chiết tách các alcaloid crinamidin 6- hydroxy crinamidin của lá trinh nữ hoàng cung đạt yêu cầu độ tinh khiết trên 98%

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐOÀN CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ BÁO CÁO NGHIỆM THU Đã được chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu ngày 16/9/2010 “CH

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐOÀN

CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ

BÁO CÁO NGHIỆM THU

(Đã được chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu ngày 16/9/2010)

“CHIẾT TÁCH CÁC ALCALOIDCRINAMIDIN

VÀ 6-HYDROXYCRINAMIDIN CỦA LÁ TRINH NỮ HOÀNG CUNG

ĐẠT YÊU CẦU ĐỘ TINH KHIẾT TRÊN 98%”

Cơ quan chủ trì: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN

TP Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2010

“Chiết tách các alcaloid Crinamdin và 6-hydroxycrinamidin

của lá Trinh Nữ Hoàng Cung đạt yêu cầu độ tinh khiết trên 98%”

(Isolation Crinamidin and 6-hydroxycrinamidin from Crinum latifolium L

with required of 98 % pure)

Chủ nhiệm đề tài: Ths Nguyễn Hữu Lạc Thủy

Cơ quan chủ trì:

“Trung tâm phát triển khoa học và công nghệ trẻ - Thành đoàn TpHCM”

Thời gian thực hiện đề tài:

Kinh phí được duyệt: 80.000.000 (tám mươi triệu đồng)

Kinh phí đã cấp: 80.000.000 theo TB số: TB-SKHCN ngày

Mục tiêu của đề tài:

Công việc dự kiến Công việc đã thực hiện

1 Thu thập dược liệu, chiết 50 g cao alcaloid toàn phần Đã thực hiện

2 Thăm dò các điều kiện tách phân đoạn Đã thực hiện

3 Qui trình tách Crinamidin và 6-hydroxycrinamidin Đã thực hiện

4 Xác định cấu trúc, định danh sản phẩm Đã thực hiện

5 Qui trình định lượng sản phẩm có TNHC Đã thực hiện

b

Đề tài:

“Chiết tách các alcaloid Crinamdin và 6-hydroxycrinamidin của lá Trinh Nữ Hoàng Cung đạt yêu cầu độ tinh khiết trên 98%”

(Isolation Crinamidin and 6-hydroxycrinamidin from Crinum latifolium L

with required of 98 % pure)

TÓM TẮT

Đặt vấn đề

Hiện nay, các chế phẩm từ Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) với tác dụng điều trị

u phì đại lành tính tuyến tiền liệt và hỗ trợ điều trị ung thư như Tadimax, Crila, Panacrin đã

có mặt trên thị trường Tuy nhiên, việc kiểm nghiệm các chế phẩm này hiện đang gặp khó khăn vì thiếu chất chuẩn để có thể tiến hành kiểm nghiệm thường xuyên Công trình này nhằm phân lập nhanh một vài alcaloid từ lá TNHC làm chuẩn đối chiếu nhằm phục vụ công tác kiểm nghiệm các chế phẩm chứa TNHC

Phương pháp nghiên cứu

Từ alcaloid toàn phần của lá TNHC, dùng kỹ thuật VLC với các hệ dung môi tăng dần độ phân cực, silicagel được tẩm đệm kiềm để phân lập nhanh các alcaloid tinh khiết Alcaloid sản phẩm được so sánh với alcaloid chuẩn trên sắc ký lớp mỏng, kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLHNC và xác định cấu trúc hóa học bằng các phân tích phổ học

SUMMARY

Objectives

Extracts from Crinum latifolium have been proved to possess some properties in treatment of the benign prostatic hyperplasia Some of herbal drugs such as Tadimax, Crila, Panacrin which all contain extracts from Crinum latifolium as bioactive components have appeared on market for this therapeutic purpose However, reference standards from Crinum latifolium

for medicine quality control purpose is in trouble due to the supply still not enough This paper reports a simple process to flash isolate a large amount of pure crinamidine an6- hydroxycrinamidine for using as a working reference in order to control the herbal drugs

containing this extract as a bioactive component

Experimentals

From total alkaloid residue of the leaves of , with a technique of VLC using basic modified silica, nine fractions of alkaloid were separated One of them (fraction G) was easily crystalized to afford a pure alkaloid G1 and G2

Results and Conclusions

From 10 kg of the leaves of Crinum latifolium collected in Dong Nai province, 50 g of total

alkaloid residue was separated With a VLC technique using basic modified silica gel as a static phase, a large mount of alkaloid G 1 (100 mg) and G 2 (50 mg) were isolated successfully from the total alkaloid residue The structure of G 1 and G 2 were determined as

crinamidine and 6-hydroxycrinamidine [7], [12]., known alkaloids isolated from Crinum latifolium L species previously The decrease in time of the process is an advantage of this

study

c

Lời cảm ơn:

Nhóm nghiên cứu chúng tôi chân thành cảm ơn:

Sở khoa học và công nghệ Tp Hồ Chí Minh

Thành đoàn Tp Hồ Chí Minh

Trung tâm phát triển Khoa học và công nghệ trẻ, Thành đoàn Tp HCM

Bô môn Phân tích – Kiểm nghiệm, Khoa Dược, đại học Y dược Tp HCM

Đã tạo điều kiện về mọi mặt như: hổ trợ kinh phí, trang thiết bị để chúng tôi thực hiện và hoàn thành đề tài Đề tài đã bổ sung nguồn chất chuẩn có nguồn gốc tự nhiên, góp phần trong công tác tiêu chuẩn hóa nguồn nguyên liệu Trinh Nữ Hoàng Cung để làm thuốc Đồng thời qua quá trình thực hiện đề tài đã giúp tích lũy, nâng cao các kiến thức để nghiên cứu khoa học cho nhóm nghiên cứu chúng tôi và các bạn sinh viên Khoa Dược, đại học Y dược Tp Hồ Chí Minh

MỤC LỤC

Trang

1 TỔNG QUAN ……… 1

1.1 CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG….……… 1

1.2 CHẤT CHUẨN ……… 5

1.3 VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ……… 6

2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU … 7

2.1 NỘI DUNG 1: CHIẾT ALCALOID TOÀN PHẦN ….……… …………7

2.1.1 Yêu cầu cần thực hiện ……… … 8

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu……….……… …… 8

2.2 NỘI DUNG 2: THĂM DÒ ĐIỀU KIỆN TÁCH PHÂN ĐOẠN…… … ….…9

2.2.1 Yêu cầu thực hiện ………… ……… … 9

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu……….… … 9

2.3 NỘI DUNG 3: TÁCH PHÂN ĐOẠN, PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT .10

2.3.1 Yêu cầu cần thực hiện 10

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 10

2.4 NỘI DUNG 4: TINH CHẾ SẢN PHẨM 11

2.4.1 Yêu cầu .11

2.4.2 Phương pháp nghiên cứu .11

2.5 NỘI DUNG 5: ĐỊNH DANH SẢN PHẨM .12

2.5.1 Yêu cầu thực hiện .13

2.5.2 Phương pháp nghiên cứu .13

2.6 NỘI DUNG 6: XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CRINAMIDIN TRONG VIÊN OPCRILATI .14

2.6.1 Quy trình định lượng……… ……….14

2.6.2 Thẩm định qui trình ……… ……… ……17

3 KẾT QUẢ - BÀN LUẬN .20

2.1 NỘI DUNG 1: CHIẾT ALCALOID TOÀN PHẦN ….………… ………… 20 2.2 NỘI DUNG 2: THĂM DÒ ĐIỀU KIỆN TÁCH PHÂN ĐOẠN…… …… 21 2.3 NỘI DUNG 3: TÁCH PHÂN ĐOẠN, PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT .24 2.4 NỘI DUNG 4: TINH CHẾ SẢN PHẨM .25

2.5 NỘI DUNG 5: ĐỊNH DANH SẢN PHẨM .25

2.6 NỘI DUNG 6: XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CRINAMIDIN TRONG VIÊN OPCRILATI .27

4 KẾT LUẬN .28 TÀI LIỆU THAM KHẢO……… ……… 29

DANH SÁCH BẢNG

2.9 Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống của mẫu thử 16

2.11 Kết quả khảo sát độ đúng 18 2.12 Kết quả khảo sát độ lặp lại 19

DANH SÁCH HÌNH

2.2 Sắc ký đồ và phổ UV của mẫu thử 17 2.3 Sắc ký đồ và phổ UV của mẫu thử thêm chất chuẩn 17

I TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG

Tên khác: Tỏi lơi lá rộng

Tên khoa học: Crinum latifolium L

Họ: Loa kèn đỏ (Amaryllidaceae)

1.1.1 Mô tả:

Cây cỏ lớn Thân hành to, hình cầu hoặc hình trứng thuôn, đường kính 8- 10cm, phủ bởi những vảy hình bản to, dày, màu trắng Lá mọc thành tán trên một cán dẹt, dài 30- 40cm; lá bắc rộng, hình thìa dài 7 cm, màu lục, đầu nhọn; hoa màu trắng pha hồng, dài 10- 15 cm; bao hoa gồm 6 phiến bằng nhau, khi nở đầu phiến quăn lại; nhị 6; bầu hạ Quả gần hình cầu (ít gặp)

1.1.2 Phân bố, sinh thái

Chi Crium L có khoảng 100 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới; trong đó, một số

loài được trồng làm cảnh và làm thuốc tương đối phổ biến

Cây trinh nữ hoàng cung có nguồn gốc từ Ấn Độ, hiện được trồng rộng rãi ở nhiều nước trong khu vực Đông Nam Á như Thái Lan, Malaysia, Philippin, Campuchia, Lào, Việt Nam, Ấn Độ … Ở Việt Nam, cây được trồng chủ yếu ở các tỉnh từ Quảng Nam-

Đà Nẵng trở vào, sau được trồng ở các tỉnh phía bắc

Trinh nữ hoàng cung là cây ưa ẩm, ưa sáng hoặc có thể chịu bóng râm 1 phần, sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện khí hậu nóng và ẩm của vùng nhiệt đới Cây có khả năng đẻ nhánh khoẻ, hàng năm có thêm 3- 5 hành con từ thân hành mẹ Cây trồng được 3 năm sẽ tạo thành một khóm lớn, có đến 20 nhánh ở các tuổi khác nhau

1.1.3 Cách trồng

Trinh nữ hoang cung đang được trồng ở nhiều nơi, từ miền Bắc đến miền Nam

Cây được nhân giống bằng thân hành vào mùa xuân (tháng 2- 3) ở miền Bắc và vào đầu mùa mưa ở miền Nam Chọn thân hành bánh tẻ, chưa ra hoa, không sâu bệnh để làm giống Năm đầu, cây hầu như không đẻ nhánh Từ năm thứ 2 trở đi, cây mới bắt đầu đẻ nhánh Vì vậy, tốc độ nhân giống rất chậm, nhất là khi cần nhân một dòng đã chọn lọc Hiện nay, đã có phương pháp nhân dòng vô tính khá nhanh bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

Trinh nữ hoàng cung hơi ưa bóng, ưa ẩm (luôn luôn là 60- 70%) Chọn loại đất thịt nhẹ hoặc trung bình, có khả năng giữ ẩm Đất cần cày bừa kỹ, để ải, bón lót cho mỗi hecta 25- 30 tấn phân chuồng, 500kg supe lân, 300 kg sulfat kali Trộn đều phân với đất, lên luống cao 25- 30 cm, mặt luống rộng 0,8m rồi trồng 2 hàng, mỗi hốc trồng 1 thân hành với khoảng cách 40 x 40 cm Khi trồng, cần cắt bỏ hết rễ, cắt bớt lá, vùi sâu vừa hết phần thân hành Thường xuyên làm cỏ, xới xáo, vun kín thân hành, tưới đủ

ẩm Cây có thể chịu được úng ngập trong vài ngày

Trinh nữ hoàng cung bị một loại sâu đặc hiệu gây hại rất nghiêm trọng, đó là Brithys

crini Fabricius thuộc họ Noctuidae, bộ Lepidotera Sâu xuất hiện vào đầu tháng hai,

gây hại tất cả các bộ phận

1.1.4 Bộ phận dùng: Lá, thân hành

1.1.5 Thành phần hoá học:

Trinh nữ hoàng cung được nghiên cứu về hoá học vào khoảng từ năm 1980

Các alcaloid có trong trinh nữ hoàng cung thuộc 2 nhóm:

-Không dị vòng: latisolin, latisodin, beladin

-Dị vòng: ambelin, crinafolin, crinafolidin, 11- O- acetylambelin, 11- O- acetyl 1,2 β- epoxyambelin, lycorin, epilycorin, epipancrassidin, 9-O–demethylhomolycorin, lycorin–1–O–glucosid, pseudolycorin–1–O–β–D–glucosid, latindin, pratorin, pratorinin, pratorinin, pratorimin, pratosin, latifin (Shibanath Glosal và cộng sự, 1983,

1985, 1986, 1988, 1989, Jeffs Peter W 1985, Kobayashi Shigeru, 1984)

Thân rễ chứa 2 glucan: glucan A và glucan B, Glucan A gồm 12 đơn vị glucose, còn glucan B có khoảng 110 gốc của glucose (Tomada Mashashi và cộng sự, 1985)

Ở Việt Nam, theo Nguyễn Hoàng và cộng sự, 1997, trinh nữ hoàng cung có 11 alcaloid, 11 acid amin, acid hữu cơ Các acid amin là phenylalanin, 1– leucin, dl – valin và arginin monohydroclorid

Trần Văn Sung và cộng sự, 1997, đã phân lập được từ thân hành trinh nữ hoàng cung 5 alcaloid trong đó, 2 chất là lycorin và pratorin được nhận dạng bằng phổ khối lượng và phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton carbon 13

Võ Thị Bạch Huệ và cộng sự, 1998, đã phân lập được từ 2 lá alcaloid là Crinamidin, 6–hydroxycrinamidin được nhận dạng bằng các phân tích hoá học và quang phổ

1.1.6 Tác dụng dược lý

Cao methanol của rễ, thân, và cao chiết alcaloid toàn phần của trinh nữ hoàng cung đều có tác dụng ức chế sự phân bào, kìm hãm sự tăng trưởng của rễ hành ta; hoạt tính của cao trinh nữ hoàng cung bằng hoặc hơn 50% so với hoạt tính của colchicin ở cùng nồng độ Panacrin là chế phẩm thuốc bào chế từ hỗn hợp 3 dược liệu: lá trinh nữ hoàng cung, củ tam thất và lá đu đủ, được nghiên cứu về tác dụng chống ung thư Trên mô hình gây u báng thực nghiệm bằng cách cấy truyền vào xoang bụng chuột nhắt trắng tế

giảm sinh khối của u hay giảm tổng số tế bào ung thư, đồng thời làm giảm chỉ số gián phân của tế bào ung thư

Trong mô hình gây ung thư đùi thực nghiệm bằng tiêm vào đùi chuột nhắt trắng tế bào

u báng Sarcom TG – 180, Panacrin có tác dụng hạn chế sự phát triển khối u và hạn chế

sự di căn của tế bào ung thư từ u đùi lên gan, phổi, lách Thuốc có tác dụng kéo dài thời gian sống của chuột mang ung thư được điều trị gần gấp đôi so với chuột đối chứng mang ung thư

Trong công trình nghiên cứu khả năng tăng cường sự sinh sản in vitro của tế bào lympho T khi sử dụng cao chiết bằng nước nóng từ trinh nữ hoàng cung (1 – 8 mg/ml),

đã dùng bạch cầu đơn nhân to lấy từ máu ngoại vi của người cho máu khoẻ mạnh, và nuôi cấy trong môi trường chứa cao chiết với nước nóng từ trinh nữ hoàng cung theo

tỷ lệ 1:3 Cao chiết bằng nước nóng từ dược liệu có tác dụng kích thích sự sản của tế bào limpho T, và đặc biệt có tác dụng kích thích trực tiếp các tế bào CD4 + T trong thử nghiệm in vitro trên bạch cầu đơn nhân to ngoại vi lấy từ máu ngoại vi người Trong thử nghiệm in vitro, cho chuột nhắt trắng uống cao chiết nước nóng từ trinh nữ hoàng cung, cũng thấy có tác dụng kích thích sự sản sinh của tế bào lympho T, và hoạt hoá mạnh tế bào lympho trong máu ngoại vi của chuột thử nghiệm Sự tăng sinh tế bào lympho T có tầm quan trọng đặc biệt trong miễn dịch học ung thư

Một số alcaloid trong cây trinh nữ hoàng cung có hoạt tính sinh học Lycorin ức chế sự tổng hợp protein và DNA của tế bào chuột, và ức chế sự phát triển của u báng cấy ở chuột Trong thử nghiệm in vitro, lycorin ức chế sinh tổng hợp vitamin C trong cây cỏ, làm ngừng sự phát triển virus gây bệnh bại liệt, ức chế sự tổng hợp các tiền chất cần

cho sự sinh trưởng của virus gây bệnh bại liệt, và enzym polipeptidase, và có tác dụng kháng virus Lycorin có đọc tính cấp tính thấp

Lycorin – O – glycosid ở mức liều microgam gây kích thích các tế bào lympho lách chuột nhắt trắng, có tác dụng điều hoà miễn dịch Pseudolycorin có tác dụng làm ngừng sự phát triển tế bào Hela, ngăn cản sự tổng hợp protein trong tế bào u báng và làm chậm lại quá trình tổng hợp DNA Hippadin ức chế một cách hồi phục được sự thụ tinh của chuột cống đực; 1,2 – β – epoxyambellin gây hoạt hoá tế bào lympho lách chuột nhắt Hỗn hợp ambellin và 1, 2 – β – epoxyambellin gây hoạt hoá tế bào lympho giống như chất concanavalin A

Thuốc Panacrin cũng được dùng cho 3 nhóm bệnh nhân ung thư dạ dày, ung thư gan

và u lympho ác tính, có kiểm chứng, thấy được dung nạp tốt và có ít tác dụng không mong muốn Sau 3 tháng dùng thuốc, mức độ đáp ứng của bệnh nhân dùng Panacrin

có thuận lợi hơn so với nhóm đối chứng, nhưng vì cỡ mẫu nghiên cứu còn nhỏ nên chưa tạo được sự khác biệt có ý nghĩa thống kê

1.1.7 Tính vị, công năng

Trinh nữ hoang cung có vị đắng, chát, có tác dụng gây sung huyết da

1.1.8 Công dụng:

Trinh nữ hoàng cung được dùng trong phạm vi dân gian để chữa ung thư vú, ung thư

tử cung, ung thư tuyến tiền liệt Lá thái nhỏ, với liều dùng mỗi ngày 3- 5 lá, sao vàng sắc uống Cũng có người dùng điều trị ung thư dạ dày, ung thư phổi, ung thư gan và chữa đau dạ dày Ở các tỉnh phía nam, trinh nữ hoàng cung được dùng phổ biến chữa bệnh đường tiết niệu

Dùng ngoài, lá và thân hành giã nát, hơ nóng dùng xoa bóp làm xung huyết da chữa tê thấp, đau nhức

Ở Ấn Độ, nhân dân dùng thân hành cây trinh nữ hoàng cung xào nóng, giã đắp trị thấp khớp, và cũng dùng để đắp trị mụn nhọt và áp xe Dịch ép lá là thuốc nhỏ tai chữa đau tai Ở Campuchia, nhân dân dùng cây trinh nữ hoàng cung để điều trị bệnh phụ khoa

1 2 CHẤT CHUẨN

Chất đối chiếu là chất cần thiết để đảm bảo các kết quả phân tích đạt độ chính xác, chúng được làm chất chuẩn gốc để đánh giá các nguyên liệu, chế phẩm theo quy định Dược điển Việc thiết lập các chất chuẩn đối chiếu dựa vào các báo cáo kết quả thí nghiệm đánh giá của các phòng thí nghiệm với các phương tiện phân tích hiện đại chứng tỏ chúng đáp ứng mục đích sử dụng Chất đối chiếu đã được định nghĩa như sau: “chất đối chiếu là những nguyên liệu đồng nhất đã được chuẩn mực, dùng cho các phép thử hoá lý, vi sinh, trong đó tính chất của chúng được đối chiếu với sản phẩm thử

nghiệm và mức độ tinh khiết của chất đối chiếu phải đáp ứng mục đích sử dụng”

Các chất đối chiếu hiện có:

- Chất đối chiếu WHO (ICRS)

- Chất đối chiếu Châu Âu (EPRS)

- Chất đối chiếu Anh (BPCRS)

- Chất đối chiếu Mỹ (USP)

- Chất đối chiếu Asean (ARS)

- Chất đối chiếu quốc gia do cơ quan quản lý chất lượng quốc gia công nhận và ban hành

- Chất chuẩn làm việc (working standard): do cơ sở thành lập

Theo FDA hướng dẫn soạn tài liệu để đăng ký sản xuất chất chuẩn:

- Chuẩn đối chiếu (Reference standard) là một lô hoặc mẻ của hợp chất làm thuốc được điều chế đặc biệt bằng cách tổng hợp độc lập hay bằng cách tinh chế bổ sung của nguyên liệu sản xuất và được chứng minh bằng một loạt các thử nghiệm phân tích sâu rộng để xác nhận nó là nguyên liệu xác thực có độ tinh khiết tối đa có thể đạt được Thường dùng cho việc giải cấu trúc và chất làm chuẩn cho các chất chuẩn làm việc

- Chuẩn làm việc là một hợp chất làm thuốc có chất lượng và độ tinh khiết được xác lập khi so sánh với các chất chuẩn đối chiếu, được dùng làm chất chuẩn cho các công việc thường ngày của phòng thí nghiệm như trong việc phân tích các lô sản xuất các chất thuốc mới hay thành phẩm thuốc

Mục đích sử dụng chất đối chiếu:

Các chất đối chiếu được sử dụng theo yêu cầu của chuyên luận dược điển hay yêu cầu kiểm nghiệm

Đóng gói, bảo quản:

Vật dụng đóng gói chất đối chiếu phải có khả năng chống hút ẩm, ánh sáng và oxy

1.3 VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

1.3.1 Nguyên vật liệu

- Lá cây Trinh Nữ Hoàng Cung thu hái ở Bình Định từ tháng 2 đến tháng 8 năm 2008

- Chất đối chiếu Crinamidin và 6 Hydroxycrinamidin do bộ môn Phân tích –Kiểm nghiệm cung cấp

1.3.2 Dung môi - Hóa chất

- Các hóa chất thuốc thử đạt độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng

- Các dung môi như: cyclohexan, dichloromethan, chloroform, ethyl acetat, aceton, methanol, ethanol, HCl, amoniac đạt tinh khiết loại PA do Trung Quốc sản xuất

1.3.3 Dụng cụ

-Máy SKLHNC hiệu Water 2695 (Separations Module)

-Cân tích Sartorius có độ nhạy 0,1 mg

-Máy cô quay R-3000

-Đèn UV hai bước sóng 254 nm, 365 nm

-Máy ảnh kỹ thuật số hiệu Canon

Các thực nghiệm được thực hiện tại: Bộ môn Hoá Phân tích – Kiểm nghiệm, khoa Dược, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh

2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NỘI DUNG 1: CHIẾT ALCALOID TOÀN PHẦN

2.1.1 Yêu cầu cần thực hiện: “Chiết được 50 - 60 g cao alcaloid toàn phần.”

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu:

- Thu nguyên liệu: chọn lá bánh tẻ ở các cây trên 2 năm tuổi, không dùng các lá đã khô trên cây Xử lí: rửa sạch, để ráo, thái nhỏ và xay để được bột lá

- Bột lá: chiết xuất cao alcaloid toàn phần trên nguyên tắc là alcaloid dạng base tan trong dung môi kém phân cực, alcaloid dạng muối tan trong dung môi phân cực

2.1.2.1 Quy trình 1: chiết bằng chloroform

- Bột lá được làm ẩm và ngấm kiệt bằng hỗn hợp dung môi cồn và acid HCl Điều chỉnh nồng độ acid để thu được dịch ngấm kiệt có pH acid, sau đó trung hòa dịch chiết đến pH trung tính Lọc bỏ tủa, dịch lọc được cô cách thủy và kiềm hoá bằng đến pH

Sơ đồ 2.1 Quy trình thử nghiệm chiết alcaloid từ lá TNHC bằng CHCl3

2.1.2.2 Quy trình 2: chiết bằng Dichloromethan

- Thu hồi dung môi

Cao alcaloid toàn phần (0,1620 g)

Tủa nhầy

2.2 NỘI DUNG 2: THĂM DÒ ĐIỀU KIỆN TÁCH PHÂN ĐOẠN

2.2.1 Yêu cầu cần thực hiện:

Xác định hệ dung môi và điều kiện triển khai sắc ký cho hiệu quả tách tốt nhất

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu:

Thăm dò hệ dung môi sắc ký:

Thăm dò hệ dung môi: kiểm tra bằng SKLM với mẫu thử là cao alcaloid toàn phần với một vài hệ dung môi và phát hiện bằng thuốc thử đặc hiệu của alcaloid là Dragendorff

Thăm dò điều kiện tách phân đoạn alcaloid bằng kỹ thuật sắc ký cột chân không:

- Thử nghiệm thăm dò điều kiện tách các phân đoạn alcaloid bằng kỹ thuật sắc ký cột chân không với các điều kiện sau:

-Thay đổi pH cột bằng cách tẩm silica gel với dung dịch đệm pH kiềm, đệm pH acid và không tẩm đệm

- Xác định lượng dung dịch đệm vừa đủ để tẩm silica gel

- Thay đổi cách nạp mẫu vào cột sắc ký: nhồi cột khô, nhồi cột ướt

2.2.2.1 Cột silica gel được tẩm đệm pH kiềm

- Trộn đều silica gel với một lượng đệm kiềm thích hợp, nạp vào cột, hoạt hoá và ổn định cột bằng cyclohexan

- Mẫu: cao alcaloid toàn phần: cân khoảng 0,2 g cao cho vào cột đã được tẩm đệm pH kiềm và rửa giải bằng các hệ dung môi theo thứ tự độ phân cực tăng dần

Bảng 2.1 Kết quả rửa giải qua cột silica gel tẩm đệm pH kiềm (cột 1)

đoạn

Màu sắc Quan sát

Phản ứng với

TT Dragendorff

2.2.2.2 Cột silica gel được tẩm đệm pH acid

- Trộn đều silica gel với một lượng đệm acid thích hợp, nạp vào cột, hoạt hoá và ổn định cột bằng cyclohexan

- Mẫu: cao alcaloid toàn phần: cân khoảng 0,2 g cao cho vào cột đã được tẩm đệm acid

và rửa giải bằng các hệ dung môi theo thứ tự độ phân cực tăng dần

Bảng 2.2 Kết quả rửa giải qua cột silica gel tẩm đệm pH acid (cột 2)

STT Dung môi Phân đoạn Quan sát Màu sắc Phản ứng với TT Dragendorff

2.2.2.3 Cột silica gel không tẩm

- Nạp silicagel vào cột, hoạt hoá và ổn định cột bằng cyclohexan

-Mẫu: cao alcaloid toàn phần: cân khoảng 0,2 g cao cho vào cột đã được hoạt hoá và rửa giải bằng các hệ dung môi theo thứ tự độ phân cực tăng dần

Bảng 2.3 Kết quả rửa giải qua cột silica gel không tẩm (cột 3)

đoạn

Màu sắc quan sát

Phản ứng với

TT Dragendorff

Các phân đoạn thu được từ cột (1), cột (2) và cột (3) được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng để so sánh khả năng tách các phân đoạn sau khi tẩm silica gel bằng các dung dịch đệm có pH khác nhau

2.3 NỘI DUNG 3: TÁCH PHÂN ĐOẠN, PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT 2.3.1 Yêu cầu cần thực hiện:

Phân lập 100 mg Crinamidin và 50 mg 6-hydroxycrinamidin độ tinh khiết trên 98 %

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu:

2.3.2.1 Tách phân đoạn alcaloid bằng kỹ thuật sắc ký cột chân không

Cột silica gel tẩm đệm pH kiềm được chọn để triển khai sắc ký cột chân không

Điều kiện tiến hành

-Kích thước cột: 25 x 9 (cm) -Silica gel (Merck) cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm

-Mẫu phân tích: 50 (g) cao alcaloid toàn phần lá TNHC

-Dung môi khai triển: cyclohexan, hỗn hợp cyclohexan và DCM, DCM, chloroform, ethyl acetat, aceton đến methanol

Các bước tiến hành

-Bước 1: nạp silica gel đã tẩm đệm pH kiềm, hoạt hoá và ổn định cột bằng cyclohexan

-Bước 2: nạp mẫu vào cột bằng phương pháp nhồi cột ướt

-Bước 3: rửa giải bằng các dung môi theo thứ tự độ phân cực tăng dần: cyclohexan,

hỗn hợp cyclohexan và DCM, DCM, chloroform, ethyl acetat, aceton đến methanol

2.4 NỘI DUNG 4: TINH CHẾ SẢN PHẨM

2.4.1 Yêu cầu: độ tinh khiết trên 98%

2.4.2 Phương pháp nghiên cứu:

Tinh chế

Sơ đồ 3.2 Tinh chế các kết tinh của phân đoạn G

- Kết tinh trong các ống nghiệm được lấy bằng cách lọc qua phễu thuỷ tinh xốp, rửa bằng ethyl acetat lạnh, rồi methanol lạnh

- Phần kết tinh trên phễu sẽ được hoà trong ethyl acetat rồi để kết tinh, lọc, rửa bằng ethyl acetat lạnh, sau đó đem hút chân không

- Dịch lọc qua phễu được cho vào bình cầu đáy tròn để tiếp tục kết tinh

Kiểm tra độ tinh khiết của các kết tinh

Bằng phương páhp SKLM và SKLHNC

Kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng

- Bản mỏng silica gel F254 (Merck)

- Mẫu thử: G1, G2, G3, G4, Crinamidin, 6-hydroxycrinamidin hoà trong methanol

Kiếm tra độ tinh khiết bằng phương pháp SKLHNC kết tinh G1 và G2:

Điều kiện:

- Cột Phenomenex RP C8 (25 x 4,6 mm, 5 m)

- Pha động: methanol – đệm phosphat pH (20 : 80)

- Tốc độ dòng: 1 ml/ phút

- Detector PDA ở bước sóng UV 214 nm

Mẫu thử: cân chính xác khoảng 1 mg G1, G2 hoà tan và điền đến vạch bằng methanol trong bình định mức 1 ml, lọc qua màng lọc 0,45 µm Mẫu thử được bơm vào hệ thống SKLHNC với các điều kiện như trên

2.5 NỘI DUNG 5: ĐỊNH DANH SẢN PHẨM

2.5.1 Kết quả cần đạt: định danh được các hợp chất đã phân lập

2.5.2 Phương pháp nghiên cứu: sau khi kiểm tra độ tinh khiết hai kết tinh G1 và G2,

phổ UV-Vis, phổ IR, phổ NMR

của G1 và G2 với Crinamidin và 6-hydroxycrinamidin do nhóm đã phân lập trong

Các giá trị so ánh với phổ NMR của G1 [7; 12]

Bảng 2.6: Kết quả so sánh G1 với Crinamidin trên phổ NMR

Các giá trị so ánh với phổ NMR của G2 [7; 12]

Bảng 2.7: Kết quả so sánh G2 với 6-hydroxycrinamidin trên phổ NMR

2.6 NỘI DUNG 6: XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CRINAMIDIN TRONG VIÊN OPCRILATI

Chuẩn bị các dung dịch mẫu đối chiếu và mẫu thử

- Mẫu đối chiếu: hòa tan Crinamidin trong Methanol nồng độ chính xác 0,1 mg/ ml

- Mẫu thử:

Giai đoạn chiết alcaloid thô

- 10 viên OPCrilati cho vào một becher 250ml Thêm 30ml HCl 1%, siêu âm trong 30 phút Để lắng Lọc dịch trong qua bông gòn cho vào becher 250ml (làm 3 lần)

- Tất cả dịch HCl 1% chiết được từ viên OPCrilati được lọc qua giấy một lần nữa cho

- Lọc qua giấy lọc để loại hết tủa (nếu thấy đục và có tủa)

cho tách lớp

- Tiếp tục thực hiện lần 2 và lần 3 Toàn bộ dịch CHCl3 sẽ được gộp lại, cho qua lọc để được dịch CHCl3 trong suốt

Giai đoạn tinh chế

Lập lại các giai đoạn trên 2 đến 3 lần Cắn alcaloid được tiếp tục xử lí qua SPE và định lượng Crinamidin bằng phương pháp SKLHNC

Kết quả thực nghiệm thẩm định qui trình và định lượng Crinamidin trong viên OPCrilati:

Với điều kiện sắc ký và phương pháp xử lý mẫu đã lựa chọn, sắc ký đồ thu được cho các đỉnh tách rõ ràng, nhiễu nền thấp, thể hiện qua sắc ký đồ của mẫu thử Sắc ký đồ cho thấy mẫu thử có đỉnh có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của đỉnh Crinamidin trong sắc ký đồ của mẫu đối chiếu

Tại thời gian lưu của đỉnh Crinamidin trên sắc ký đồ mẫu thử và mẫu đối chiếu, phổ

UV của mẫu thử và mẫu đối chiếu trùng khít lên nhau Điều này chứng tỏ đỉnh thu được của mẫu thử là tinh khiết và các thành phần khác trong mẫu thử không ảnh hưởng đến quá trình phân tích Crinamidin ở điều kiện sắc ký đã lựa chọn

Khảo sát tính tương thích hệ thống

- Để đánh giá tính tương thích của chất chuẩn đối chiếu Crinamidin, pha dung dịch chất đối chiếu có nồng độ 1 mg/ml (cân chính xác khoảng 5 mg Crinamidin cho vào bình định mức 5 ml, cho MeOH vào hòa tan và điền đến vạch, pha loãng) Tiêm mẫu đối chiếu 6 lần vào hệ thống SKLHNC, tiến hành sắc ký với điều kiện đã chọn

- Để đánh giá tính tương thích của mẫu thử, mẫu thử sau khi được xử lý như trên, bơm

6 lần vào hệ thống SKLHNC, tiến hành sắc ký với điều kiện đã chọn

Bảng 2.8 Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống của Crinamidin

Bảng 2.9 Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống của mẫu thử

Số lần

bơm Thời

gian lưu

Diện tích đỉnh

Hệ số dung lượng

Hệ số chọn lọc

Độ phân giải

Hệ số bất đối

Số đĩa

lý thuyết

Nhận xét: thời gian lưu và diện tích đỉnh của mẫu thử và mẫu chuẩn đều có́ RSD <

2% Hệ số chọn lọc (1,05 ≤ α ≤ 2), hệ số bất đối (0,8 ≤ AF ≤ 1,2) và độ phân giải (Rs ≥

1,5) nằm trong giới hạn cho phép, hệ số dung lượng ( 1 ≤ k’ ≤ 8) lớn hơn 8

Số lần

bơm

Thời gian lưu

Diện tích đỉnh

Hệ số dung lượng

Hệ số chọn lọc

Hệ số bất đối

Độ phân giải

Số đĩa

lý thuyết