Khoá luận tốt nghiệp thuộc bộ môn dược liệu- Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh. Đưa ra quy trình và phương pháp phân lập alcaloid từ cao toàn phần alcaloid của lá trinh nữ hoàng cung. Bằng phương pháp sắc ký và chiết xuất. Cho ra hơn 23 hoạt chất riêng biệt. Tài liệu đầy đủ sắc ký và phổ đồ của hoạt chất mới
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH ∗∗∗ LƯƠNG THỊ HỒNG NHỊ PHÂN LẬP ALCALOID TỪ PHÂN ĐOẠN PHÂN CỰC CỦA CAO ALCALOID TOÀN PHẦN CHIẾT TỪ LÁ TRINH NỮ HOÀNG CUNG Crinum latifolium L.Amaryllidaceae KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC Thành phố Hồ Chí Minh 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH ∗∗∗ LƯƠNG THỊ HỒNG NHỊ PHÂN LẬP ALCALOID TỪ PHÂN ĐOẠN PHÂN CỰC CỦA CAO ALCALOID TOÀN PHẦN CHIẾT TỪ LÁ TRINH NỮ HOÀNG CUNG Crinum latifolium L.Amaryllidaceae KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC Thầy hướng dẫn: ThS NGUYỄN HỮU LẠC THỦY PGS.TS VÕ THỊ BẠCH HUỆ Thành phố Hồ Chí Minh 2014 MỤC LỤC Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học – Năm học 2013 – 2014 PHÂN LẬP ALCALOID TỪ PHÂN ĐOẠN PHÂN CỰC CỦA CAO ALCALOID TOÀN PHẦN CHIẾT TỪ LÁ TRINH NỮ HOÀNG CUNG Crinum latifolium L.Amaryllidaceae Lương Thị Hồng Nhị Thầy hướng dẫn : ThS.Nguyễn Hữu Lạc Thủy PGS.TS.Võ Thị Bạch Huệ Mở đầu đặt vấn đề Lá Trinh nữ hoàng cung từ lâu biết đến có nhiều tác dụng sinh học kháng khối u dùng để điều trị u xơ tử cung, u phì đại lành tính tuyến tiền liệt, dự phòng biến chứng phì đại tuyến tiền liệt Những tác dụng nhiều công trình khoa học chứng minh nhóm hợp chất alcaloid Bộ môn HPTKN tiến hành chiết tách số alcaloid từ TNHC alcaloid alcaloid phân cực đến phân cực trung bình, đề tài tiến hành nhằm mục đích tiếp tục chiết tách alcaloid phân cực mạnh Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu phân đoạn phân cực cao alcaloid toàn phần chiết từ TNHC Phương pháp nghiên cứu tiến hành qua giai đoạn: khảo sát phân đoạn alcaloid tách từ cao ethyl acetat, tách alcaloid phân cực kĩ thuật sắc kí cột chân không pha đảo, xác định cấu trúc alcaloid phân cập phương pháp phổ nghiệm Kết bàn luận Từ phân đoạn phân cực cao alklaoid toàn phần thu alcaloid AL-1 AL-2 AL-1 đo phổ UV, IR, MS, NMR, nhiên cấu trúc AL-1 chưa xác định tiếp tục nghiên cứu AL-2 đo phổ UV, IR, MS tiếp tục tiến hành đo phổ NMR Kết luận Đề tài phân lập tinh chế alcaloid có độ phân cực mạnh AL-1 AL2 tiến hành xác định cấu trúc Al-1 phương pháp phổ nghiệm (UV, IR, MS, NMR) Final essay for the degree of BS Pharm – Academic year 2013 – 2014 ISOLATED ALCALOID FROM THE SEGMENT POLARITY OF THE TOTAL ALCALOID EXTRACTED FROM PLANT Crinum latifolium L.Amaryllidaceae Luong Thi Hong Nhi Supervisor: Master Nguyen Huu Lac Thuy Pro.Ass Vo Thi Bach Hue Introduction Crinum latifolium L has long been known by many biological effects such as antitumor and is used to treat uterine fibroids, benign tumors enlarged prostate, complications from preventive hypertrophic prostate These effects are more scientific work is demonstrated by the group of alcaloids HPTKN Department also conducted a number of extracts and isolated alcaloids from Crinum latifolium L but this alcaloid alcaloids are less polarized and polarizing average, so this topic was conducted for the purpose of extracting and separating continue alcaloid strongly polarized Materials and methods Materals research is polarized segments of high alcaloid extracted from the leaves of Crinum latifolium L full Research methodology is conducted through the stages: survey segments alcaloid isolated from ethyl acetate high, separated by alcaloid polarization technique phase vacuum flash chromatography island structure determination of alcaloids hierarchies by the spectroscopic methods Results and discussion From high fractional polarization of alklaoid total was obtained AL-1 and AL-2 AL-1 has been measuring the UV, IR, MS, NMR, however, AL-1 structure has not yet been identified and are being studied further AL-2 has been measured the UV, IR, MS and is continuing to conduct NMR spectrometer Conclusion Chapter has been isolated and purified the two alcaloids have strong polarization AL-1 and AL-2 and also the determination of the structure of Al-1 by spectroscopic methods (UV, IR, MS, NMR) DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt δ AchE H-1H COSY CHCl3 D Dd DĐVN DEPT HMBC Chữ nguyên Acetylcholinesterase Correlated Spectroscopy Cloroform Doublet doublets of doublet IR J M MS NMR Ppm RP S SKLM STH T Td TT TNHC UV VLC phổ tương quan 1H – 1H đỉnh đôi đỉnh đôi kép Dược điển Việt Nam Distortionless Enhancement by Polarization Transfer Heteronuclear Multiple Bond Correlation HPTKN HSQC Nghĩa Tiếng Việt độ dời hóa học Hóa phân tích kiểm nghiệm Heteronuclear Single Quantum Correlation Infrared Coupling constant Multiplet Mass Spectroscopy Nuclear Magnetic Resonance parts per million Reverse Phase Singlet Triplet Triplet of doublet Ultraviolet Vacuum Liquid Chromatography phổ hồng ngoại số ghép đỉnh đa phổ khối cộng hưởng từ hạt nhân phần triệu pha đảo đỉnh đơn sắc kí lớp mỏng siêu tới hạn đỉnh ba thuốc thử Trinh nữ hoàng cung tử ngoại sắc ký cột chân không DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC LỜI CẢM ƠN Trải qua khoảng thời gian năm học Khoa Dược – Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh, em học hỏi nhiều kiến thức chuyên ngành, kinh nghiệm quý báu từ Quý Thầy Cô Đó hành trang, tảng vững để em thêm vững bước tương lai Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến: Th.S Nguyễn Hữu Lạc Thủy PGS.TS Võ Thị Bạch Huệ Đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian thực đề tài Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Phạm Đông Phương đóng góp ý kiến, giúp cho khóa luận em hoàn thiện Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy TS Nguyễn Viết Kình tận tình giúp đỡ, cho em nhiều lời khuyên quý báu Em xin gửi lời cảm ơn đến Thầy Cô, Anh, Chị, bạn sinh viên Bộ môn Hóa Phân Tích – Kiểm Nghiệm nhiệt tình hỗ trợ, giúp đỡ, động viên em suốt thời gian thực đề tài Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, động viên, chia sẻ em Sinh viên Lương Thị Hồng Nhị TP HCM, tháng 7/2014 10 CHƯƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, khuynh hướng quay trở với điều trị có nguồn gốc từ thiên nhiên đề tài hấp dẫn nhà khoa học Thuốc có nguồn gốc từ dược liệu có giá thành không cao mà có tác dụng trị liệu tương đương với thuốc tân dược thường có nhiều độc tính tác dụng phụ Đối với Việt Nam, quốc gia có thực – động vật phong phú thuận lợi vô lớn cho trình tìm kiếm vị thuốc Trong năm 80, nhà khoa học khắp giới bắt đầu biết đến tác dụng trội họ dược liệu Amaryllidaceae, chi Crinum Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium) Lá TNHC có nhiều tác dụng sinh học kháng khuẩn, kháng viêm, kháng khối u dùng điều trị u xơ tử cung, u phì đại tuyến tiền liệt lành tính, tác dụng làm giảm chấm dứt triệu chứng rối loạn tiểu tiện, dự phòng biến chứng phì đại tuyến tiền liệt nghiên cứu Gần đây, nhiều báo quốc tế có đề cập tới hoạt tính kháng AchE (invitro) thuộc chi Crinum hướng đến tác dụng chất thuộc nhóm alcaloid Tuy nhiên, hợp chất tự nhiên TNHC nhiều đa dạng (các hợp chất alcaloid, flavonoid, coumarin, phytosterol) nên việc chiết tách alcaloid tinh khiết thường gặp nhiều khó khăn Trong năm vừa qua, nhóm nghiên cứu TNHC Bộ môn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm cố gắng tiến hành chiết tách số alcaloid từ TNHC từ phân cực đến phân cực trung bình.Theo hướng đó, nhằm tiếp tục chiết xuất phân lập alcaloid phân đoạn phân cực, thực đề tài : “Phân lập alcaloid từ phân đoạn phân cực cao alcaloid toàn phần chiết từ TNHC (Crinum latifolium L Amaryllidaceae)” với mục tiêu sau : 57 Hình 1.1.1.1.6.1.10 Phổ HMBC (MeOD, máy 500 MHz) AL-1 Với thông tin khai thác AL-1 (C16H19NO3 = 273) có: - nhóm CH3, có khả CH2−N−CH3 - nhóm CH2, có −CH2O− có −N−CH2 CH2 sp3 - nhóm CH, có cặp =CH− kế cận vòng ( vòng thơm?) với J = Hz nhóm CH−O có δC downfield mạnh (tới 89.4 ppm) −CHO− H lân cận (δH 4.76 s) - nhóm ceton CIV khác, CIV chỉ có CIVsp3 (δC 49.5 ppm) Còn lại CIV thuộc vòng thơm với C IV gắn oxy (δC 147.4 142.1 ppm) AL-1 không có: - Nhóm methylendioxy vòng - OMe, ester - CMe, lacton Số vòng + số ∆ AL-1 Ω = Với (1× CH3) + (5×CH2) + (3×CH) + ( 6×CIV) + (1 ceton) AL-1 xuất C16H16NO, lại 3H 2O 2O phải ở vòng thơm (C2 C3) phải có O−CH2 (C10) Với chi tiết tra cứu tất công thức alcaloid TNHC nói riêng alcaloid chi Crinum họ Amaryllidaceae nói chung chưa thấy công thức phù hợp với AL-1 Việc tra cứu liệu thư viện phổ máy Bruker Avance 500 (Viện Hóa học Hà Nội) chưa gặp cấu trúc phù hợp Việc khảo sát công thức hóa học AL-1 tiếp tục 1.1.6 Khảo sát cấu trúc AL-2 Mở đầu 58 AL-2 alcaloid phân cực mạnh, thuộc phân đoạn phân cực tách từ cao ethyl acetat cao alcaloid toàn phần chiết từ TNHC Mô tả AL-2 kết tinh (trong MeOH) dạng tinh thể hình kim không màu AL-2 tan n-butanol, methanol Tính chất -Khi SKLM silica gel (Merck) với nhiều hệ dung môi, AL-2 cho vết Vết mỏng cho vết phát quang màu xanh UV 365, tắt quang rõ UV 254, cho màu đỏ cam với thuốc thử Dragendorff UV 365 UV 254 TT Dragendorff Hình 1.1.1.1.6.1.11 Sắc kí đồ AL-2 Dung môi Cloroform – Methanol – Amoniac (1:1:0,05) -Phổ UV (MeOH) AL-2 cho λ max ở 289 nm -Phổ IR (KBr) AL-2 cho band dao động hydroxy (3423), nhóm chức carbonyl (1706) 59 -Phổ khối EI-MS+ AL-2 cho phân mảnh có m/z 290, 312 phù hợp với phân mảnh cấu trúc có M = 289 Hình 1.1.1.1.6.1.12 Phổ UV (MeOH) AL-2 Hình 1.1.1.1.6.1.13 Phổ IR (KBr) AL-2 60 Hình 1.1.1.1.6.1.14 Phổ EI-MS+ AL-2 1.12 BÀN LUẬN Về tách phân đoạn sắc ký cột chân không với chất hấp phụ silica gel pha đảo - Tiến hành sắc ký cột chân không với silica gel pha đảo tiết kiệm dung môi hữu cơ, dung môi dùng nước – acid acetic (98:2), độc hại Đồng thời, alcaloid cần phân lập alcaloid có độ phân cực mạnh nên với kĩ thuật sắc kí cột chân không pha đảo khỏi cột ở thời gian sớm hơn, tiết kiệm nhiều thời gian công sức -Vì lượng cao toàn phần phân cực (0,8 g) nên triển khai kĩ thuật sắc kí cột chân không pha thuận bị hấp phụ phần, làm giảm hiệu suất tách alcaloid nhiều lần -Đối với dịch chiết cloroform dịch chiết n-butanol, phân đoạn sau (những phân đoạn không gộp lại để phân lập tinh chế alcaloid) chứa lượng cao có nhiều tạp phân cực nên không gộp lại Về biện giải cấu trúc AL-1, AL-2 -AL-1 xác định hết tất liệu phổ thời gian ngắn giải xác cấu trúc AL-1 Cho đến nay, chưa có tài liệu chi Crinum công bố liệu phổ NMR chất trùng với AL-1 Do đó, có khả AL-1 chất phân lập từ TNHC nói riêng chi Crinum nói chung 61 -AL-2 lượng chất tinh khiết không đủ để đo phổ NMR nên biện giải cấu trúc 62 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1.13 KẾT LUẬN Sau thời gian thực khóa luận, đề tài đạt số kết sau: Tham khảo số tài liệu có liên quan đến đề tài TNHC thành phần alcaloid có cây, nhóm hợp chất alcaloid, kỹ thuật chiết xuất, kỹ thuật sắc ký cột cổ điển, sắc ký cột chân không, sắc ký lớp mỏng phương pháp xác định hợp chất hữu Về thực nghiệm, đề tài đạt số kết phù hợp với mục tiêu ban đầu sau: - Tách 0.8 g cao methanol toàn phần kĩ thuật sắc kí cột chân không pha đảo thu cao có chứa alcaloid có độ phân cực mạnh cao - cloroform cao n-butanol Phân lập tinh chế alcaloid có độ phân cực mạnh từ cao cloroform - cao n-butanol, AL-1 AL-2 Xác định cấu trúc AL-1 phương pháp phổ nghiệm (UV, IR, MS, NMR) 1.14 ĐỀ NGHỊ Nếu tiếp tục tiến hành đề tài, sẽ: -Dùng Xray để biện giải cấu trúc AL-1 -Tiến hành đo phổ NMR AL-2, sau biện giải cấu trúc AL-2 -Tiến hành phân lập alcaloid từ phân đoạn lại để bổ sung thêm vào danh sách alcaloid chiết từ TNHC trồng Việt nam - Tiến hành phân lập alcaloid đơn chất với khối lượng lớn dùng làm chất chuẩn - Thử nghiệm tác dụng dược lý tác dụng sinh học hợp chất alcaloid tinh khiết phân lập (đặc biệt phân đoạn phân cực mạnh)để chứng minh hoạt tính alcaloid chiết từ TNHC TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập II, NXB Khoa học Kĩ thuật, Hà Nội, tr 1018-1020 [2] Võ Văn Chi, (2003), Từ điển thực vật thông dụng, Tập I, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr 265, 787-789 [3] Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, Quyển III, Nhà xuất trẻ Tp HCM, tr 500 [4] Võ Thị Bạch Huệ (1999), Góp phần nghiên cứu thuốc có tác dụng trị ung thư – Chuyên khảo Trinh nữ hoàng cung, luận án Tiến sĩ dược học, trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh [5] Trần Công Khánh (1998), “Đặc điểm thực vật Hoàng cung trinh nữ (Crinum latifolium L., Amaryllidaceae)”, Tạp chí Dược liệu, 3, 1998, tr 67-68 [6] Phạm Thanh Kỳ (2007), Dược liệu học, tập II, NXB Y học, Hà Nội, tr 14-16 [7] Đỗ Tất Lợi (2000), Những thuốc vị thuốc Việt Nam,NXB Y học, Hà Nội, tr 511-512 [8] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Khối phổ phổ cộng hưởng từ hạt nhân, NXB Đại học Quốc Gia Tp.HCM [9] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học Quốc Gia Tp.HCM [10] Nguyễn Hồng Thiên Thanh (2011), Chiết tách phân lập alcaloid từ cao Trinh nữ hoàng cung, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học, tr [11] Phạm Thiệp, Lê Văn Thuần, Bùi Xuân Chương (2000), Cây thuốc, thuốc biệt dược, NXB Y học, tr 315-316 [12] Nguyễn Hữu Lạc Thủy, Nguyễn Thị Thuận, Trần Phi Hoàng Yến, Võ Thị Bạch Huệ (2012), “Khảo sát tác động kháng suy giảm trí nhớ theo hướng kháng cholinesterase cao chiết từ Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L Amaryllidaceae) chuột nhắt trắng”, Tạp chí Dược học, 437, tr 17-24 [13] Nguyễn Hữu Lạc Thủy, Võ Thị Bạch Huệ (2006), “Phân lập xác định cấu trúc alcaloid Trinh nữ hoàng cung”, Báo cáo Hội nghị Khoa học công nghệ trẻ Đại học Y Dược Tp HCM lần thứ 19, 10, tr 39-43 [14] Nguyễn Hữu Lạc Thủy, Võ Thị Bạch Huệ, Nguyễn Minh Vương, Nguyễn Lê Việt Tuyền(2005), "Phân lập xác định cấu trúc số alcaloid Trinh nữ hoàng cung Crinum latifolium L Amaryllidaceae", Hội nghị Khoa học công nghệ hóa hữu toàn quốc, (3), tr 426-429 [15] Bộ môn Dược liệu −Trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh (2006), Giáo trình nhận thức dược liệu, tr 188-189 [16] Bộ môn Dược liệu −Trường Đai học Y Dược TP Hồ Chí Minh (2006), Phương pháp nghiên cứu dược liệu, tr 51–104 [17] Bộ môn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm −Trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh (2007), Giáo trình hóa phân tích, tập I, tr 112-127 TÀI LIỆU TIẾNG ANH [18] Adewusi E,A, et al, (2012), “Cytotoxicity and AChEI activity of an isolated crinine alcaloid from Boophane disticha (Amaryllidaceae)”, Journal of Ethnopharmacology, 143, 572-578 [19] C W Fenell, J Van Staden (2001), “Crinum species in traditional and modern medicine”, Journal of Ethnopharmacology, 78, 15-26 [20] E Zvetkova, et al (2001), “Aqueous extracts of Crinum latifolium and Camellia sinensis”,International Immunopharmacology, 2143–2150 [21] GhosalS et al(1986), “Crinafoline and Crinafolidine, two anti-tumor alcaloids from Crinum latifolium”, Journal Chemical Research, S, 312 – 313 [22] Istvan Zupko, Borvala Rethy, Judit Hohmann, Joseph Molnar, Imre Ocsovszki and George Falkay (2009), “Antitumor activity of alcaloids derived from Amaryllidaceae species”, in vivo230, 41-48 [23] James McNulty a, Jerald J Nair (2009), “Structure-activity studies on the lycorine pharmacophore: A potent inducer of apoptosis in human leukemia cells”, Phytochemistry, 70, 913–919 [24] John Refaat, Mohamed S Kamel, Mahmoud A, Ramadan and Ahmed A Ali (2012), “Crinum; an endless source of bioactive principles: a review, Part II,Crinumalcaloids: Crinine-type Alcaloids”,International Journal of Pharmaceutical sciences and research, 3(9), 3091-3100 [25] Marcel Jenny, Angela Wondrak (2011), “Crinum Latifolium Leave Extracts Suppress Immune Activation Cascades in Peripheral Blood Mononuclear Cells and Proliferation of Prostate Tumor Cells”,Scientia Pharmaceutica, 79, 323– 335 [26] Nguyen H, NAM and You Y, JAE (2009), “NF-κB Inhibitory Activities of the Methanol Extracts and some Constituents there in of some Vietnamese Medicinal Plants”, Scientia Pharmaceutica, 77, 389–399 [27] Nguyen H.N, et al., (2004), “New constituents from Crinum latifolium with inhibitory effects against tube-like formation of human umbilical venous endothelial cell”, Natural Product Research, 18(6), 485-491 [28] Nguyen T.N.Tram, et al., (2002), “Review Crinum L.(Amaryllidaceae)”, Fitoterapia, 73, 183-208 [29] Nguyen Thi Ngoc Tram, I Yanchev, E Zvetkova, J Dineva, E Katzarova, P Shalamanov G Kostov, D Svilenov, I Ilieva (2001), “Retarded growth of chemically induced with 20-methylcholanthrene tumours in rats under the action of cold-hot aqueous extracts ( decoctions ) from Vietnamese plant Crinum latifolium ( L )” Experimental Pathology And Parasitology, 9–12 [30] Shibnath Ghosal, Kulwant S, Saini and August W,Frahm (1983), “Alcaloids of Crinum Latifolium”, Phytochemistry, 22(10), 2305 – 2309 [31] Shibnath Ghosal, Kulwant S, Saini and Sushma (1985), “Crinumalcaloids: their chemistry and biology”, Phytochemistry, 24(10), pp 2141 – 2156 [32] Shibnath Ghosal, Sankara Unnikrishnan and Sushil K,Singh (1989), “Occurrence of two epimeric alcaloids and metabolism compared with lycorine in Crinum latzfolzum”, Phytochemistry, 28(9), 2585 – 2587 [33] Susana Lo´pez, Jaume Bastida, Francesc Viladomat, Carles Codina (2002), “Acetylcholinesterase inhibitory activity of some Amaryllidaceae alcaloids and Narcissus extracts”, Life Science,71, 2521–2529 [34] Tram NG TH NG.,et al (2002) “GC-MS of Crinum latifolium L.Alcaloids”, Z naturforsch, 57c, pp 239-242 PHỤ LỤC PHÂN ĐOẠN PHÂN CỰC CỦA CAO ALCALOID Chiết cao alcaloid toàn phần từ TNHC phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn Bột TNHC CO2 / Cồn 96% Bã dược liệu Ngấm kiệt cồn 50% + HCl 1% Dịch chiết cồn – acid - dd NH4OH đđ, pH - Lắng, lọc - BM đến 1/3 thể tích Dịch lọc - dd NH4OH đđ, pH 9-10 - Chiết CHCl3 Dịch CHCl3 Thu hồi dung môi Cao alcaloid sau SFE Dịch chiết SFE Thu hồi dung môi Cao SFE HCl 1% Siêu âm, lọc Dịch acid - dd NH4OH đđ, pH 9-10 - Chiết CHCl3 Dịch CHCl3 Thu hồi dung môi Cao alcaloid toàn phần Hình PL1.1 Sơ đồ chiết cao alcaloid toàn phần phương pháp SFE Từ 100 kg bột TNHC thu 10 kg cao STH Sau đó, chiết 150g cao ALSTH hiệu suất chiết 0,15% Hình PL1.2 Cao alcaloid toàn phần Hình PL1.3 Vết cao alcaloid toàn phần Dung môi khai triển cloroform-methanol– ammoniac (9:1 : 0,05) Nhận xét : Cao chất vàng óng, đồng có mùi thơm đặc trưng Tách phân đoạn alcaloid phân cực phương pháp phân bố lỏng – lỏng Hòa g cao alcaloid toàn phần vào 20 ml dung môi chọn: n-hexan, ether ehtylic, cloroform ethyl acetat Lọc lấy dịch chiết, cắn sau lọc thực lặp lại lần Dịch lọc thu hồi dung môi để cao alcaloid tương ứng với loại dung môi Kiểm tra dịch chiết cao phương pháp sắc kí lớp mỏng Hình PL1.4 SKLM để kiểm tra dịch chiết từ cao alcaloid toàn phần Dung môi khai triển aceton – cloroform – ammoniac (10: 3: 0,05) Vết 1: dịch chiết ethyl acetat Vết 2: dịch chiết cloroform Vết 3: dịch chiết erther ethylic Vết 4: dịch chiết n-hexan Tách phân đoạn alcaloid phân cực kĩ thuật sắc kí cột chân không pha thuận Điều kiện tiến hành: - Cột thủy tinh đường kính 50 x cm - Mẫu phân tích: g cao ethyl acetat - Chất hấp phụ: 90 g silica gel (Merck) cỡ hạt 0,015 - 0,04 mm - Dung môi khai triển: n-hexan, hỗn hợp n-hexan cloroform, cloroform methanol Các bước tiến hành: - Nạp chất hấp phụ silica gel pha thuận lên cột ổn định cột 250 ml n-hexan - Nạp mẫu theo phương pháp nhồi cột khô - Khai triển cột hệ dung môi có độ phân cực tăng dần dần: n-hexan, hỗn hợp n-hexan cloroform, cloroform methanol - Hứng phân đoạn, phân đoạn 20 ml Kết quả: Qua trình tách phân đoạn alcaloid kĩ thuật sắc kí cột chân không pha thuận với hệ dung môi có độ phân cực tăng dần thu 25 phân đoạn ... [12] Bảng 1.1.1.1.1 Các alcaloid phân lập từ TNHC STT 10 11 12 Tên khoa học Buphanidrin Powellin Ambellin 6-hydroxybuphanidrin 6-hydroxypowellin Undulatin Crinamidin 6-hydroxyundulatin 1β,2β-epoxyambellin... 1,2-epoxy-6-ethoxy3,7-dimethoxycrinin vết 3: 6-ethoxybuphanidrin vết 4:augustamin vết 5: undulatin vết 6: 6-hydroxyundulatin vết 7: 6-hydroxybuphanidrin vết 8: crinamidin vết 9: 6-hydroxycrinamidin