2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.6.2Thẩm định qui trình
Tính đặc hiệu
Khi thêm một lượng chất chuẩn vào mẫu thử, diện tích đỉnh của đỉnh của Crinamidin trong mẫu thử tăng so với lúc chưa cho chất chuẩn.
Hình 2.1. Sắc ký đồ và phổ UV của mẫu chuẩn đối chiếu Crinamidin
Hình 2.2. Sắc ký đồ và phổ UV của mẫu thử Hình 2.3. Sắc ký đồ và phổ UV của mẫu thử thêm chất chuẩn Nhận xét: quy trình đạt yêu cầu về tính đặc hiệu. 19.300 18.933 18.999
18
Tính tuyến tính
Tiến hành: cân chính xác 5,3 mg Crinamidin cho vào bình định mức 5 ml, hòa tan và
điền tới vạch bằng MeOH (dung dịch A). Từ dung dịch A pha loãng lần lượt để thu
được các dung X1, X2, X3, X4, X5, X6 có nồng độ khác nhau.
Bảng 2.10. Kết quả khảo sát tính tuyến tính. Dung dịch X1 X2 X3 X4 X5 X6 Nồng độ(µg/ ml) 0,212 1,696 3,392 8,480 21,200 42,400 Diện tích đỉnh 15211 110961 223389 584723 1450347 2973211 y = 70177x - 16376 R² = 0,9998 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Di ệ n tí ch đỉ nh Nồng độ(µg/ ml)
Hình 2.3.Đường biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích của Crinamidin.
- Khoảng tuyến tính: 0,212 – 42,400 µg/ml. - Hệ số r2 = 0,9998. Phương trình hồi quy ŷ= 70177x. Độđúng Bảng 2.11. Kết quả khảo sát độđúng Nhận xét: qui trình có tỷ lệ phục hồi là 98,1% đạt yêu cầu thẩm định vềđộđúng. Mức thêm vào
Hàm lượng chuẩn thêm
vào (µg) Hàm lượng chuẩn tìm thấy (µg)
Tỷ lệ phục hồi (%) 80 % 7,23 7,23 100,0 100 % 9,04 8,69 96,2 120% 10,85 10,73 98,0 Trung bình 98,1
19 Độ lặp lại Tiến hành trên 6 mẫu khác nhau. Bảng 2.12. Kết quả khảo sát độ lặp lại Mẫu Hàm lượng Crinamidin (µg/viên) Trung bình Viên OPCrilati 1 9,75 n = 7 Xtb = 9,86 SD = 0,2533 RSD %= 2,57 % e = ± 0,24 2 10,01 3 9,80 4 10,10 5 9,65 6 10,2 7 9,50 Nhận xét: nồng độ mẫu thử là 0,009 % đạt RSD 3,59 %. Do nồng độ chất phân tích nhỏ hơn 0,009 %, RSD = 2,57 %. Như vậy qui trình đạt yêu cầu vềđộ lặp lại. Như vậy, khảo sát tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độđúng và
độ lặp lại đều đạt yêu cầu thẩm định, có thểứng dụng quy trình để khảo sát hàm lượng Crinamidin trong mẫu thử.
- Hàm lượng Crinamidin có trong 1 viên OPCrilati được tính theo công thức:
10 dpl a Cc Sc St P= × × × ¾ St: diện tích đỉnh của mẫu thử ¾ Sc: diện tích đỉnh của chất đối chiếu ¾ Cc: nồng độ của mẫu chuẩn (µg/ ml)
¾ a: độ tinh khiết của mẫu chuẩn (%)
¾ dpl: độ pha loãng
¾ 10: lượng cao chiết từ 10 viên OPCrilati
¾ P: hàm lượng Crinamidin (µg) có trong 1viên OPCrilati
20
III. KẾT QUẢ - BÀN LUẬN
3.1. NỘI DUNG 1: CHIẾT ALCALOID TOÀN PHẦN TỪ LÁ TNHC Yêu cầu cần thực hiện: “Chiết được 50 - 60 g cao alcaloid toàn phần.”
Kết quả: hiệu suất chiết alcaloid từ hai qui trình được trình bày qua bảng 3.1
Bảng 3.1. Hiệu suất chiết alcaloid từ bột lá TNHC Quy trình Bột lá
TNHC (g) toàn phCao alcaloid ần (g) Hiệ(%) u suất trung bình (%) Hiệu suất 1 51,60 0,1635 0,32 0,32 50,35 0,1455 0,29 51,05 0,1770 0,35 2 50,70 0,1755 0,35 0,35 51,15 0,1835 0,36 50,45 0,1740 0,34
So sánh quy trình chiết alcaloid theo quy trình 1 và 2, có sự tương đương về hiệu suất chiết và số vết tách trên sắc ký lớp mỏng. Tuy nhiên trong quá trình thực nghiệm, sử
dụng CH2Cl2 có nhiều ưu điểm hơn vì CH2Cl2 ít tạo nhũ với dung dịch kiềm do đó việc tách lớp sẽ dễ dàng hơn nên rút ngắn thời gian chiết. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết luận: CH2Cl2 được lựa chọn là dung môi để chiết xuất alcaloid toàn phần.
Ứng dụng chiết xuất alcaloid từ lá TNHC
Kết quả khảo sát dung môi chiết alcaloid trên được ứng dụng để chiết một lượng lớn lá TNHC (50 kg). Khối lượng cao alcaloid toàn phần thu được từ 50 kg bột lá TNHC là 185,88 g; hiệu suất chiết xuất 0,37%. Cao có thể chất đặc, màu vàng óng, mùi thơm
đặc trưng. Cao alcaloid này được sử dụng để chiết tách các hợp chất alcaloid tinh khiết.
Như vậy qua quá trình thực hiện nội dung thứ nhất, sản phẩm thu được là: - 185 g cao alcaloid.
21
3.2. NỘI DUNG 2: THĂM DÒ ĐIỀU KIỆN TÁCH PHÂN ĐOẠN Yêu cầu cần thực hiện:
Xác định hệ dung môi và điều kiện triển khai sắc ký cho hiệu quả tách tốt nhất.
Kết quả:
Thăm dò hệ dung môi sắc ký:
Bảng 3.2: Một số hệ dung môi khai triển SKLM
STT Hệ dung môi Tỷ lệ Kết quả 1 Cyclohexan : CH2Cl2 9 : 1 Không tách 2 Cyclohexan : CHCl3 1 : 1 Không tách 3 Cyclohexan : CHCl3 2 : 8 Không tách 4 CHCl3 : MeOH : NH4OH đđ 6 : 1 : 0,05 Tách tốt 5 CHCl3 : MeOH : NH4OH đđ 9 : 1 : 0,05 Tách tốt 1 2 3 4 5
Hình 3.1.Sắc ký đồ cao alcaloid toàn phần chiết bằng CH2Cl2 - Mẫu thử: cao alcaloid chiết theo quy trình 2
- Thuốc thử phát hiện: Dragendorff
Kết quả:
Cả hai hệ (4), (5) tách được nhiều vết và đều tách được 8 vết alcaloid, tuy nhiên:
Hệ dung môi: CHCl3 : MeOH : NH4OH đđ (9 : 1 : 0,05)
cho các vết tách ra rõ ràng nhất nên được lựa chọn là hệ dung môi để triển khai SKLM, sắc ký cột.
22
Thăm dò điều kiện tách phân đoạn alcaloid bằng sắc ký cột chân không:
Kiểm tra kết quả bằng sắc ký lớp mỏng
- Mẫu thử: cắn alcaloid thu được từ các phân đoạn sau khi qua cột. - Hệ dung môi khai triển: CHCl3 : MeOH : NH4OH đđ (9 : 1 : 0,05)
Nhận xét
-Quan sát trên SKLM các cột silica gel tẩm đệm pH kiềm (cột 1), tẩm đệm pH acid (cột 2) và cột không tẩm (cột 3) nhận thấy:
Ở tất cả các cột, phân đoạn 1 (Cyclohexan) khi thử phản ứng của alcaloid với thuốc thử Dragendorff và kiểm tra bằng SKLM không phát hiện alcaloid nên không đưa vào sắc ký đồ.
- Cột 1: các vết alcaloid xuất hiện trải đều từ kém phân cực đến phân cực theo thứ tự
từ phân đoạn 2 đến phân đoạn 7, mỗi phân đoạn chỉ có 1 đến 3 vết, không có hiện tượng dồn vết, do đó việc tách phân đoạn cũng như tách các hợp chất alcaloid tinh khiết bằng kỹ thuật sắc ký cột sẽ dễ dàng hơn.
- Cột 2 và cột 3: các vết xuất hiện tương tự nhau, tập trung từ phân đoạn 3 đến phân
đoạn 6, mỗi phân đoạn gồm nhiều vết, nhưng không tách hẳn ra từ kém phân cực đến phân cực theo các phân đoạn. Nếu tiến hành SKC sẽ khó khăn hơn khi tách nhiều alcaloid trong mỗi phân đoạn.
-Silica gel khi được tẩm đệm có pH kiềm sẽ cho các phân đoạn có số vết alcaloid ít hơn và chuyên biệt hơn nên dễ dàng tách thành hợp chất riêng rẽ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả: chọn điều kiện để tách alcaloid qua sắc ký cột chân không:
1. Silicagel trước khi nhồi cột phải được tẩm đện pH ở vùng có pH kiềm.
2. Hệ dung môi được thay đổi độ phân cực tăng dần từ Cyclohexan đến MeOH:
Bảng 3.3 . Các bước thay đổi độ phân cực của dung môi qua sắc ký cột
STT Dung môi 1 Cyclohexan 2 Cyclohexan : CH2Cl2 3 CH2Cl2 4 CHCl3 5 Ethyl acetat 6 Aceton 7 MeOH
23
Kết quả kiểm tra sắc ký lớp mỏng cắn các phân đoạn sau khi qua cột:
Hình 3.2 Sắc ký đồ phát hiện các phân đoạn tách được qua cột (UV 365 nm)
Hình 3.3 Sắc ký đồ phát hiện các phân đoạn tách được qua cột (UV 254 nm)
Hình 3.4 Sắc ký đồ phát hiện các phân đoạn tách được qua cột (hơ iod)
Hình 3.5 . Sắc ký đồ phát hiện các phân đoạn tách được qua cột (TT Dragendorff) TP : cao alcaloid toàn phần; 2, 3, 4, 5, 6, 7: cắn của các phân đoạn sau khi qua cột
24
3.3. NỘI DUNG 3: TÁCH PHÂN ĐOẠN, PHÂN LẬP HỢP CHẤT Yêu cầu cần thực hiện:
Phân lập 100 mg Crinamidin và 50 mg 6-hydroxyrinamidin độ tinh khiết trên 98 %.
Kết quả:
Tách phân đoạn: sau khi triển khai sắc ký cột chân không thu được 9 phân đoạn, các phân đoạn này được đặt tên bằng các chữ cái tương ứng A, B, C, D, E, F, G, H, I.
Bảng 3.4 . Kết quả tách các phân đoạn alcaloid bằng SKC chân không
STT Dung môi Phân đoạn Màu sắc TT Dragendorff
1 Cyclohexan A (A1 - A4) Không màu _
2 Cyclohexan : DCM (9:1) B (B1 – B16) Hơi vàng +++
3 Cyclohexan : DCM (7:3) C (C1 – C14) Hơi vàng +++
4 Cyclohexan : DCM (1:1) D (D1 – D8) Vàng nhạt +++
5 Dichloromethan E (E1 – E18) Vàng +++
6 Chloroform F (F1 - F7) Vàng nhạt +
7 Ethyl acetat G (G1 – G16) Vàng +++
8 Aceton H (H1 – H11) Vàng ++
9 Methanol I (I1 – I9) Vàng đậm ++
(-): vàng; (+): hơi cam; (++): vàng cam; (+++): đỏ cam
Tạo kết tinh:
Phân đoạn G có nhiều phân đoạn nhỏ, sau khi cô thu hồi dung môi các phân đoạn này thấy có xuất hiện kết tinh với các dạng như sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Phân đoạn G1: kết tinh dạng tinh thể hình kim màu trắng trong dung dịch nâu sậm. - Phân đoạn G2: kết tinh thành từng cụm dạng hình cầu gai bám trên thành ống nghiệm.
- Phân đoạn G3 - G4: kết tinh màu trắng, kết thành từng cụm dạng hình cầu gai bám trên thành ống nghiệm.
25
Hình 3.6 Các phân đoạn G xuất hiện kết tinh
3.4. NỘI DUNG 4:
TINH CHẾ SẢN PHẨM – KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT
Tinh chế: bằng cách thay đổi dung môi
Khối lượng kết tinh thu được sau khi tách và tinh chế như sau:
Bảng 3.8 Khối lượng kết tinh thu được của phân đoạn G
Phân đoạn G1 G2 G3 G4
Khối lượng (mg) 200 70 1800 1300
Kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng
Kết quả trên sắc ký đồ:
G1 cho một vết có Rf = 0,45, màu sắc tương đương vết của Crinamidin khi phát hiện bằng Uv và thuốc thử Dragendorff.
G2 cho một vết có Rf = 0,34, màu sắc tương tự của 6 Hydroxycrinamidin khi phát hiện bằng Uv và thuốc thử Dragendorff.
26
UV 365 nm UV 254 nm Dragendorff
Hình 3.7. Sắc ký đồ của kết tinh trong các ống nghiệm phân đoạn G TP : cao alcaloid toàn phần
R : Crinamidin
S: 6-hydroxycrinamidin
G1, G2, G3, G4: các kết tinh từ G1→ G4
Kết luận:
Do G1 và G2 thể hiện độ tinh khiết (1 vêt trên sắc ký đồ) nên chọn kết tinh G1 và G2 tiếp tục tinh chế và kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLHNC.
Kiếm tra độ tinh khiết bằng phương pháp SKLHNC kết tinh G1 và G2:
Kết tinh của phân đoạn G1: sắc ký đồ G1 cho một đỉnh có thời gian lưu là 25,8 phút tương ứng với diện tích đạt 94,36% tính trên tổng diện tích đỉnh của mẫu trên sắc ký
đồ. G1 được tiếp tục tinh chế theo sơ đồ 3.3 và kiểm tra lần thứ hai cho độ tinh khiết là 99,37%. Độ tinh khiết của đỉnh tại thời gian lưu là 100%. (Phụ lục 1)
Kết tinh của phân đoạn G2: sắc ký đồ G2 cho một đỉnh có thời gian lưu là 13,78 phút tương ứng với diện tích đạt 90,36 % tính trên tổng diện tích đỉnh của mẫu trên sắc ký
đồ. G2 được tiếp tục tinh chế theo sơ đồ 3.3 và kiểm tra lần thứ hai cho độ tinh khiết là 98,53 %. Độ tinh khiết của đỉnh tại thời gian lưu là 100%. (Phụ lục 2)
Kết luận:
Sau quá trình phân lập và tinh chế: G1 và G2 được kiểm tra tạp bằng cả 2 phương pháp sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
SKLHNC SKLM Khối lượng (mg)
G1 Tinh khiết 99,37% Đạt 150
27 3.5 NỘI DUNG 5: ĐỊNH DANH SẢN PHẨM Kết quả: Từ các dữ liệu thực nghiệm ở mục 2.5, kết luận: G1 là Crinamidin - C17H19NO5 G2 là 6-hydroxycrinamidin - C17H19NO6
Cấu tạo hóa học của Crinamidin và 6-hydroxycrinamidin
12 11 4a 10a 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 O O N OMe O OH 12 11 4a 10a 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 O O N OMe O OH OH Crinamidin 6-hydroxycrinamidin
3.6 NỘI DUNG 6: XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUI TRÌNH ĐỊNH
LƯỢNG CRINAMIDIN TRONG VIÊN OPCRILATI
Qui trình đạt các yêu cầu thẩm định: tính đặc hiệu, độ đúng, độ lặp lại, khoảng tuyến tính với:
- Khoảng tuyến tính: 0,212 – 42,400 µg/ml.
- Hệ số r2 = 0,9998. Phương trình hồi quy ŷ= 70177x.
28
4. KẾT LUẬN
Sau thời gian thực hiện, đề tài đã đạt được một số kết quả sau:
1. Tham khảo một số tài liệu có liên quan đến đề tài như cây Trinh nữ hoàng cung, alcaloid chi crinum, alcaloid của TNHC, các kỹ thuật sắc ký, chất chuẩn dùng trong phân tích, ...
- Về thực nghiệm đã tiến hành:
2. Khảo sát việc sử dụng dung môi chiết là CH2Cl2 để thay thế chloroform trong việc chiết cao alcaloid, nhờ đó rút ngắn thời gian chờ tách lớp giữa lớp dung môi hữu cơ và lớp dung dịch kiềm.
3. Nghiên cứu ảnh hưởng của việc thay đổi pH của cột lên việc tách alcaloid thành các phân đoạn có thành phần đơn giản. Tuỳ vào mục tiêu tách những hợp chất có độ phân cực khác nhau mà thay đổi pH cột phù hợp.
4.Ứng dụng tách được các phân đoạn alcaloid có thành phần đơn giản bằng SKC chân không với cột tẩm đệm pH kiềm.
5. Bằng kỹ thuật sắc ký cột chân không đơn giản nhưng đã phân lập được:
♦ Một hợp chất kết tinh từ cao alcaloid toàn phần G1 được định danh là Crinamidin.
♦ Một hợp chất kết tinh G2 được định danh là 6-hydroxycrinamidin.
♦ G3 và G4: khối lượng khoảng 2.500 mg vẫn đang được tiếp tục nghiên cứu.
6. Xây dựng và thẩm định qui trình định lượng Crinamidin có trong viên OPcrilati bằng phương pháp SKLHNC. Qui trình cũng đã dược ứng dụng để định lượng Crinamidin lá TNHC, cao TNHC góp phần cho công tác tiêu chuẩn hóa nguyên liệu TNHC.
29
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Võ Văn Chi (1999), “Từđiển cây thuốc Việt Nam”, Nhà xuất bản Y học, tr. 804. 2. Võ Thị Bạch Huệ (1999), “Góp phần nghiên cứu các cây thuốc có tác dụng trị
ung thư – Chuyên khảo cây Trinh nữ hoàng cung”, Luận án Tiến sĩ Dược học, 3. Nguyễn Xuân Hướng, (1998), “Kết quả điều trị 158 bệnh nhân u xơ tiền liệt
tuyến bằng thuốc dân tộc”, Tạp chí y học cổ truyền Việt nam, tr. 4-5.
4. Trần Công Khánh (1998), “Đặc điểm thực vật của cây Hoàng cung trinh nữ
(Crinum latifolium L., Amaryllidaceae)”, Tạp chí dược liệu, 3(3), tr. 67 – 68. 5. Đỗ Tất Lợi (2000), “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, Nhà xuất bản Y (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
học, trang. 511 – 512.
6. Nguyễn Thị Ngọc Trâm và các cộng sự (2000), “Một yếu tố hoạt hoá tế bào lympho T mới invivo và invitro trong chất chiết xuất bằng nước nóng từ lá cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)”, Tạp chí dược học, tr. 8 – 19.
7. Nguyễn Hữu Lạc Thủy, Võ Thị Bạch Huệ (2006), “Phân lập và xác định cấu trúc alcaloid của lá Trinh nữ hoàng cung”, Hội nghị Khoa học công nghệ trẻĐại học Y Dược Tp.HCM lần thứ 19, (10), tr.39-43.
TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI
8. Shibnath Ghosal, Kulwant S. Saini and August W. Frahm “Alkaloids of Crinum
latifolium”, Phytochemistry, Volume 22, Issue 10, Pages 2305-2309 (1983).
9. S.Kobayashhi, T.Tokumoto, Z.Taira, “Latifine, a biogenetic isomer of
Cherrylline from C. latifolium L.”, J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1043-1044,
(1984).
10. S.Kobayashhi, T.Tokumoto, Z.Taira, M. Kihara, Y. Imakura, T. Shingu “aklaoid
constituents of Crinum latifolium and C. bulbisperum amaryllidaceae”, Chem.
Pharm. Bull., 32(8), 3015-3022, (1984).
11. S. Ghosal, S.K Singh, Crinafoline and Crinafolidine, “two antitumor alkaloids from Crinum latifolium L.”, J.Chem. Res. (S), p.312-313, (1986).
12. Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Thi Bach Hue, “The isolation of alkaloids from the
leaves of Crinum latifolium L. Amarllidaceae in Vietnam”, Proceedings of The
LacThuy
Project Name: LacThuy Reported by User: System
Report Method: LacThuy Date Printed:
12363 5/5/2010
Report Method ID: 12363
11:11:48 Asia/Saigon Page: 1 of 4 S A M P L E I N F O R M A T I O N System Acquired By: M18 (6:4) 1 Sample Name: TNHC Sample Set Name:
Unknown Sample Type:
12
Vial: Acq. Method Set: 26_25
1
Injection #: Processing Method: LacThuy
10.00 ul
Injection Volume: Channel Name: 214.0nm
Run Time: 30.0 Minutes Proc. Chnl. Descr.: PDA 214.0 nm
1/29/2010 08:27:54 ICT Date Acquired: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Date Processed: 3/31/2010 14:24:49 ICT
Auto-Scaled Chromatogram T a p a -