Tinh sạch protein tái tổ hợp SEB 534 dạng đột biến

Tinh sạch protein tái tổ hợp SEB534 dạng đột biến phục vụ cho nghiên cứu chế tạo que thử phát hiện nhanh độc tố của vi khuẩn tụ cầu. Nhận làm thuê slide cực đẹp, chuyên nghiệp, giá cực rẻ và nhanh chóng tại Hà Nội: 0966.839.291. Công Ty Cổ Phần Công Nghệ Tài Nguyên Và Môi Trường. Nhận đào tạo về Office và Powerpoint.

GVHD: PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh CÁC CHỮ VIẾT TẮT APS Ammonium persulfate Bp Base pair DBB Denaturing Binding Buffer DEB Denaturing Elution Buffer DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxynucleotide Triphosphates EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid Epp Eppendorf IPTG Isopropylβ-D-1thiogalactopyranoside LB Luria and Bertani MHC II Major histocompatibility complex II PBS Phosphate buffer saline PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic Acid S aureus Staphylococcus aureus SDS Sodium dodecyl sulfate SEB Staphylococcal enterotoxin B TEMED N,N,N’,N’tetramethylethylenediamine v/p Vòng/phút Báo cáo thực tập GVHD: PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH Báo cáo thực tập GVHD: PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh MỤC LỤC Báo cáo thực tập Trường đại học Thành Tây GVHD: PGS.TS.NGHIÊM NGỌC MINH MỞ ĐẦU Thực phẩm bị nhiễm vi khuẩn, độc tố vi khuẩn thức ăn chứa chất có tính độc hại người ăn nguyên nhân gây bệnh phổ biến toàn cầu Trong vụ ngộ độc thực phẩm vi khuẩn tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc Người bị ngộ độc thực phẩm ăn, uống phải độc tố ruột tụ cầu, tiếp xúc trực tiếp với tụ cầu qua vết thương hở tụ cầu vốn cư trú đường ruột chiếm ưu số lượng Độc tố ruột Staphylococcal enterotoxin B (SEB) bền với nhiệt tác nhân thường gặp vụ ngộ độc thực phẩm S aureus gây nên Hiện nay, việc phòng điều trị bệnh ngộ độc thực phẩm tụ cầu gặp nhiều khó khăn không phát kịp thời tác nhân gây bệnh Chính vậy, việc xác định có mặt SEB mẫu bệnh phẩm thực phẩm vấn đề thật cần thiết Trên giới Việt Nam phát triển loại kít phát nhanh tác nhân gây bệnh dựa nguyên tắc liên kết miễn dịch, phương pháp đòi hỏi cần có kháng thể đặc hiệu Do việc tinh kháng nguyên SEB tái tổ hợp độc tính, có khả gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể IgG đặc hiệu cấp thiết Để phục vụ cho nghiên cứu chế tạo que thử phát nhanh độc tố vi khuẩn tụ cầu, tiến hành: “Tinh protein tái tổ hợp SEB534 dạng đột biến” Sinh viên: Đỗ Thị Xuân Báo cáo thực tập Trường đại học Thành Tây GVHD: PGS.TS.NGHIÊM NGỌC MINH CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Tình hình ngộ độc thực phẩm Staphylococcus aureus độc tố ruột Staphylococcal enterotoxin B Việt Nam giới Tuy thời gian gây bệnh ngắn vụ ngộ độc thực phẩm tụ cầu để lại hậu không nhỏ Theo đánh giá tổ chức Y tế giới, hàng năm Việt Nam có khoảng triệu ca ngộ độc thực phẩm, gây tổn hại 200 triệu USD Trong năm gần số vụ ngộ độc thực phẩm nước ta ngày gia tăng Theo số liệu thống kê chưa đầy đủ Cục An toàn vệ sinh Thực phẩm từ đầu tháng 4/2012, nước xảy 10 vụ ngộ độc thực phẩm làm 972 người mắc, có 726 người phải nhập viện có trường hợp tử vong Phần lớn vụ ngộ độc thực phẩm nhiễm vi sinh vật Điển vụ ngộ độc tập thể xảy đám cưới ngày 12/4/2012 Hùn, xã Chiêng Cọ, thành phố Sơn La thực phẩm nhiễm vi khuẩn Staphylococcus areus làm 300 người mắc phải nhập viện cấp cứu Một vụ ngộ độc tập thể khác xảy ngày 16/4/2012 khiến 200 công nhân Công ty DreamMeKong thuộc xã An Cư, huyện Cái Bè, tỉnh Tiên Giang bị ngộ độc [ 8] Theo báo cáo Cục An toàn Thực phẩm, năm 2014 (tính đến ngày 15/12), toàn quốc ghi nhận 189 vụ ngộ độc thực phẩm với 5.100 người mắc, 4.100 người viện 43 trường hợp tử vong Nếu so với năm 2013, số người mắc viện ngộ độc thực phẩm năm 2014 có giảm số vụ tăng 13%, đặc biệt số người tử vong tăng gần 54% (tăng thêm 15 người) [9] Ngộ độc thực phẩm không xảy nước ta mà xảy nhiều nước giới kể nước phát triển Ở Mỹ, năm có khoảng 76 triệu ca ngộ độc thực phẩm với 325.000 người phải vào viện 5.000 người chết Trung bình 1.000 dân có 175 người bị ngộ độc thực phẩm năm chi phí cho ca ngộ độc thực phẩm 1.531 đôla Mỹ (US - FDA 2006) Nước Úc có Luật thực phẩm từ năm 1908 năm có khoảng 4,2 triệu ca bị ngộ độc thực phẩm bệnh truyền qua thực phẩm, trung bình ngày có 11.500 ca mắc bệnh cấp tính Sinh viên: Đỗ Thị Xuân Báo cáo thực tập Trường đại học Thành Tây GVHD: PGS.TS.NGHIÊM NGỌC MINH ăn uống gây chi phí cho ca ngộ độc thực phẩm 1.679 đôla Úc Ở Anh 1.000 dân có 190 ca bị ngộ độc thực phẩm năm chi phí cho ca ngộ độc thực phẩm 789 bảng Anh Tại Nhật Bản, vụ ngộ độc thực phẩm sữa tươi giảm béo bị ô nhiễm tụ cầu vàng tháng 7/2000 làm cho 14.000 người tỉnh bị ngộ độc thực phẩm Công ty sữa SNOW BRAND phải bồi thường cho 4.000 nạn nhân người ngày 20.000 yên.Tại Hàn Quốc, tháng năm 2006 có 3.000 học sinh 36 trường học bị ngộ độc thực phẩm [ 10] Đầu năm 2015, quan Kiểm tra an toàn thực phẩm Nông nghiệp Mỹ công bố công ty Murr Lebanon, PA bị thu hồi khoảng 31,689 sản phẩm gà tẩm bột gluten-free bị nhiễm nội độc tố khuẩn tụ cầu.[11] Ngộ độc thực phẩm độc tố Staphylococcus aureus bệnh phổ biến có tỷ lệ nhiễm cao Việt Nam toàn giới Trên thực tế, bệnh làm nhiều thời gian suất nhân viên tốn kinh phí cho điều trị bệnh viện Hơn thế, bệnh gây thiệt hại đáng kể kinh tế ngành công nghiệp thực phẩm, công ty cung cấp thực phẩm nhà hàng Do đó, việc kiểm soát ngộ độc thực phẩm độc tố S aureus đóng vai trò quan trọng vấn đề sức khỏe người, kinh tế xã hội 1.2 Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus độc tố ruột Staphylococcal enterotoxin B 1.2.1 Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus Vi khuẩn tụ cầu vàng thuộc giới Eubacteria, ngành Firmicutes, lớp Cocci, Bacillales, họ Staphylococcaceae, chi Staphylococcus, loài Staphylococcus aureus Dựa vào phương diện gây bệnh, người ta chia tụ cầu khuẩn thành hai nhóm chính: tụ cầu có men coagulase tụ cầu men coagulase Nhờ có men coagulase mà môi trường nuôi cấy có máu, vi khuẩn tạo nên khuẩn lạc màu vàng Do vi khuẩn gọi tụ cầu vàng Tụ cầu (“Staphylococcus” bắt nguồn từ tiếng Hy lạp, với “staphyle” có nghĩa chùm nho) vi khuẩn gram dương, có hình cầu, đường kính khoảng 0,8-1 µm, Sinh viên: Đỗ Thị Xuân Báo cáo thực tập Trường đại học Thành Tây GVHD: PGS.TS.NGHIÊM NGỌC MINH đứng riêng lẻ, đôi, chuỗi ngắn, chùm không giống chùm nho (hình 1.1) Hình 1.1: Hình ảnh tụ cầu vàng Staphylococcus aureus () Đây loại vi khuẩn không di động, lông, cầu khuẩn Staphylococcus aureus (S aureus) khả tạo bào tử vi khuẩn Chlamydomonas perfringens, Chlamydomonas botulinum Bacillus cereus thường tìm thấy thực phẩm nhiễm khuẩn, thường vỏ [6] Dựa theo nghiên cứu báo cáo khoa học: Tụ cầu S aureus sản sinh 11 độc tố bao gồm độc tố ruột (enterrotoxin) – có SEB nhóm độc tố liệt kê danh mục vũ khí sinh học dùng để công khủng bố sinh học chiến tranh sinh học…và 20 độc tố ruột (từ SEA đến SEE, từ SEG đến SER SEU) [1, 4] 1.2.2 Độc tố ruột Staphylococcal enterotoxin B Staphylococcal enterotoxin B (SEB) độc tố ruột sản sinh Staphylococcus aureus Nó độc tố gây nên ngộ độc thực phẩm tụ cầu người sản xuất số quốc gia vũ khí sinh học Khi bị lây nhiễm vào thể, SEB tác động chủ yếu lên hệ thống vận chuyển ion nước ruột, gọi enterotoxin (độc tố ruột) SEB hợp chất tương đối bền vững môi trường thực phẩm, dễ dàng hòa tan nước, chịu biến động nhiệt độ chịu Sinh viên: Đỗ Thị Xuân Báo cáo thực tập Trường đại học Thành Tây GVHD: PGS.TS.NGHIÊM NGỌC MINH sôi 100oC vài phút Khuẩn tụ cầu enterotoxin B nhà khoa học nghiên cứu chi tiết SEB lọc đồng bao gồm 239 axit amin chuỗi polypeptide đơn với trọng lượng phân tử 28336 kDa, SEB có tương đồng cao với SEC1, bao gồm 239 axit amin [7] Giống cấu trúc protein ngoại bào khác S aureus thường tìm thấy môi trường nuôi cấy hay thực phẩm bị ô nhiễm, protein SEB bao gồm trình tự tín hiệu (signal peptide) gồm 27 axit amin đầu N’ Đoạn trình tự tín hiệu có chức “dẫn” SEB tiết môi trường nuôi cấy, sau trình tự bị cắt protease vị trí định Ở dạng hoạt động protein SEB có cấu trúc gồm: cấu trúc xoắn α, 14 phiến gấp nếp β cầu nối disulphit nối cystein vị trí 120 140 Đoạn gen seb phân lập từ chủng S aureus nhiều vùng địa lý khác nhiều tác giả giới nghiên cứu chi tiết Trong nghiên cứu này, chọn nhân đoạn gen seb có chiều dài 534 bp thay đoạn gen seb có kích thước 720 bp tác giả Korolev, Savransky nhiều tác giả giới công bố đoạn gen seb dài (720 bp) sau tạo kháng thể đơn dòng gặp khó khăn việc gắn lên que thử giai đoạn sau này, đoạn gen seb (534 bp) lựa chọn tối ưu nhất, thỏa mãn hai điều kiện giữ nguyên vị trí epitop (tức đảm bảo phản ứng đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể, cấu hình không gian) thuận lợi việc tạo kháng thể đơn dòng gắn lên que thử SEB thiếu vị trí bám kẽm so với siêu kháng nguyên Staphylococcal enterotoxin A, C2 D có vị trí bám phân tử MHC nhóm II Phân tích chi tiết vị trí bám TCR kháng nguyên SEA, SEB SEC2 khác biệt dẫn tới hiệu bám lên vùng Vβ Protein SEB có cấu trúc nhỏ gọn tạo khả đề kháng tốt với protease ruột bao gồm trypsin, chymotrypsin, papain (hình 1.2) [3] Sinh viên: Đỗ Thị Xuân Báo cáo thực tập Trường đại học Thành Tây GVHD: PGS.TS.NGHIÊM NGỌC MINH Hình 1.2: Cấu trúc tinh thể protein SEB Nguồn: [http://www.pdb.prg/pdb/explore.do?structureId=3SEB.] Staphylococcal enterotoxin B (SEB) kích thích miễn dịch thể vật chủ tạo lượng lớn interleukin I II SEB xem siêu kháng nguyên vi khuẩn tạo thành cầu nối MHC lớp II tế bào trình diện kháng nguyên vùng Vβ thụ thể tế bào T như: CD4, CD7 Từ kích thích hoạt hóa tế bào T biểu đoạn gen Vβ mà không cần thiết phải có trình chế biến trình diện thông thường Các siêu kháng nguyên có khả kích hoạt tế bào Lympho T lớn nhiều lần so với kháng nguyên thông thường Kết trình tương tác sản sinh số lượng lớn cytokine interleukin (IL-2), yếu tố hoại tử khối u beta (TNF-beta) interferon Nếu ăn thực phẩm có SEB bệnh nhân có triệu trứng như: chán ăn, buồn nôn, tiêu chảy…Các triệu trứng xuất cytokine tế bào T lông ruột sinh ạt 1.3 Các phương pháp tinh protein tái tổ hợp Trong dịch chiết thô thu protein quan tâm có protein tạp, chất cao phân tử khác polysaccharid, acid nucleic chất phân tử nhỏ đường monose, chất lipid, muối khoáng…Để loại bỏ chúng phải sử dụng phối hợp nhiều biện pháp khác Sinh viên: Đỗ Thị Xuân Báo cáo thực tập Trường đại học Thành Tây GVHD: PGS.TS.NGHIÊM NGỌC MINH Dựa vào tính chất protein tính phân ly đẳng điện, tính chất bề mặt (protein hấp thụ, hấp phụ chất mang khác nhờ protein phân tách nhờ sắc ký lực), kích thước phân tử Thông thường sử dụng kỹ thuật để tinh protein kĩ thuật lọc kĩ thuật sắc kí [2] 1.3.1 Kỹ thuật lọc Protein cao phân tử, phương pháp phân tách protein sử dụng màng lọc phân tử hữu hiệu Tuy nhiên phương pháp sử dụng nguồn protein động vật dung dịch sinh lý sữa, máu, huyết mà không áp dụng với protein thực vật chúng thường nằm phức hợp polyme khác Kỹ thuật thực nhờ màng bán thấm màng lọc phân tử Dung dịch protein phân làm pha, pha không qua màng lọc chứa cao phân tử có protein, pha lại qua màng lọc chứa phân tử có kích thước nhỏ glucid đơn giản, peptid, muối 1.3.2 Kỹ thuật sắc ký Sắc ký phương pháp phân tách quan trọng sinh học phân tử thích hợp với nhiều loại hợp chất sản phẩm tinh sử dụng cho việc định lượng định danh.Trong tinh protein, có bốn phương pháp ứng dụng nhiều sắc ký lọc gel dựa vào kích thước phân tử (size exclusion chromagraphy), sắc ký trao đổi ion dựa vào điện tích phân tử (ion exchange chromagraphy), sắc ký lực dựa vào lực phân tử với loại phân tử khác (affinity chromagraphy) sắc ký lỏng cao áp dựa vào kích thước phân tử có độ phân giải cao nhờ vào áp suất (high pressure liquid chromagraphy) - Sắc ký lọc gel: Phương pháp tốt phương pháp dựa vào kích thước phân tử Mẫu nạp vào đầu cột chứa nhiều hạt có lỗ làm từ polymer không tan có tính hydrate hóa cao dextran, agarose (những dạng cabohydrate) hay polyacrylamide, Sephadex, Sepharose, Bio-gel loại gel phổ biến thị trường có sẵn hạt có lỗ với đường kính chuẩn 100µm (0.1mm) Những phân tử nhỏ bên lẫn hạt, phân tử lớn bên hạt Vì vậy, phân tử có kích Sinh viên: Đỗ Thị Xuân 10 Báo cáo thực tập Trường đại học Thành Tây GVHD: PGS.TS.NGHIÊM NGỌC MINH thước lớn cột chảy nhanh trước Phân tử có kích thước trung bình, vào bên hạt rời khỏi cột vị trí giữa; phân tử nhỏ phải qua đoạn đường dài hơn, quanh co nên sau - Sắc ký trao đổi ion: Tại điểm pH trừ điểm đẳng điện, protein có mang điện tích tương ứng với điểm pH Dựa vào điện tích thực chúng điểm pH định, ta phân tách hỗn hợp protein Phương pháp gọi phương pháp sắc ký trao đổi ion Trong phương pháp này, pha tĩnh hạt mang sẵn điện tích định, hạt tương tác với phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng Cụ thể, hạt mang điện âm (như cột carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose), tiến trình gọi sắc ký trao đổi ion dương, tương tác với phân tử mang điện tích dương Ngược lại, hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAE-cellulose), gọi sắc ký trao đổi ion âm, tương tác với phân tử mang điện tích âm Vì thế, protein dấu với cột chạy khỏi cột protein trái dấu bị giữ lại cột Để phóng thích protein này, ta tăng nồng độ ion pha động, ion phân tử protein tương tác với hạt mang điện tích Ví dụ, sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối khác dung dịch tách giải ion natri tranh bám vào cột với protein có điện tích dương, đó, protein mang điện tích dương phóng thích cột theo độ lớn điện tích - Sắc ký lỏng cao áp: Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp dạng mở rộng kỹ thuật sắc ký cột có khả phân tách protein cải thiện đáng kể Bản thân vật liệu tạo cột vốn có phân chia rõ ràng có nhiều vị trí tương tác dẫn đến khả phân tách tăng lên đáng kể Bởi cột làm từ vật liệu mịn nên phải có áp lực tác động lên cột để có tốc độ chảy thích hợp Kết thực có phân giải cao phân tách nhanh - Sắc ký lực: Đây phương pháp hiệu ứng dụng rộng rãi việc tinh protein Kỹ thuật dựa lực cao nhiều protein với nhóm hóa học chuyên biệt Ví dụ, concanavalin A, loại protein thực vật, Sinh viên: Đỗ Thị Xuân 11 Báo cáo thực tập Trường đại học Thành Tây GVHD: PGS.TS.NGHIÊM NGỌC MINH tinh cho qua cột mang phân tử glucose liên kết cộng hóa trị Concanavalin A gắn vào cột có lực cao với glucose, protein khác không Concanavalin A tách giải khỏi cột ta cho thêm dung dịch glucose đậm đặc vào Phân tử đường dung dịch gắn với Concanavalin A thay phân tử glucose nối với cột Sắc ký lực công cụ hữu hiệu việc tách yếu tố phiên mã, protein điều hòa biểu gen thông qua việc gắn đặc hiệu với trình tự DNA Hỗn hợp protein thấm qua cột có chứa trình tự DNA đặc hiệu gắn vào thể mang; protein có lực cao với trình tự DNA bắt vào trình tự giữ lại Trong thí dụ này, yếu tố phiên mã phóng thích rửa cột với dung dịch có hàm lượng muối cao Ngoài ra, người ta dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên kháng thể để tinh kháng nguyên hay kháng thể Nhìn chung, sắc ký lực dùng để tách protein vốn có khả nhận biết nhóm X nối cộng hóa với nhóm hay chất dẫn xuất gắn cột, sau nạp hỗn hợp protein vào cột, cột rửa lại để loại bỏ protein không tạo nối, cuối tách giải protein mục tiêu dung dịch X với nồng độ cao hay thay đổi điều kiện để làm giảm lực liên kết Sắc ký lực phương pháp tinh hiệu tương tác protein phân tử dùng mồi bắt protein có độ chuyên biệt cao Mà dịch chiết thô thu sau cảm ứng biểu có IPTG, protein lẫn nhiều tạp chất, cần tinh để thu protein mong muốn làm kháng nguyên phục vụ cho việc tạo kháng thể đơn dòng để chế tạo qua nhúng phát nhanh độc tố SEB môi trường thực phẩm Protein tái tổ hợp gen SEB mã hoá có đuôi His - tag với axit amin histidine liên tục Phương pháp tinh cột HisTrap dựa vào liên kết lực ion niken (Ni 2+) với vòng imidazol histidin.Khi axit amin histidin gần liên kết chúng với ion niken mạnh Trên sở đó, protein tái tổ hợp gen seb mã hóa liên kết đặc hiệu với ion niken Các phân tử protein tế bào tổng hợp đuôi His - tag không gắn với ion niken Protein tái tổ hợp giữ lại Sinh viên: Đỗ Thị Xuân 12 Báo cáo thực tập Trường đại học Thành Tây GVHD: PGS.TS.NGHIÊM NGỌC MINH cột tách cho qua dung dịch đệm có chứa nồng độ imidazol thích hợp Việc thu mẫu tiến hành theo phân đoạn liên tục để kiểm tra protein ngoại lai bắt đầu tách khỏi cột từ phân đoạn kết thúc phân đoạn Trong trình tinh thu mẫu protein trên, tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm trước sau tinh gel polyacrylamide 12% Các protein xử lý với chất tẩy ion hóa mạnh SDS hợp chất khử mecarpthanol, cấu trúc bậc bị phá vỡ nên sau xử lý với SDS, protein trở thành dạng phân tử polymer cấu trúc bậc Đồng thời, SDS tạo thành lớp vỏ ion làm phân tử protein trở nên tích điện âm đồng Mecarpthanol làm giảm liên kết disulphit hình thành tiểu phần cystein Do vậy, phân tách gel phụ thuộc vào trọng lượng kích thước phân tử Tất ưu điểm cho thấy phương pháp tinh cột HisTrap dựa vào liên kết lực ion niken (Ni 2+) mang lại hiệu tốt nên chúng lựa chọn phương pháp Sinh viên: Đỗ Thị Xuân 13 Báo cáo thực tập Trường đại học Thành Tây GVHD: PGS.TS.NGHIÊM NGỌC MINH CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu, trang thiết bị dụng cụ nghiên cứu 2.1.1 Vật liệu • Mẫu mtSEB534 phòng CNSH Môi Trường – Viện CNSH cung cấp 2.1.2 Các kít • Kit tinh protein sắc kí lực cột resin (Protein Purification Protocols hãng Invitrogen) 2.1.3 Hóa chất, máy móc thiết bị sử dụng  Hóa chất Bảng 2.1: Danh mục hóa chất Tên hóa chất Hãng sản xuất EDTA Bio basic (Canada) NaOH, NiCl2 Merck (Đức) Thang chuẩn protein Fermentas (Mỹ) Ethanol 70% Fermentas (Mỹ) Agar Bio basic (Canada) Acrylamid 30% Sigma (Mỹ) TEMED Sigma (Mỹ) APS(Ammoniumpersulfate) Sigma (Mỹ) Tris base Applied BioSciences (Mỹ)  Máy móc thiết bị - Tủ lạnh -4oC, -80oC Sinh viên: Đỗ Thị Xuân 14 Báo cáo thực tập Trường đại học Thành Tây - GVHD: PGS.TS.NGHIÊM NGỌC MINH Cột tinh Ni-NTA Máy điện di protein Máy chụp ảnh điện di 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp tinh protein  Nguyên lý: Protein tái tổ hợp thu dạng dung hợp có đuôi His-tag nên dễ dàng tinh thông qua phương pháp sắc ký lực sử dụng cột nikel  Cách tiến hành:  Nuôi mẫu: Chuẩn bị bình tam giác 50 ml sau bổ sung 10 ml LB dịch Bổ sung 10 µl ampicillin với nồng độ 100mg/l vào bình tam giác có môi trường LB Dùng que ria lấy khuẩn lạc từ đĩa mẫu petri bổ sung vào ống penicillin, ống lại làm Coltrol Mang mẫu nuôi lắc 220 v/p 37oC qua đêm  Biểu hiện: Nuôi lỏng khuẩn lạc mong muốn 15 ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh ampicillin nhiệt độ 37oC, lắc 200 v/p qua đêm Hoạt hóa tế bào: Chuyển 2% dịch nuôi chuyển sang 10 ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh ampicillin 100 mg/l, nuôi 37 oC, lắc 220 v/p 2,5-3 cho OD600 đạt 0,6-0,8 tiến hành cảm ứng biểu Cảm ứng biểu hiện: Bổ sung IPTG 0,5 mM vào dịch khuẩn thu bước 2, nuôi lắc 220 v/p thời gian nhiệt độ 37oC Thu mẫu sau biểu hiện, tiến hành ly tâm 5000 v/p 10 phút để thu tế bào, hòa tan tế bào đệm photphas buffer saline Siêu âm: Sau tiến hành cảm ứng biểu hiện, cần siêu âm mẫu để phá vỡ tế bào Sinh viên: Đỗ Thị Xuân 15 Báo cáo thực tập Trường đại học Thành Tây GVHD: PGS.TS.NGHIÊM NGỌC MINH - Mẫu siêu âm với hiệu suất 60%, chạy 20s nghỉ 20s với thời gian 15 phút đá 6.Thu mẫu hút eppendorf mang li tâm 12000 v/p 15 phút Thu pha cặn dịch riêng biệt Đổ dịch vào ống fancol ký hiệu dịch sau siêu âm, cặn thu ký hiệu cặn sau siêu âm bảo quản tủ lạnh Kết điện di gel polyacrylamide (SDS-PAGE) để kiểm tra  Các bước tinh Phần dịch có chứa protein tái tổ hợp đưa lên cột Nickel-Chelating Resin chuẩn bị trước Bước 1: Loại bỏ dịch qua đêm cột tinh Bước 2: Cho ml dịch sau siêu âm vào cột tinh sạch, đảo nhẹ, giữ lơ lửng resin 30 phút Lắng resin trọng lực, thu dịch nổi, ký hiệu: Part 1, giữ 4oC Bước 3: Cho ml đệm rửa với thành phần: 200 ml dung dịch đệm tinh (urea M 72,1 g; Na2HPO4.12H2O 20 mM 1,5 g; Na2HPO4.2H2O 20 mM 0,63 g; NaCl 50 mM 5,85 g; định mức 200 ml nước deion, pH = 7,8, lọc qua màng, không khử trùng), đảo nhẹ lơ lửng resin, để lắng, thu dịch nổi, ký hiệu Part 2.1, giữ 4oC Bước 4: Lặp lại bước lần, thu dịch nổi, ký hiệu: Part 2.2, Part 2.3 giữ 4oC Bước 5: Bổ sung ml đệm đẩy với thành phần: 200 ml dung dịch đệm tinh (Imidazol 0,4 M 5,44 g; urea M 72,1 g; Na2HPO4 200 mM 6,3 g; Na2HPO4 200 mM 15 g; NaCl 500 mM 5,85 g, định mức 200 ml mước deion, pH = 8, lọc qua màng, không khử trùng), đảo nhẹ lơ lửng resin, lắng resin trọng lực, thu dịch nổi, kí hiệu: Part 3, giữ 4oC Các dịch (phân đoạn) thu sau tinh kiểm tra phương pháp điện di gel polyacrylamide Sinh viên: Đỗ Thị Xuân 16 Báo cáo thực tập Trường đại học Thành Tây GVHD: PGS.TS.NGHIÊM NGỌC MINH 2.2.2 Phương pháp điện di protein gel polyacrylamide  Nguyên lý: Điện di kĩ thuật dùng để phân tách protein dựa sở kích thước, khối lượng, điện tích cấu hình chúng Khi phân tử tích điện đặt điện trường, chúng dịch chuyển hướng đến cực dương (+) cực âm (-) tùy theo điện tích chúng  Cách tiến hành: Điện di protein tiến hành gel polyacrylamide chuẩn bị với thành phần sau: Bảng 2.2: Công thức pha gel tách (12%) Bảng Công Thành phần Nồng độ cuối thành phần gel 12% 2.3: 10ml pha cô (5%) thức gel dH2O vô trùng 30% Acrylamid Thành phần Tris-HCl5M; pH=8,8 2,45 12% Nồng độ cuối thành 3,00 3ml phần 0,375 trongM gel 5% 1,90 dH2O vô trùng 10% SDS 30% Acrylamid 0,1% 5% 2,1 0,075 0,5 Tris-HCl1M; 10% APSpH=6,8 0,13 0,1%M 0,38 0,075 10% SDS TEMED 10% APS 0,1% 0,002% 0,1% 0,075 0,002 0,075 TEMED 0,001% 0,002 Sinh viên: Đỗ Thị Xuân 17 C Báo cáo thực tập Trường đại học Thành Tây GVHD: PGS.TS.NGHIÊM NGỌC MINH CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sau tiến hành biểu cảm ứng có IPTG, dịch chiết thô thu protein lẫn nhiều tạp chất, cần tinh để thu protein quan tâm làm kháng nguyên phục vụ cho việc tạo kháng thể đơn dòng để chế tạo que thử nhanh độc tố SEB môi trường thực phẩm Protein mtSEB534 tồn dạng không tan nước mà tan môi trường biến tính điển môi trường có urea M Vì vậy, mtSEB534 tinh chế từ dịch protein tổng số chủng E coli tái tổ hợp điều kiện đệm có chứa urea M Theo thiết kế vector biểu pET22b+/mtSEB534, protein tổng hợp có đuôi His-tag với acid amin histidine liên tục Phương pháp tinh cột Ni-NTA dựa vào liên kết lực ion niken (Ni2+) với vòng imidazole histidine Khi acid amin histidine gần liên kết chúng với ion niken mạnh Trên sở đó, protein tái tổ hợp gen seb534 mã hóa liên kết đặc hiệu với ion niken Các phân tử protein tế bào tổng hợp đuôi His-tag không gắn với ion niken Protein tái tổ hợp giữ lại cột tách cho qua dung dịch đệm có chứa nồng độ imidazole thích hợp Việc thu mẫu tiến hành theo phân đoạn liên tục để kiểm tra protein ngoại lai bắt đầu tách khỏi cột từ phân đoạn kết thúc phân đoạn Trong trình tinh thu mẫu protein trên, tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm trước sau tinh gel polyacrylamide 12% Các protein xử lý với chất tẩy ion hóa mạnh SDS hợp chất khử mecarpthanol, cấu trúc bậc bị phá vỡ nên sau xử lý với SDS, protein trở thành dạng phân tử polymer cấu trúc bậc Đồng thời, SDS tạo thành lớp vỏ ion làm phân tử trở nên tích điện âm đồng Mecarthanol làm giảm liên kết disulphit hình thành tiểu phần cysteine Do vậy, phân tách gel phụ thuộc vào trọng lượng kích thước phân tử Sinh viên: Đỗ Thị Xuân 18 Báo cáo thực tập Trường đại học Thành Tây GVHD: PGS.TS.NGHIÊM NGỌC MINH Kết điện di kiểm tra protein mtSEB534 trước tinh hình 3.1 Hình 3.1 Điện di kết protein mtSEB534 trước tinh M: Thang protein chuẩn; 0h: mẫu thu lúc chưa cảm ứng biểu hiện; 5h: mẫu thu sau cảm ứng biểu Kết điện di kiểm tra gel polyacrylamide cho thấy cột điện di dịch sau siêu âm protein SEB cho băng vạch mờ, nhiều cặn vẩn cần tiến hành tinh tiếp Kết tinh protein mtSEB534 sau tinh thể hình 3.2 Sinh viên: Đỗ Thị Xuân 19 Báo cáo thực tập Trường đại học Thành Tây GVHD: PGS.TS.NGHIÊM NGỌC MINH Hình 3.2 Điện di kết tinh protein mtSEB534 tái tổ hợp M: Thang protein chuẩn; 1: Dịch tinh sạch; 2: Dịch sau rửa; 3: Dịch qua cột Kết điện di đồ cho thấy, sản phẩm tinh cho băng protein đậm, rõ nét với trọng lượng phân tử khoảng 22 kDa phù hợp với tính toán lý thuyết thiết kế mồi Như tinh thành công protein SEB534 dạng đột biến Kháng nguyên tái tổ hợp SEB534 dạng đột biến thu nghiên cứu sử dụng làm nguyên liệu để gây đáp ứng miễn dịch động vật thử nghiệm tạo kháng thể đa dòng, đơn dòng phục vụ cho việc chế tạo que thử nhanh độc tố SEB tụ cầu vàng môi trường thực phẩm Sinh viên: Đỗ Thị Xuân 20 Báo cáo thực tập Trường đại học Thành Tây GVHD: PGS.TS.NGHIÊM NGỌC MINH KẾT LUẬN Đã tinh thành công protein SEB534 dạng đột biến KIẾN NGHỊ Xác định nồng độ protein Stapylococcal enterotoxin B sau tinh kiểm tra độc tính protein Staphylococcal enterotoxin B đột biến đối tượng thử nghiệm (chuột thỏ) Sinh viên: Đỗ Thị Xuân 21 Báo cáo thực tập Trường đại học Thành Tây GVHD: PGS.TS.NGHIÊM NGỌC MINH TÀI LIỆU THAM KHẢO I, Tài liệu Tiếng Việt Lê Huy Chính (2003) Vi sinh y học, Nxb Y học, Hà Nội Nguyễn Đức Lượng (2004) Công nghệ enzyme, NXB ĐHQG TPHCM II, Tài liệu Tiếng Anh Bruce AG, Kermit DH, Jerry LM, Francisco T, Rick K, John DH, Robert GD (2011) Staphylococcal Enterotoxin B (http://emedicine.medscape.com/article/830715-overview) Nema V, Agrawal R., Kamboj D, Geoel AK, Singh L (2007) Isolation and characterization of heat resistant enterotoxigenic Staphylococcus aureus from a food poisoning outbreak in Indian subcontinent International Journal of Food Microbiology, 117(1): 29-35 Martin MC, Fueyo JM, Gonzalez-Hevia MA, Mendoza MC (2004) Genetic procedures for identification of enterotoxigenic strains of Staphylococcus aureus from three food poisoning outbreaks International Journal of Food Microbiology, 94(3): 279-286 6.Thibodeau J, Cloutier I, Lavoie PM, Labrecque N, Mourad W, Jardetzky T, Sekaly RP (1994) Subsets of HLA-DR1 molecules defined by SEB and TSST-1 binding Sciences, 266(5192): 1874-1878 Johns MB Jr , Khan SA (1988) Staphylococcal enterotoxin B gene is associated with a discrete genetic element Journal of bacteriology, 170 (9): 4033-4039 III, Tài liệu internet http://vfa.gov.vn/content/article/tinh-hinh-ngo-doc-thuc-pham-trong-thoi-gian-vuaqua-196.vfa http://tv.nld.com.vn/phong-su/nam-2014-hon-5000-nguoi-bi-ngo-doc-thuc-pham6620.htm Sinh viên: Đỗ Thị Xuân 22 Báo cáo thực tập Trường đại học Thành Tây GVHD: PGS.TS.NGHIÊM NGỌC MINH 10 http://www.chinhphu.vn/portal/page/portal/chinhphu/congdan/DuThaoVanBan? _piref135_27935_135_27927_27927.mode=detail&_piref135_27935_135_27927_ 27927.id=532 11 http://www.foodpoisonjournal.com/food-recall/staphylococcal-enterotoxinprompts-chicken-recall/#.VQ_VY3OVMfQ Sinh viên: Đỗ Thị Xuân 23 Báo cáo thực tập