tác, mà chỉ có những bộ phận rất đặc biệt mang tính đặc hiệu trong phân tử protein mới tham gia xúc tác phản ứng. Bộ phận đặc hiệu này được gọi là trung tâm hoạt động của enzyme Trung tâm hoạt động của enzyme bao gồm:  Những nhóm hóa học, những liên kết peptide tiếp xúc trực tiếp với cơ chất.  Những nhóm hóa học, những liên kết peptide không tiếp xúc trực tiếp với cơ chất nhưng có chức năng trực tiếp trong quá trình xúc tác Phần còn lại đóng vai trò như một cái khung, giữ cho cấu trúc không gian thích hợp với khả năng xúc tác. Nếu bị tác động bởi các điều kiện bên ngoài như nhiệt độ, pH, nồng độ các chất, bộ khung này sẽ biến đổi cấu trúc không gian. Từ đó làm thay đổi sâu sắc hoạt tính enzyme. Phần của phân tử enzyme không có liên quan đến hoạt tính enzyme, nếu bị tác động, bị mất đi hoặc bị biến đổi sẽ hoàn toàn không ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme Trung tâm hoạt động của enzyme thường chứa các amino acid có nhóm hóa học hoạt động mạnh như amino acid serine, histidine, cysteine, lysine, arginine, glutamic acid, aspartic acid, tryptophan. Các nhóm hóa học này hoạt động có khả năng gắn với cơ chất để tạo thành phức chất enzyme - cơ chất. Những nhóm hóa học hoạt động mạnh bao gồm:  Nhóm NH 2 của lysine  Nhóm -SH của cysteine  Nhóm γ-carboxyl của glutamic acid Các gốc amino acid tạo ra trung tâm hoạt động của enzyme thường không nằm cạnh nhau trong chuỗi polypeptide thẳng (cấu trúc bậc 1). Trong thực tế, chuỗi popypeptide của enzyme tồn tại ở trạng thái không gian (cấu trúc bậc 3, bậc 4) nên các amino acid thường tồn tại gần nhau theo cấu trúc không gian. Do cấu trúc không gian như vậy, trung tâm hoạt động được tạo thành. Trong trung tâm hoạt động của enzyme người ta còn thấy có ion kim loại. Các ion kim loại có mặt trong trung tâm hoạt động của enyzme có vai trò xúc tác rất lớn. Ngoài các gốc amino acid, ion kim loại, các nhà khoa học còn cho thấy các nhóm chức của coenzyme cũng được coi như một phần cấu tạo của trung tâm hoạt động của enzyme. CÔNG NGHỆ ENZYME 6 Mỗi một enzyme thường có 1 trung tâm hoạt động. Tuy nhiên cũng có enzyme có 2 trung tâm hoạt động (alcohol hydrogenase của gan), thậm chí có enzyme có tới 4 trung tâm hoạt động (alcohol dehydrogenase của nấm men) Hoạt động xúc tác của trung tâm hoạt động có liên quan tới cơ chất. Các nhà khoa học khi nghiên cứu vấn đề này đã đưa ra 3 quan điểm quan trọng: 1. Chỉ những cơ chất có cấu trúc phân tử thích hợp với trung tâm hoạt động của enzyme mới có thể kết hợp được với trung tâm hoạt động của enzyme để tạo thành phức hợp enzyme-cơ chất. Theo quan điểm này, cơ chất có cấu trúc phân tử trùng với trung tâm hoạt động là hiện tượng kết hợp rất chặt chẽ và mang tính đặc hiệu cao. Chính vì thế, mỗi loại enzyme chỉ có thể tham gia xúc tác phản ứng cho một loại cơ chất nhất định. 2. Các loại enzyme thường tạo ra trung tâm hoạt động có cấu trúc không gian nhất định. Các trung tâm hoạt động thường được hình thành sẵn ở các enzyme. Chính những trung tâm hoạt động của enzyme quyết định cho phép những cơ chất cấu trúc tương ứng với trung tâm hoạt động mới được kết hợp vào. Quan điểm này do Fisher đề xướng. Thuyết của Fisher tuy đã giải thích được các hiện tượng gắn kết giữa cơ chất và trung tâm hoạt động của enzyme nhưng nhiều kết quả thực nghiệm, thuyết này chưa giải thích được trọn vẹn 3. Thuyết trung tâm hoạt động linh hoạt của Koshland được nhiều nhà khoa học chấp nhận hơn. Theo thuyết này, các nhóm chức của trung tâm hoạt động của enzyme tự do chưa có thể tham gia xúc tác ngay. Chính cơ chất là tác nhân tác động làm thay đổi cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động của enzyme. Chính tác động cảm ứng này của cơ chất làm cho các gốc amino acid, các nhóm chức của trung tâm hoạt động di chuyển, định hướng một cách thích hợp, chính xác để gắn cơ chất vào trung tâm hoạt động và thực hiện quá trình xúc tác. Như vây, Koshland cho rằng trung tâm hoạt động của enzyme chỉ được tạo thành khi có sự tác động cảm ứng của cơ chất. Chính cơ chế mềm dẻo này của trung tâm hoạt động đã giải thích được sự cạnh tranh giữa cơ chất và các chất không phải cơ chất nhưng lại có cấu trúc không gian giống cơ chất. Khi đó, các chất giống cơ chất chiếm chỗ trong trung tâm hoạt động của enzyme và phản ứng cơ chất không xảy ra. Hình 1.2. Mô hình của Fisher giải thích cơ chế tác động của enzyme với cơ chất [...]... Canh trường Lọc Kết tủa Tinh sạch enzyme 32 CÔNG NGHỆ ENZYME 5 ỨNG DỤNG CỦA ENZYME 5.1 Tình hình ứng dụng enzyme trong công nghiệp trên thế giới Từ khi phát hiện ra enzyme và khả năng chuyển hóa của enzyme, loài người đã tăng nhanh quá trình sản xuất và ứng dụng enzyme trong công nghiệp Số lượng enzyme phát hiện ngày càng nhiều và số lượng enzyme được ứng dụng vào công nghiệp cũng ngày càng nhiều Bảng... lượng enzyme cần thiết chuyển hóa một mg tinh bột hòa tan đến dextrin trong 30 phút ở điều kiện thí nghiệm; SKB – là lượng enzyme cần thiết để dextrin hóa 1g beta-dextrin giới hạn để kích thước xác định sau 1 giờ ở điều kiện thí nghiệm 2 KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG CÔNG NGHỆ ENZYME 2.1 Ý nghĩa của kỹ thuật tinh sạch trong công nghệ enzyme Công nghệ enzyme được bắt đầu từ giai đoạn sản xuất chế phẩm enzyme. .. thành và tách ra khỏi enzyme Cơ chế xúc tác tổng quát của enzyme: E+S Trong đó: E – enzyme (enzyme) ES S – Cơ chất (substrate) E+P P – Sản phẩm (products) 8 CÔNG NGHỆ ENZYME Hình 1.4 Cơ chế xúc tác của enzyme 1.3.2 Năng lượng xúc tác Enzyme tham gia hầu hết các phản ứng sinh hóa trong cơ thể sống Nhờ hoạt động xúc tác của enzyme, các tế bào có thể chuyển hóa lượng cơ chất rất lớn Enzyme sử dụng nguồn... trình thủy phân, các enzyme có trong tế bào không chỉ thủy phân các chất ở thành tế bào mà cả những chất có trong tế bào, thậm chí enzyme cũng bị phá hủy Phương pháp này hiện không được sử dụng nhiều trong công nghiệp CÔNG NGHỆ ENZYME 2.2.2.3 21 Các phương pháp cô đặc Dung dịch enzyme thô thường chứa lượng enzyme không nhiều Để xử lý mọt khối lớn dung dịch enzyme phải tốn ít nhiều công sức chi phí cho... Trong công nghiệp sản xuất enzyme người ta thường sử dụng ethanol và acetone để kết tủa enzyme Nhiệt độ kết tủa: 3 – 10oC, tỷ lệ và nồng độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme được xác định bằng thực nghiệm cho từng loại enzyme và từng nồng độ enzyme có trong dung dịch enzyme Kết tủa enzyme ở điểm đẳng điện: protein là chất lưỡng cực Mức độ hòa tan của enzyme phụ thuộc vào pH Kết tủa enzyme. .. phẩm enzyme thô sở di gọi là chế phẩm enzyme thô vì trong chế phẩm này ngoài enzyme còn có nước, protein không phải enzyme các thành phần của tế bào Như vậy việc làm sạch enzyme chính là việc loại các protein không phải là enzyme (đôi khi loại bỏ cả các protein – enzyme không mong muốn), nước, các thành phần khác của tế bào khỏi enzyme Công việc này hoàn toàn không dễ dàng Do đó, việc làm sạch enzyme. .. Mặt khác lượng enzyme có trong dịch enzyme thô quá ít, hoạt tính enzyme không cao Chính vì thế phải cô đặc dung dịch enzyme nhằm mục đích: Làm tăng hoạt tính của enzyme Làm giảm chi phí và công sức cho việc xử lý sau này Tăng khả năng bảo quản enzyme Giảm chi phí vận chuyển, bảo quản Tăng hiệu suất tác động của enzyme đối với cơ chất Để đạt được mục đích đó, người ta tiến hành cô đặc enzyme bằng phương... sau: CÔNG NGHỆ ENZYME 19 2.2 Kỹ thuật cơ bản 2.2.1 Các phương pháp cơ học tách enzyme Các phương pháp cơ học được ứng dụng nhiều để tách enzyme khỏi tế bào và các thành phần khác gồm 2 phương pháp: Phương pháp ly tâm: ly tâm là tách vật chất rắn ra khỏi dung dịch Trong công nghệ enzyme, phương pháp ly tâm thường được ứng dụng khá rộng rãi để thu nhận dung dịch enzyme, dung dịch này chứa các enzyme ngoại... 3.3.2.1 Phương pháp cố định enzyme Chất mang dùng để cố định enzyme Mục đích cuối cùng của việc cố định enzyme là gắn được enzyme vào một chất mang nào đó để ta có thể thực hiện phản ứng enzyme nhiều lần Công việc này cần thực hiện những bước sau: Chọn chất mang phù hợp với enzyme cần gắn vào nó Hoạt hóa chất mang cho khả năng gắn enzyme tốt hơn Tiến hành các kỹ thuật phù hợp để gắn enzyme vào chất mang Yêu... cũng thuộc lớp enzyme phức tạp Coenzyme của transpherase có bản chất hóa học rất khác nhau tùy theo vào bản chất của nhóm được chuyển vị Lớp transpherase bao gồm những enzyme tiêu biểu sau: A – acyltranspherase: enzyme này tham gia chuyển hóa nhóm acyl thông qua coenzyme A, tạo thành phức CoAS-acyl Khi đó, nhóm carboxyl của acid kết hợp với nhóm –SH của coenzyme A tạo thành liên CÔNG NGHỆ ENZYME 15 kết . gọ i là enzyme. Các enzyme tham gia các ph i bào. Các enzyme th ực hiện trong tế bào gọ i là enzym u đư ợc tổng hợp trong tế bào. a enzyme ứ u về enzyme và đã đi đến thống nhất: enzyme là. phân tử tiền enzyme hoặc các chấ t có tác d t đ ộng của enzyme Hình 1.11. Chất hoạt hóa enzyme a enzyme n kh ả năng xúc tác của enzyme đối với cơ chất nh ấ t đ ặc hiệu của enzyme cho thấy. củ a enzyme là s sinh hóa trong và ngoài tế bào sinh v  Enzyme được tạo ra trong t ế tạp và được điều khiển, kiể m soát r  Enzyme tham gia phản ứ ng c  Enzyme tham gia phản ứ ng trong đi enzyme