Tóm tắt bài giảng công nghệ protein enzyme (phần enzyme)

Lê Thị Trà My (Tami) ENZYME 1) Bản chất sinh học - Tạo tế bào sinh vật - Xúc tác phản ứng tách khỏi tế bào sống - Điều kiện phản ứng ôn hòa - Tỷ lệ chất phản ứng: chất xúc tác lớn - Tính đặc hiệu cao - Năng lượng tiêu hao cho phản ứng thấp 2) Bản chất hóa học • Thành phần cấu tạo Enzyme đơn giản(1 cấu tử, thành phần) o có cấu tạo giống pro o Thường enzyme thủy phân (hydrolase) Enzyme phức tạp(2 cấu tử, thành phần) Apoenzyme: protein Cofactor: ion KL, vitamin, nucleotic, focfirin… o Thường enzyme oxh khử o − Cofactor là: Cấu tạo:  Nhóm prostetic (nhóm ngoại): chứa vòng hem gắn chặt với phần apoenzyme có enzyme catalase, peroxydase  Coenzyme: phần k phải pro enz TH dễ tách khỏi phần apoenzyme tồn độc lập thường dẫn xuất loai vit tan nước lk yếu với protit  Các ion kim loại: ion Cu, Zn, Mo, Co, Ca, K, Na có metaloenzyme • Một số coenzyme quan trọng  Coenzyme vitamin dẫn xuất chúng Hợp chất Vitamin B1Tiamin pirophotphat (TPP), Vitamin B2 Coenezyme Vit dẫn xuất chúng Chức Tách nhóm đề carboxyl vận chuyển nhóm ceto Các coenzyme Flavin Tham gia trình hô hấp, vận chuyển hidro, vòng izoalloxazin nhận proton H+ 2e, coenzyme từ oxh khử FMN FAD Lê Thị Trà My (Tami) Vitamin B6 Pirydoxal photphat -Tham gia nhóm ngoại enzyme transaminase -V/c nhóm amin từ aaaa khác Vitamin PP Nicotin amit nucleotit (NAD, NADP) Tham gia q/t hô hấp, v/c enzyme Vòng nicotin amit NAD nhận proton H+ điện tử trở thành đường khử NADP Vitamin B3 Coenzyme A (coA, CoASH) -Xúc tác cho qtr acetyl hóa -Vị trí hđ: nhóm -SH Axit lipoic Anti-oxidant có chứa S, hđ pha béo nước Là cofactor pyruvate dehydrogenase complex Biotin (vitamin H) Là coenzyme enzyme vận chuyển CO2 Gắn với CO2 nhóm NH  Biotin cacboxylated  Các coenzyme nucleotit dẫn xuất Hợp chất Các adenin nucleotide Coenezyme vận chuyển nhóm P thành phần cấu tạo coenzyme: AMP, ADP, ATP Các nucleotit photphat khác: UTP, CTP, GTP Chức vận chuyển nhóm phosphatnhóm vận chuyển lượng Fe2+: Ferohem Các coenzyme pocfirin sắt (Các cytocrom quan trọng: a,b,c) Hem - Fe3+: Ferihem - - Hemoproteit hoạt tính xúc tác mioglobin, Hemoglobin Hemoproteit có tính xúc tác Peroxydase Catalase Hemoproteit nội bào: hệ thống cytocrom enzyme vận chuyển Lê Thị Trà My (Tami) điện tử biến đổi thuận nghịch hóa trị Fe hem Các cytocrom thường gắn màng ty thể, đến biết khoảng 20 cytocrom khác 3) Cấu trúc enzyme • Trung tâm hoạt động: TTHĐ phận nhỏ enzyme liên quan  hđ xúc tác Thành phần cấu tạo TTHĐ: tập hợp nhóm chức khác a.a hay ion KL nhóm chức coenzyme Cấu trúc: không gian xđ Các nhóm xa mạch polypeptide  cuộn lại mạch  gần không gian Nhóm chức TTHĐ gồm: Nhóm xúc tác: trực tiếp biến đổi chất - Nhóm tiếp xúc: định E với S vị trí Nhóm xt gần nhóm tx nhờ cấu trúc bậc 3,4 Enz cấu tử: Fe, Co, Mg  nhóm tx Nhóm hỗ trợ: cầu disunfua, lk H lk khác TTHĐ bền vững - TTHĐ enzyme 1cấu tử: tổ hợp nhóm định chức aa không tham gia tạo thành trục sợi polypeptide, gồm:  SH cystein,  OH serine,  NH2 lysine,  COOH acid glutamic, aspartic,  vòng imidazol histidin,  vòng indol tryptophan… enzyme cấu tử: cofactor nhóm định chức acid amin phần apoenz Trung tâm điều hòa dị lập thể Một số enzyme phân tử TTHĐ có chứa số vị trí khác tương tác với chất khác trung tâm dị lập thể (allosteric) chất kết hợp với trung tâm gọi chất điều hoà dị lập thể gồm:  Chất điều hoà (+): làm tăng hoạt độ  Chất điều hòa (-): làm giảm hoạt độ • - Lê Thị Trà My (Tami)  Chất điều hòa (↑↑)(homotropic):cơ chất thực chức chất điều hoà  Chất điều hòa (↑↓) (heterotropic): chất điều hòa có cấu trúc khác chất • Phức hợp multienzyme: gồm enzyme xúc tác cho dây chuyền phản ứng Nồng độ sản phẩm cuối đạt mức đủ cao kìm hãm hoạt động enzyme đầu tiên ngừng toàn hệ thống (do tương tác allostetic sản phẩm cuối kết hợp với trung tâm điều hoà enzyme làm cho enzyme không hoạt động) * Các phức hợp thường tham gia trình chuyển hóa thể − Quá trình khử cacbboxyl oxh acid pyruvic → acetyl coenzyme A − Quá trình tổng hợp acid béo ty thể loài nấm men, ĐV có vú, chim − Quá trình tổng hợp peptide có hoạt tính kháng sinh gramicidin, tirocidin − Quá trình tổng hợp tryptophan • - - - Các tiền chất enzyme (proenzyme, zymogen) Các protease tụy, dày protease trình đông máu chưa hoạt động dạng zymogen (pepsinogen, tripsinogen, chymotripsinogen, protrombin…) có chủ yếu ĐV có vú (thường enzyme thủy phân) cơ chế tự bảo vệ thể Các tiền enzyme tạo tuyến sinh học không qua giai đoạn tiền enzyme phá hủy cấu tạo tuyến →các tuyến bị tổn thương Cơ chế hoạt hóa zymogen: Dưới t/d enzyme hoạt hóa, zymogen bị cắt bớt số liên kết peptide → loại bỏ vài vài đoạn peptide có tác dụng kìm hãm TTHĐ, phần lại thay đổi cấu hình không gian  hình thành trung tâm hoạt động chuyển thành enzyme Cách hoạt hóa: tự xúc tác, enzyme protease Hiệu suất hoạt hóa phụ thuộc: nồng độ enzyme, chất enzyme,nhiệt độ, pH  Pepsinogen tiền enzyme pepsin, M=42 kDa Pepsin, thủy phân protein, M = 35 kDa  Trypsinogen  Chymotrypsinogen tạo tuyến tụy protease kiềm tính Trypsin chuỗi polypeptide có 249 aminoacid , trọng lượng phân tử 22680-23400 Da protease kiềm tính cấu tạo từ sợi polypeptide Lê Thị Trà My (Tami) + Sợi A: aa từ 1-13 + Sợi B: aa từ 16-146 + Sợi C: aa từ 149-245 • Vai trò nhóm chức phân tử enzyme *Các nhóm chức hoạt động theo chế: - Nhờ khả cho nhận proton: chúng hoạt động chất xúc tác acid hay base Có thể lk lk đồng hóa trị với chất tạo phức hợp ES để thực qt xúc tác a Nhóm imidazol His: His dễ t/d với glucid, phức chất His với hexose, pentose thường bền thông qua lk H b Nhóm hydoxyl Serine: Trong enzyme esterase, proteinase, phosphoglucomutase c Nhóm ε - amine lysine: nằm xa nhóm OH, phản ứng dễ dàng với nhóm aldehyde d Nhóm cacboxyl: tham gia vào việc bảo vệ trì cấu hình nguyên thủy enzyme, t/d tương hỗ ion với nhóm base, hình thành lk H, lk ester, lk amide e Nhóm sulfhydryl: tham gia nhiều biến đổi hóa học như: ion hóa, acyl hóa, phosphoryl hóa, oxy hóa, alkyl hóa, lk H phức hợp điện từ - - Tính đặc hiệu enzyme Đặc hiệu kiểu phản ứng: enzyme xúc tác cho kiểu phản ứng định Đặc hiệu chất: enzyme có kiểu lựa chọn chất để xúc tác chuyển hóa ĐH tuyệt đối: t/d lên chất định ĐH tương đối: t/d lên kiểu lk hóa học định phân tử chất, k phụ thuộc vào cấu tạo TP tham gia vào mối liên kết Ex: enzyme lipase thủy phân tất liên kết ester ĐH nhóm tuyệt đối tác dụng lên kiểu liên kết định với điều kiện hai phần tham gia tạo thành liên kết phải có cấu tạo định Ex: protease xúc tác thuỷ phân liên kết peptide gồm: +Exopeptidase: thủy phân lk đầu tận +Endopeptidase: thủy phân lk peptide bên + cacboxylpeptidase thuỷ phân lk gần nhóm cacboxyl tự ĐH quang học: đồng phân quang học D L, α β , cis trans… Ex: enzyme fumarahydratase tác dụng lên L-malic acid • Gọi tên phân loại enzyme theo hệ thống quốc tế Theo tên thông dụng : papain, Theo tên chất + ase: peptidase Tên chất ghép với tên kiểu phản ứng: pyruvate dehydrogenase • Lê Thị Trà My (Tami) VD : EC 3.1.1.3 (triacylglycerol lipase) -Lớp: thủy phân -Phân lớp: thủy phân lk ester -Nhóm: thủy phân lk ester cacboxylic -Số thứ tự: Enzyme thứ nhóm - Danh mục mã số nhóm enzyme phân nhóm chúng Lê Thị Trà My (Tami) a OXYREDUCTASE: oxi hóa khử Dehydrogenase: - Tách H trực tiếp từ chất - coenzyme: NAD+, NADP+, - vai trò sinh tổng hợp - Vd: alcohol dehydrogenase, chuyển rượu thành aldehyd CH3CH2OH + NAD+CH3CHO + H+ Oxidase: - Chuyển e- đến Oxi oxi có khả kết hợp với proton - Vd: Cytocrom C oxydase xúc tác ferrocytocrom C + O2 + 4H+  ferricytocrom C + H2O Oxygenase: - Xúc tác phản ứng kết hợp oxi vào hợp chất hữu - Gồm oxygenase (kết hợp O2) hydroxylase (kết hợp OH) Peroxydase: - Xúc tác oxi hóa chất hữu có H2O2 - Điển hình catalase, giải độc H2O2 cho thể - Vd: catalase H2O2 + H2O2  O2 + 2H2O b TRANSFERASE: Xúc tác chuyển gốc, nhóm từ chất sang chất khác Tùy - chất nhóm Acyl-transferase: chuyển nhóm acyl, quan trọng trao đổi chất Glucozyl-transferase: chuyển gốc đường Amino-transferase: chuyển amin từ acid amin sang á-ketoacid acid amin Phospho-transferase (kinase): chuyển gốc phosphat từ ATP đến –OH alcohol đường Lê Thị Trà My (Tami) c HYDROLASE: - - Xúc tác phản ứng thủy phân, có nước tham gia Không cần coenzyme Quan trọng trình tiêu hóa Lipase (esterase): thủy phân liên kết ester dầu mỡ Peptide hydrolase: thủy phân liên kết peptide Glycoside hydrolase: thủy phân glucoside tinh bột, cellulose d LYASE - Tách nhóm chức không cần nước - Ví dụ: pyruvat-decarboxylase, loại CO2 khỏi pyruvat Acetaldehyd (xảy trình lên men rượu) CH3COCOO-CH3CHO + CO2 e ISOMERASE Đồng phân hóa hình học, quang học, chuyển vị nội phân Ví dụ: Glucoisomerase chuyển glucose thành fructose f LIGASE Xúc tác tổng hợp chất hữu Ví dụ: • Pyruvat-carboxylase chuyển C đến acid pyruvic tạo thành oxaloacetic • Trong chu trình krebs quan trọng trao đổi chất • Cơ chế xúc tác enzyme Các loại liên kết ES E tác dụng lên S Lk ion (tương tác tĩnh điện): nhóm tích điện chất + nhóm tích điện trái dấu enz Lk hydro: H lk với A lk cộng hoá trị, đồng thời tạo lk yếu với B Liên kết H tạo thành khoảng cách A B khoảng 3Ao Tương tác kỵ nước: phần không phân cực E S kết lại với Tương tác Vandecvan: yếu đặc hiệu lk H ion, xảy có ăn khớp hình dạng S E Lk cộng hóa trị: lk thường nhóm nhân E tạo với nhóm điện tử S Nucleophiles: -OH, -SH, -S-, -NH2, =N-, Electrophiles: H+, >C=O, >C=NH, Fe2+, Cu+ Sự tạo thành phức hợp ES chế tác dụng: - Gồm gđ phản ứng: Giai đoạn hình thành phức ES Lê Thị Trà My (Tami) Giai đoạn hoạt hóa biến đổi chất Giai đoạn tạo thành sản phẩm P giải phóng E - Có giả thiết chế tác dụng enzym: chế khóa chìa chế cảm ứng *Theo quan điểm “ổ khoá chìa khóa” Fisher (thuyết tương ứng tĩnh): TTHĐ có cấu trúc không gian tương ứng với cấu trúc không gian S giống phù hợp ổ khoá chìa khoá * Theo quan điểm đại “khớp cảm ứng” Daniel E.Koshland (thuyết tương ứng động) cấu trúc không gian E mềm dẻo, linh động Khi E tiếp xúc S, nhóm chức TTHĐ E thay đổi vị trí không gian tạo thành hình thể khớp với S 4) Động học phản ứng enzyme – yếu tố ảnh hưởng • Phương trình động học Michaelis – Menten [ET] nồng độ enzyme tổng; [E] nồng độ enzyme tự Km gọi số Michaelis.Km nhỏ ái lực enzym chất cao ngược lại Từ pt động học xảy trường hợp: -Khi [S]>>Km : V=Vmax ◊ vận tốc phản ứng không phụ thuộc [S] -Khi [S] = Km : V=1/2 Vmax -Khi [S] 10000 Da  Các phương pháp tinh enzyme: - Thẩm tích:dùng màng bán thấm giữu pro Siêu lọc: dùng áp lực lọc dịch, chất hòa tan qua màng giữ lại đc pro [...]... chiết, thu nhận, tinh sạch enzyme Quy trình thu nhận enzyme • - - Các kỹ thuật cơ bản trong công nghệ enzyme  Phá vỡ tế bào: giải phóng enzyme Nghiền PP vật lý Đồng hóa áp lực cao Siêu âm Gồm Nhiệt PP hóa học Thẩm thấu bằng dung môi hữu cơ:acetone, chloroform, ether ethylic Thủy phân bằng kiềm: NaOH,Na2CO3 Lê Thị Trà My (Tami) PP sinh học tự phân (autolis): nấm men, tốn thgian Enzyme từ ngoài TB: vd protease,... Enzyme từ ngoài TB: vd protease, cellulose, glucanase, manase  PP phân ly Ly tâm Lọc  PP cô đặc enzyme: Mục đích: - Tăng nồng độ enzyme, tăng hoạt tính riêng enzyme - Giảm chi phí và công sức cho các công đoạn xử lý sau - Tăng khả năng bảo quản - Giảm chi phí vận chuyển và bảo quản - Tăng hiệu suất tác động enzyme đối với cơ chất PP nhiệt: thường dùng thiết bị cô đặc chân không lớp mỏng, bốc hơi li tâm... chỉ trở nên kích hoạt nếu nồng độ của AMP vòng (cAMP) cao Lê Thị Trà My (Tami) Các phương pháp nghiên cứu enzyme 5) Hoạt tính của enzyme/ Cách tính toán độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi enzyme khi thu nhận enzyme a) Đơn vị hoạt động Đơn vị quốc tế (UI): theo qui ước quốc tế được xác định bằng lượng enzyme cần thiết để chuyển hóa hoàn toàn 1 micromol cơ chất hoặc tạo ra 1 micromol sản phẩm sau 1’ trong... chỉ quá trình sinh tổng hợp các enzyme tương ứng Trong trường hợp này các sản phẩm mới được coi như là chất trấn áp (repressor) c Trường hợp cảm ứng: Một số gene chịu trách nhiệm sinh tổng hợp một số enzyme cảm ứng chịu tác động theo cơ chế cảm ứng cơ chế khác nhờ tác dụng của AMP vòng (cAMP) - AMP : kích thích quá trình sao chép mã của các operon phân giải, nhờ một protein trung gian sẽ hoạt hóa gene... trúc +Gen điều hòa regulator (R) mã hóa cho 1 protein đặc biệt được gọi là chất trấn áp (repressor), có vai trò đóng mở O b Trong trường hợp điều hòa sth enzyme theo cơ chế trấn áp: - Repressor (gene điều hoà tổng hợp) còn ở dạng không hoạt động (aporepessor) chưa có khả năng kết hợp với gene operator  sao chép các gene cấu trúc tiến hành bình thường Các enzyme được tổng hợp xúc tác cho các phản ứng... 1UI = 1micromol sản phẩm/ phút Đơn vị Katal (Kat): là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 mol cơ chất sau 1 giây ở đk chuẩn 1Kat = 1mol cơ chất/ giây 1UI = 1/60.10-6 Kat = 16,67 nKat (nanokatal) Đơn vị khác: như đơn vị Anson đối với protease, SKB với amylase… b) Hoạt tính riêng: là số đơn vị hoạt động UI (hay Kat) ứng với 1mg protein chế phẩm • - - - - Nguyên tắc: cho protease tác dụng... cơ chế cảm ứng cơ chế khác nhờ tác dụng của AMP vòng (cAMP) - AMP : kích thích quá trình sao chép mã của các operon phân giải, nhờ một protein trung gian sẽ hoạt hóa gene phân giải Khi AMP kết hợp với protein này tạo phức hợp có tác dụng hoạt hóa gen P làm cho ARN-polymerase dễ dàng kết hợp với nó để bắt đầu quá trình sao chép mã, như vật AMP có tác dụng tăng cường quá trình sao chép Vd: Hiệu ứng glucose... glycol, polythethyleamin 15-20% Kết tủa ở điểm đẳng điện PP siêu lọc: thường sử dụng acetate cellulose, polysulfone, polyvinylidene, polypropylene, với kích thước > 10000 Da  Các phương pháp tinh sạch enzyme: - Thẩm tích:dùng màng bán thấm giữu pro Siêu lọc: dùng áp lực lọc dịch, chất hòa tan qua màng giữ lại đc pro