Công nghệ Enzyme Protein

Công nghệ Enzyme Protein, phân loại enzyme, các loại enzyme đầy đủ chi tiết cho thi hết môn. Nhận làm thuê slide cực đẹp, chuyên nghiệp, giá cực rẻ và nhanh chóng tại Hà Nội: 0966.839.291. Công Ty Cổ Phần Công Nghệ Tài Nguyên Và Môi Trường. Nhận đào tạo về Powerpoint.

Cong Nghệ Enzymệ – Protệin C}u Chức Protein? Chức Hoạt động Loại protein Xúc tác Enzyme (lipase, protese, amylase….) Xúc tác p/ứ hóa sinh tiến triển theo hướng xđ với tốc độ cao bảo đảm mối liên hệ trình sống Kích thích Hormone (insullin, somatotropin,….) Giữ vai trò điều hòa TĐC thể Bảo vệ Kháng thể (IgG, IgA, IgM, IgD, IgE) Giữ c/năng bảo vệ thể loại globulin miễn dịch Vận chuyển Thể vận chuyển (hemorglobulin, myoglobulin) Vận chuyển khí oxy đến mô TB giúp cho tiến trình trao đổi khí, hô hấp mô bào, tải khí CO2 đến phổi đê thải Tiếp nhận vận chuyển hợp chất qua màng Vận động học Actin, myosin Bảo đảm cho co duỗi Mội giới Histamine, noradrenalin, serotomin Làm nhiệm vụ môi giới hệ thần kinh Cung cấp NL Protein hạt Có khả đảm bảo 10 - 15% nhu cầu NL thể, OXH gram pro gp’ 4,1 kCal Thành phần Membrane, vỏ virus Tham gia vào membrane, làm vỏ virus, ribosome Đông máu Prothrombim, fibrinogen, fibrin Tham gia vào trình làm đông máu 10 Điều hòa Allosteric, pro Kiểm soát trình biểu gen, phân chia, phát triển SKT | Câu Chức Protein? C}u Ph}n loại Protein? Gồm loại : pr đơn giản pr phức tap PR ĐƠN GIẢN: pr khiết, thành phần cấu tạo gồm đơn vị a.a - Dựa vào tính tan chia thành nhóm nhỏ: Albumin, globulin, prolamine, histon, albuminoid (1) Albumine: đơn giản, phổ biến thực vật, động vật (máu, trứng, sữa) - Hòa tan nước, đóng vón nhiệt độ, sa lắng dung dịch muối hòa tan - Albumine huyết nguồn vật chất bản, tham gia xây dựng tb, chúng đc tổng hợp từ gan (2) Globulin: Có nhiều huyết máu, lòng trắng trứng - Không tan nước, tan dung môi loãng acid mạnh hay base mạnh, đông vón nhiệt độ - Globulin huyết thanh: α, β, ɣ + α – globulin gồm: α1, α2 lipoprotein globulinprotein liên quan tới chuyển hóa lipit gluxit + β – globulin: gồm β1 , β2 loại pr đa dạng liên quan tới chuyển hóa Fe ,… + ɣ - globuline : tiểu phần có chức tạo miễn dịch đv Thú sơ sinh k có ɣ- globulin Xuất huyết sau 3-4 ngày bú sữa đc hấp thụ vào máu qua vách ruột non (3) Histon: Có mặt đv, tv, nhân tế bào kết hợp với acidnucleic Hòa tan nước acid nhẹ Không tan dd amoniac loãng Không bị vón nhiệt độ - Có tính kiềm cao tỉ lệ Arg Lys cao - Tách từ nhiễm sắc thể tế bào Eukaryota dạng histon: H1,H2A, H2B, H3, H4 (4) Prolamine: có phần nội nhũ chứa tinh bột hạt hòa thảo - Không tan nước dung dịch muối loãng, tan ethanol, isopropanol 70-80% (5) Albuminoid: Pr cứng - Không hòa tan dung dịch trung tính Chỉ hòa tan dung dịch acid loãng hay tính kiềm - nhóm quan trọng : collagen ( gân , dây chằng), keratin ( lông, tóc, móng) - Không bị tiêu hóa enzyme Có a.a đặc trưng hydroproline hydroxylysine PR PHỨC TẠP: pr mà thành phần chúng a.a bình thường có nhóm ngoại nguồn gốc khác vô hữu Dựa vào nhóm ngoại chia thành nhóm: (1) Nhóm photphoprotein (nhóm ngoại photphate): pr phức tạp mà nhóm ngoại acid phosphoric (H3PO4) Phosphoric acid liên kết với pr liên kết este qua nhóm – OH Ser Thr chuỗi polypeptit - Khả liên kết phân tử mà phân tử H3PO4 - Chức phosphoprotein : chất dinh dưỡng gia súc non: casein sữa, ovovitelin, vitin lòng đỏ trứng, ictulin trúng cá (2) Nhóm Glucoprotein: pr phức tạp mà nhóm ngoại glucid hexose dẫn xuất hexose hexosamine SKT | Câu Phân loại Protein? - Tên chung cho nhóm ngoại mucopolysaccharide - Có mặt mô bào cá trạng thái tự hyaluronic chondrotinsulfuric acid - Chức năng: hồ gắn mô với nhau, làm chất chống ma sát thể mucine mucoid - Mucine chất nhầy nước bọt, dịch niêm mạc, dịch vị, dịch âm đạo có tác dụng bảo vệ niêm mạc quan khỏi tác động giới mucine không bị pepsine tiêu hóa, bảo vệ đc niêm mạc dày khỏi bị peepsine phân hủy - Mucoid mô khác xương gọi osteomucoid trứng gọi ovomucoid (3) Nhóm lipoprotein (nhóm ngoại lipit): Đại diện : lecethine, cholecterol, phosphoric acid - Thành phần cấu tạo vách tế bào màng sinh học khác - Lớp vỏ lipoprotein định tính bán thấm tính hấp thụ đặc hiệu tế bào - Tính dẫn truyền điện tb thần kinh (4) Chromoprotein (nhóm ngoại màu sắc): Là pr nhóm ngoại có sắc đỏ (hemoglobin) sắc xanh chlorofin - Chức hô hấp trao đổi khí - Thường chứa ion kim loại : Fe, Cu, Mg, - Pr nối với nhóm ngoại dãy phụ tương đối lỏng lẻo - Hemoglobin ( Hb): + huyết sắc tố, có khối lượng phân tử 64,5kDal + phần pr Hb chiếm 94% trọng lượng, gồm chuỗi polypeptide: chuỗi α chuỗi β + màu sắc globin định + phần nhóm ngoại heme, 4% trọng lượng Hb Mỗi peptide mang nhân heme + nhân heme đc v/c ptu O2 + pt Hb v/c đc pt O2 + nhân heme giống loại máu (5) Nucleoprotein (nhóm ngoại nucleic acid): Là pr phức tạp phân bố nhân tb tv, đv, vsv, virus - Nucleoprotein có quan hệ trực tiếp đến trình bảo tồn truyền đạt thông tin di truyền, qtr tổng hợp pr, qtr trao đổi lượng, - Cấu tạo nhóm pr kiềm tính protamine, histon vài trường hợp albumin - Apoprotein : polypeptide hay pr có tính kiềm, chúng kết hợp với chặt + nucleoprotein tập chung nhân tb, riboxome + chất nhiễm sắc có đơn vị lặp lại nucleosome đoạn DNA kết - Nuclesome: bao gồm: đoạn DNA khoảng 160  240 cặp base quấn quanh lõi gồm cặp phân tử dạng phân tử H2A, H2N, H3, H4 Nuclosome có tinh dịch cá acid nucleic kết hợp với protamine Protamine polypeptide có khối lượng phân tử < 5000 dal, có tính liềm , chứa nhiều Arginin SKT | Câu Phân loại Protein? C}u Ph}n loại acid amin? C|c aa không thay thế?  Phân loại aa: Dựa vào đặc tính mạch bên chia làm nhóm Aa trung tính: gồm 5aa Glycin,Alanine,Valine,Leucine,và Isoleucine Aa chứa nhóm –OH: chứa nhóm –NH2, -COOH, mạch thẳng, chứa thêm nhóm –OH (Serine,Threoine) Aa chứa Sulphur: Cysteine Methionine Aa có nhóm đicacbosilic amid (Asp, Asn, Glu, Gln) Aa điamin:Argnine, Lysine Aa chứa nhân vòng: Phenyl alanine, Tyrosine, Tryptophan, Histidine, Proline  Acid amin không thay (aa cần thiết): có aa cần thiết Methionine (Met); Valnine (Val); Leucine (Leu); Iso leucine (Ile); Threonine (Thr); Phenyl alanine (Phe); Tryptophan (Trp); Lysine (Lys); Histidine (His) C}u Cấu trúc protein? Cấu trúc bậc một: Các axit amin nối với liên kết peptit hình thành nên chuỗi polypepetide Đầu mạch polypeptide nhóm amin axit amin thứ cuối mạch nhóm cacboxyl axit amin cuối Cấu trúc bậc protein thực chất trình tự xếp axit amin chuỗi polypeptide Cấu trúc bậc protein có vai trò tối quan trọng trình tự axit amin chuỗi polypeptide thể tương tác phần chuỗi polypeptide, từ tạo nên hình dạng lập thể protein định tính chất vai trò protein Sự sai lệch trình tự xếp axit amin dẫn đến biến đổi cấu trúc tính chất protein Cấu trúc bậc hai: Là xếp đặn chuỗi polypeptide không gian Chuỗi polypeptide thường không dạng thẳng mà xoắn lại tạo nên cấu trúc xoắn α cấu trúc nếp gấp β, cố định liên kết hyđro axit amin gần Các protein sợi keratin, Collagen (có lông, tóc, móng, sừng)gồm nhiều xoắn α, protein cầu có nhiều nếp gấp β Cấu trúc bậc ba: Các xoắn α phiến gấp nếp β cuộn lại với thành búi có hình dạng lập thể đặc trưng cho loại protein Cấu trúc không gian có vai trò định hoạt tính chức protein Cấu trúc lại đặc biệt phụ thuộc vào tính chất nhóm -R mạch polypeptide Chẳng hạn nhóm -R cystein có khả tạo cầu đisulfur (-S-S-), nhóm -R prolin cản trở việc hình thành xoắn, từ vị trí chúng xác định điểm gấp, hay nhóm -R ưa nước nằm phía phân tử, nhóm kị nước chui vào bên phân tử Các liên kết yếu liên kết hyđro hay điện hóa trị có nhóm -R có điện tích trái dấu Cấu trúc bậc bốn: Khi protein có nhiều chuỗi polypeptide phối hợp với tạo nên cấu trúc bậc bốn protein Các chuỗi polypeptide liên kết với nhờ liên kết yếu liên kết hyđro SKT | Câu Phân loại acid amin? Các aa không thay thế? C}u Kh|i niệm enzyme? - Enzyme pr có khả xúc tác cho phản ứng hóa học với mức độ đặc hiệu khác nhiệt độ tương đối thấp - Enzyme có tất tb sống, chất xúc tác sinh học - Enzyme có đầy đủ tính chất xúc tac, e có hiệu suất xúc tác lớn tất chất xúc tác vô hữu khác - E ko xúc tác cho phản ứng xẩy thể sống, mà sau tách khỏi hệ thống sống điều kiện định chúng giữ hoạt tính xúc tác  E phản ứng tồn tự nhiên hay tổng hợp có khả xúc tác cho hay nhiều phản ứng với mức độ đặc hiệu khác nhiệt độ áp suất bình thường C}u Dựa v{ đặc điểm để ph}n loại Enzyme? Mấy loại? Nhóm Oxidoreductase Tranferase Hydroxylase Lyase Isomerase Ligase Các phản ứng xúc tác OXH - khử Chuyển nhóm nguyên tử Thủy phân Bổ sung, loại nguyên tử vào khỏi liên kết đôi xếp lại nguyên tử tổng hợp phân tử sử dụng ATP Sắp xếp lại nguyên tử Tổng hợp phân tử sử dụng ATP SKT | Câu Khái niệm enzyme? C}u Mô hình hoạt động Enzyme? Hoạt động enzyme theo mô hình khóa chìa khóa - Một enzyme liên kết với chất vùng gọi trung tâm hoạt động - Chỉ có chất định vừa với trung tâm hoạt động giúp chất liên kết Phức enzyme - chất tạo thành - Cơ chất phản ứng tạo sản phẩm Sản phâm giải phóng: E + S  ES  E + P (E : enzyme – S : chất – P : sản phẩm ) Hoạt động enzyme theo mô hình điều chỉnh cảm sinh - Cấu trúc enzyme linh động không cứng nhắc - Enzyme trung tâm hoạt động điều chỉnh cấu dạng liên kết với chất - Tăng phổ đặc hiệu chất - Các thay đổi cấu dạng cải thiện xúc tác lúc phản ứng C}u C|c yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động Enzyme? Nhiệt độ: Hoạt tính thấp nhiệt độ thấp; tốc độ tăng lên với nhiệt độ; hoạt tính cao nhiệt độ tối ưu; hoạt tính biến tính nhiệt độ cao Nồng độ chất: tăng [cơ chất]  V pứ tăng tới mức ko đổi; hoạt tính tối ưu đạt đc tất E lk vs chất pH: Hoạt tính tối đa pH tối ưu; hoạt tính hầu hết pH thấp cao Ức chế: - Chất ức chế: Làm hoạt tính xúc tác, biến đổi cấu trúc E; cạnh tranh or ko cạnh tranh; số tác động đảo ngược đc VD: NaF3; DNSO; EDTA; DTT; SDS… - Ức chế cạnh tranh: Có cấu trúc tương tự chất; xâm chiến TTHĐ; cạnh tranh TTHĐ vs chất; có tác động đàn hồi tăng [cơ chất] - Ức chế ko cạnh tranh: Cấu trúc ko giống chất; lk vs E ko TTHĐ; chất ko vừa vào TTHĐ bị bđổi; ko có pứ xảy ra; tđ ko đàn hồi bsung chất C}u C|c lưu ý/biện ph|p giúp hạn chế tối đa giảm hoạt độ Enzyme? (1) Chọn dd chiết rút E thích hợp (2) Các bước tinh tiến hành nhiệt độ thấp (3) Bổ sung chất ức chế E proteolytic vào dịch chiết để hạn chế thủy phân đối vs E quan tâm (4) Bổ sung yếu tố làm mềm: CaCl2; MgCl2 (2-5mM); glycerol 10 – 20% (5) Xây dựng quy trình đơn giản, bước SKT | Câu Mô hình hoạt động Enzyme? C}u 10 Phương ph|p t|ch chiết v{ tinh Enzyme? (1) hu nhận chê ph m E thô: E ngoại bào từ vsv, từ dịch Đ, TV Ngoài phải thu nhận từ dịch chiết E từ ng.liệu phá v tế bào (lysozime, siêu âm, nghiền vs cát thủy tinh, sốc nhiệt ) (2) Cô đặc enzyme : Dịch chiết cô đặc nhiệt độ thấp để làm tăng nồng độ E Bổ sung tác nhân gây tủa protein để loại số chất không mong muốn Hòa tan E thể tích nhỏ dung dịch đệm thích hợp để tiến hành n/c (3) ách t ng phần tinh enzyme : sd sắc k trao đổi ion; sắc k lọc gel; ly tâm; sắc k lực; điện di biến tính gel polyacrylamide  c c ge sephade : + Cột sephadex G100 cột phân tách hỗn hợp theo ng.tắc lọc gel, chất có k.thước khác có thời gian qua hệ thống gel khác Gel cephadex G100 đc ngâm nước trc nhồi 24h + Cột đc cân vs đệm sodium phosphate 0,05M, pH 7,5 6h 10ml mẫu đc đưa lên cột rửa chiết đệm sodium photphate 0,05M, pH 7,5 thu phân đoạn, phâm đoạn 2ml  c c ge -Biogel P100: + Là cột phân tách hỗn hợp protein theo ng.tắc lọc gel Biogel P100 polyacrylamide phân tử chúng lk vs lk ngang tạo thành sàng phân tử hệ thống lỗ lưới xốp Dựa vào khác kích thước,phân tử lượng protein có hỗn hợp để phân tách + Cột có kích thước 2,6*60cm đc cân vs đệm 20mM phosphate pH 6,8 Điều kiện sắc k : Tốc độ dòng chảy 25ml/h ,thể tích phân đoạn 1,5ml  c t ao đ i ion: + Dựa sở phản ứn trao đổi anion protein hỗn hợp nhóm trao đổi ion chất giá Khi hỗn hợp pro qua cột,các pro mang điện tích âm gắn vào cột sau đc đẩy khỏi cột dd muối có chứa ion có lực mạnh đvs nhóm trao đổi ion chất giá + Có loại gel trao đổi ion: trao đổi anion trao đổi cation + Gel trao đổi ion đc tổng hợp cách gắn nhóm chức tích điện đương như: DEAE, QAE Hoặc tích điện âm như: CM, SP + Các nhựa trao đổi ion tái sd nhiều lần.Sau lần sd,hồi nguyên nhựa cách rửa vs NaOH (1N or 2N) , nước acid (HCl 1N or 2N) Sau nước + Một số ứng dụng:  o Loại muối: Nhiều dung dịch trc phân tích cần đc loại muối để khỏi cản trở đến giai đoạn o Phân tích a a: Moore Stoin ng thành công việc tách aa sắc k trao đổi ion cột dùng loại Dowex 50 Các aa đc phản ấp phụ dd đệm có pH tăng dần o Tách or tinh chế pro enzyme: thường dùng loại nhựa Cacboxylic loại xelluloza c i c: Dựa tương tác đặc hiệu sinh học để tạo gắn kếtđặc hiệu chất cần tách vs gel sắc k Trong sắc k lực , gắn gel vs chất có lực đặc hiệu vs enzyme or protein SKT | Câu 10 Phương pháp tách chiết tinh Enzyme? C}u 11 Hằng số tốc độ, vận tốc phản ứng, phương trình Michells - Menten?  Ở nhiệt độ không đổi, tốc độ phản ứng tỷ lệ thuận với tần số va chạm thành công phân tử phản ứng với Số phân tử có đủ lượng dẫn tới va chạm tỷ lệ thuận với nồng độ có mặt A  Tốc độ phản ứng : v = k.A k số tốc độ, A nồng độ chất; v tốc độ phản ứng  K số tỷ lệ thuận, tương đương với v/A = k k tốc độ đơn vị nồng độ Đơn vị số k là: mol.l-1 s-1  Phương trình Michells – Menten: V     Trong đó: v tốc độ phản ứng; Vmax tốc độ phản ứng nhận tất ptử E chuyển sang dạng chất (ES) điều sảy nhiệt độ cao; Km số Michells; S nồng độ chất   Có t ường hợp xảy :   - TH1: S > km v = Vmax Tốc độ phản ứng đạt cực đạt không phụ thuộc vào S Khi S tăng đến mức đó, tiếp tục tăng S v không tăng theo tốc phản ứng phụ thuộc vào tuyến tính vào nồng độ chất Xác định Km: C}u12 Tính chất chung Enzyme? (1) Tốc độ phản ứng cao: - Cacbornic anhydrase: C02 + H2 H2 C03 Hằng số tốc độ enzyme = 1,3.10-1 s-1 , số tốc độ có enzyme = 106 s-1 - Staphylococal nuclease: Hằng số tốc độ enzyme = 1,7.10-13 s-1 , số tốc độ có enzyme = 95 s-1 (2) Điều kiện phản ứng nhe nhàng: Xúc tác hóa học thường yêu cầu nhiệt độ áp suất cao PH thái pứ có E ko yêu cầu khất khe to hay pH (3) ính đặc hiệu cao: Enzyme tphân biệt chất đồng phân lập thể, đồng phân đối hình Các phản ứng thường đặc hiệu, sảy phản ứng phụ VD Trypsin xtác thủy phân liên kết peptide nhóm cacborxyl Lysin Arginine (4) Khả điều chỉnh lớn: - E pứ trước hợp chất allosteric mà thay đổi tính chất động học chúng - E điều tiết nhờ cải biến đồng hóa trị VD pứ phosphory hóa bị khử hoạt hóa hoạt hóa E Trạng thái chuyển hóa: Cần chất pứ đạt trạng thái lượng cao gọi trạng thái chuyển hóa Thời gian lưu có 10-3  10-14 s-1 Chỉ có số hữu hạn ptử có đủ lượng để đạt trạng thái chuyển hóa C}u 13 Ba trung t}m hoạt động Chymotrypsin? Đó Aps (102); His (57); Ser (195) SKT | Câu 11 Hằng số tốc độ, vận tốc phản ứng, phương trình Michells - Menten? C}u 14 Enzyme hạn chế v{ điểm cắt số enzyme? E hạn chế E có nguồn gốc từ VK có khả nhận biết trình tự DNA ngắn (4-6 nu) cấu trúc đối xứng bổ trợ cắt DNA trình tự nhận biết theo kiểu đối xứng bổ trợ tạo phân đoạn DNA có đầu so le C}u 15 Một số enzyme đc bổ sung v{o bột giặt v{ TĂCN? - Protease thủy phân Pro thành polypeptit - Lypase: thủy phân lipit - Amylase: thủy phân tinh bột thành dextrin glucose đơn giản - Celulase thủy phân celulose SKT | Câu 14 Enzyme hạn chế điểm cắt số enzyme? 16 Một số TB (VSV chủ) dùng để biểu protein? VK E coli: Ưu điểm Nhược điểm Số vector đặc hiệu nhiều Không cạnh tranh thiên nhiên Hiệu suất biến nập cao Hiệu suất thu hồi thấp Quy trình lên men hiểu kĩ Không gắn nhóm glycosyl vào rProtein Quá trình thu hồi tb phá tb đơn giản rProtein không thải tiết mtrường nuôi cấy Sacchasomyces cerevisiae: Ưu điểm Nhược điểm Năng suất biểu trung bình Hiệu suất biến nạp thấp,trung bình rProtein gắn nhóm Glycosyl Hệ vector có giới hạn rProtein thải tiết nuôi cấy rGene phải bền đưa vào Quy trình lên men hiểu thấu đáo Thu hồi phá tb đơn giản Pichia pastoris Kluveromyces sp : Ưu điểm Nhược điểm Hiệu suất biểu tế bào Hiệu suất biến nạp thấp-tbình rProtein gắn nhóm glycosyl Lên men khó khăn rProtein tiết mtrường nuôi cấy Hệ thống vector bị giới hạn rGene cần phải bền đưa vào Thu hồi tb đơn giản Sử dụng codon bất thường VK Bacillus: Ưu điểm Nhược điểm Năng suất biểu cao Hệ thống vecto có giới hạn Lên men đơn giản Hệ thống vecto tối ưu giữ độc quyền rProtein thải tiết mtrường nuôi cấy Không gắn nhóm Glycosyl Thu hồi tb đơn giản Hiệu suất biến nạp thay đổi Cạnh tranh tự nhiên SKT | 16 Một số TB (VSV chủ) dùng để biểu protein? 10