Chủng xạ khuẩn SS004 cho thấy hoạt tính kháng khuẩn đa dạng trên nhiều loại môi trường nuôi cấy khác nhau. Đáng chú ý là trên môi trường FM3, chủng Streptomyces này kháng lại cả những vi khuẩn kháng kháng sinh. Điều này mở rộng hướng nghiên cứu và ứng dụng trong lĩnh vực kháng khuẩn của chủng Streptomyces nội sinh này trong tương lai.
TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SỐ T5- 2017 Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn chủng xạ khuẩn nội sinh Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium) Trương Minh Phụng Lê Thị Thúy Hằng Trung Tâm Nghiên cứu Ứng dụng Sinh học Phạm Thị Hảo Nguyễn Thị Huỳnh My Nguyễn Hoàng Chương Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM (Bài nhận ngày 22 tháng 05 năm 2016, nhận đăng ngày 28 tháng 11 năm 2017) TÓM TẮT Từ Trinh nữ hồng cung (Crinum latifolium) chúng tơi phân lập ba chủng xạ khuẩn nội sinh Kết khảo sát kháng khuẩn sơ cho thấy ba chủng xạ khuẩn thể hoạt tính kháng khuẩn môi trường phân lập SFM Kết định danh chủng xạ kh̉n có hoạt tính kháng kh̉n cho thấy chủng Streptomyces diastaticus subsp ardesiacus Hoạt tính kháng khuẩn bắt đầu xuất thời điểm sau 18 nuôi cấy cho thấy sinh tổng hợp chất kháng khuẩn điều hòa theo thời gian phát triển biệt hóa Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy sinh tổng hợp chất kháng khuẩn cho thấy hàm lượng chất kháng khuẩn sinh tổng hợp nhiệt độ 28 oC cao so với 37 oC Cuối cùng, chủng xạ khuẩn SS004 cho thấy hoạt tính kháng khuẩn đa dạng nhiều loại môi trường nuôi cấy khác Đáng ý môi trường FM3, chủng Streptomyces kháng lại vi khuẩn kháng kháng sinh Điều mở rộng hướng nghiên cứu ứng dụng lĩnh vực kháng khuẩn chủng Streptomyces nội sinh tương lai Từ khóa: Streptomyces, kháng khuẩn, Trinh nữ hoàng cung, vi khuẩn nội sinh MỞ ĐẦU Các chất chuyển hóa thứ cấp có nguồn gốc từ Streptomyces có nhiều hoạt tính sinh học kháng khuẩn, kháng phân bào, kháng nấm, ức chế miễn dịch, kháng côn trùng Hai phần ba số thuốc kháng sinh sử dụng người động vật có nguồn gốc từ nhóm xạ khuẩn, điều cho thấy tầm ứng dụng lớn xạ khuẩn sản xuất thuốc kháng khuẩn có nguồn gốc vi sinh vật [1] Phần lớn chủng xạ khuẩn phân lập từ môi trường đất thuộc nhiều thành phần khác nhau, phần lại phân lập từ mơi trường biển, sông hồ gần phân lập từ thực vật, đặc biệt thực vật sử dụng dược liệu y học dân gian [2] Các chủng vi sinh vật nội sinh, đặc biệt Streptomyces bắt đầu nghiên cứu mạnh năm gần cho thấy có tiềm lớn lĩnh vực sản sinh chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học [3] Đặc biệt, có giả thuyết chất có hoạt tính sinh học biết thuốc có nguồn gốc từ vi sinh vật nội sinh Ngồi ra, có giả thuyết có trao đổi gene thực vật vi sinh vật nội sinh thực vật, có gene liên quan đến việc tổng hợp hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học [2] Như vậy, kho tàng chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học từ chủng vi sinh vật nội sinh nói chung Streptomyces nội sinh nói riêng chờ khám phá khai Trang 69 Science & Technology Development, Vol 5, No.T20- 2017 thác Điều đặc biệt có ý nghĩa lĩnh vực kháng khuẩn tình trạng vi khuẩn đề kháng kháng sinh trở nên nghiêm trọng nhu cầu cho kháng sinh cấp thiết Ở Việt Nam, Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium) sử dụng từ lâu dân gian để điều trị loại bệnh khác nhau, đặc biệt ung thư, chất chuyển hóa thứ cấp Có khả lớn chủng vi sinh vật nội sinh Trinh nữ hồng cung có khả sản sinh chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học q Ngồi ra, chất chuyển hóa thứ cấp có khả có nhiều hoạt tính sinh học lúc kháng khuẩn kháng ung thư [4, 5] Vì vậy, chúng tơi định nghiên cứu phân lập chủng xạ khuẩn nội sinh từ Trinh nữ hồng cung nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn từ chủng xạ khuẩn với hy vọng tìm hợp chất kháng khuẩn nhằm đối phó với tình trạng kháng kháng sinh vi khuẩn VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Cây Trinh nữ hoàng cung thu hái thiên nhiên Các hóa chất sử dụng đề tài cung cấp Prolabo Merck Master mix PCR cung cấp Qiagen Cặp primer nhân gen 16S rRNA 27F-1495R tổng hợp cung cấp IDTDNA Các chủng vi sinh vật thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn cung cấp Trung tâm Nghiên cứu Ứng dụng Sinh học Các chủng vi sinh vật nghiên cứu chủng vi sinh vật gây bệnh người gồm hai nhóm: nhóm khơng kháng kháng sinh nhóm kháng kháng sinh Danh sách vi sinh vật thử nghiệm cung cấp chi tiết phần kết thảo luận NaOCl % phút theo sau bước rửa với dung dịch Na2S2O3 % 10 phút để trung hòa tác động NaOCl Bước rửa phận Trinh nữ hoàng cung với dung dịch ethanol 70 % phút theo sau rửa lại với nước vô trùng Cuối cùng, rửa phận dung dịch NaHCO3 10 % 10 phút Các bước thu nhận chủng Streptomyces nội sinh từ thực vật tham khảo cơng trình Qin cộng năm 2009 [6] Các phận sau xử lý vô trùng nghiền nát nước muối sinh lý để giải phóng vi sinh vật nội sinh Dịch nghiền trải mơi trường SFM bổ sung nalidixic acid (30 µg/mL), cycloheximide (50 µg/mL) nystatin (50 µg/mL) Ủ đĩa mơi trường chứa dịch nghiền 28 oC ngày Tiến hành cấy chuyền làm khuẩn lạc đặc trưng cho nhóm xạ khuẩn giữ bào tử chủng xạ khuẩn dung dịch glycerol 30 % –20 oC Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn chủng xạ khuẩn phương pháp khuếch tán kháng sinh thạch Cấy chủng xạ khuẩn làm môi trường SFM lỏng lắc nhiệt độ phòng ngày Sau ngày, môi trường nuôi cấy ly tâm để thu phần dịch không chứa sinh khối xạ khuẩn Cho 100 µL dịch vào lỗ đục sẵn đĩa môi trường MHA chứa vi sinh vật thử nghiệm khác Sau đó, ủ đĩa thạch thử nghiệm 37 oC qua đêm Tiến hành ghi nhận kết kháng khuẩn thông qua việc đo kích thước vòng vơ khuẩn xuất mặt đĩa thạch chứa vi sinh vật thử nghiệm Phân lập chủng xạ khuẩn nội sinh từ Trinh nữ hoàng cung Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ hoạt tính kháng khuẩn chủng xạ khuẩn nội sinh Sau thu hái tự nhiên, phần thân, rễ, lá, củ Trinh nữ hoàng cung rửa với nước máy để loại bỏ đất, cát Sau đó, phận rửa tiếp tục với dung dịch Tween 20 % vài giây, sau rửa với nước cất vô trùng Các phận rửa với dung dịch Chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn ni cấy môi trường SFM lỏng 28oC 37oC Sau đó, tiến hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn phương pháp khuếch tán thạch Ở nhiệt độ, thí nghiệm lặp lại lần Trang 70 TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SỐ T5- 2017 Khảo sát thời gian tổng hợp chất kháng khuẩn chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn Chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn ni cấy mơi trường SFM lỏng nhiệt độ phòng Dịch ni cấy trích thời điểm h, 12 h, 18 h, 24 h, 30 h, 36 h, 42 h, 48 h kể từ thời điểm bắt đầu nuôi cấy Các dịch vi khuẩn thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn phương pháp đục lỗ Ở thời điểm khảo sát, thí nghiệm lặp lại lần tách chiết DNA xạ khuẩn phương pháp đun sôi DNA sử dụng làm mẫu để nhân đoạn gene 16S rRNA với cặp primer 27F-1495R phương pháp PCR Sản phẩm PCR 16S rRNA tinh giải trình tự nucleotide Trình tự nucleotide 16S rRNA SS004 hiệu chỉnh phần mềm BioEdit Cây phát sinh chủng loại dựa 16S rRNA xây dựng với phần mềm MEGA6 Xử lý thống kê Khảo sát ảnh hưởng môi trường nuôi cấy khả sinh chất kháng khuẩn chủng xạ khuẩn Các kết kháng khuẩn biểu diễn vòng kháng khuẩn xử lý công cụ Excel với công cụ tương ứng Chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn cấy loại môi trường lỏng khác bao gồm: SFM, FM3, SS, GSB, ISP1, ISP2 Sau ngày nuôi cấy, dịch môi trường nuôi cấy thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn phương pháp đục lỗ mơ tả Ở mơi trường ni cấy, thí nghiệm lặp lại lần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Định danh phân tử chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn Chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn nuôi cấy môi trường SFM ngày nhiệt độ phòng Sau đó, thu nhận sinh khối xạ khuẩn Kết phân lập chủng xạ khuẩn nội sinh từ Trinh nữ hoàng cung Từ Trinh nữ hồng cung, chúng tơi phân lập ba chủng xạ khuẩn ký hiệu SS004, SS005 SS006 Các chủng xạ khuẩn sau phân lập làm mơi trường SFM Hình dạng ba chủng xạ khuẩn môi trường SFM [7] trình bày Hình Các khuẩn lạc có kích thước 2x2 cm Hình Hình Khuẩn lạc sau làm SS004, SS005, SS006 Chủng SS004 phân lập từ củ Trinh nữ hồng cung Khuẩn lạc SS004 mơi trường SFM có màu xám, rìa cưa, bào tử dạng phấn, bề mặt khô Chủng SS005 phân lập từ rễ Trinh nữ hồng cung Khuẩn lạc SS5 mơi trường SFM có màu xám trắng, mép tròn đều, bào tử dạng phấn, bề mặt khô Chủng SS6 phân lập từ rễ Trinh nữ hoàng cung Khuẩn lạc SS006 mơi trường SFM có màu xám trắng, mép chia thùy, bào tử dạng phấn, bề mặt ướt Tất khuẩn lạc SS004, SS005 SS006 có hình dạng bên ngồi tương đồng với hình dạng đặc trưng chủng xạ khuẩn có cấu tạo dạng sợi liên kết với tạo thành khuẩn lạc với nhiều màu sắc khác Các sợi Trang 71 Science & Technology Development, Vol 5, No.T20- 2017 chia thành hai loại khác biệt sợi chất cắm sâu vào môi trường dinh dưỡng sợi khí sinh hình thành nên bề mặt xạ khuẩn sợi phát sinh bào tử Khuẩn lạc xạ khuẩn thường rắn chắc, xù xì, có dạng da, dạng phấn, dạng nhung, dạng vơi tùy thuộc vào kích thước bào tử Khuẩn lạc thường có dạng phóng xạ Như vậy, chúng tơi phân lập ba chủng xạ khuẩn từ Trinh nữ hoàng cung ba chủng khảo sát thí nghiệm Kết khảo sát sơ hoạt tính kháng khuẩn Ba chủng xạ khuẩn khảo sát khả sinh hoạt chất kháng khuẩn phương pháp khuếch tán thạch Các chủng vi sinh vật thử nghiệm hoạt tính bao gồm: Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteritica, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Candida albicans Các chủng vi sinh vật đại diện cho nhóm vi khuẩn Gram âm, Gram dương, trực khuẩn, cầu khuẩn, xoắn khuẩn vi nấm Kết kháng khuẩn ba chủng xạ khuẩn SS004, SS005, SS006 trình bày Bảng SS004 SS005 SS006 - + - - + - - Vibrio cholerae Staphyloco ccus aureus Salmonella enteritica + - Pseudomo nas aeruginosa + - Escherichi a coli Candida albicans Xạ khuẩn Bacillus subtilis VSV khảo sát Enterococ cus faecalis Bảng Kết khảo sát sơ hoạt tính kháng khuẩn SS004, SS005, SS006 - (-): khơng có hoạt tính kháng kh̉n; (+): có hoạt tính kháng kh̉n Kết Bảng cho thấy có chủng xạ khuẩn SS004 thể hoạt tính kháng khuẩn số vi sinh vật khảo sát Điều cho thấy hợp chất kháng khuẩn SS004 sinh môi trường SFM có phổ hoạt tính rộng có tác dụng nhiều loại vi khuẩn khác với vi nấm Candida albicans Hai chủng xạ khuẩn SS005 SS006 khơng thể hoạt tính kháng khuẩn mơi trường SFM Như vậy, SS004 chủng xạ khuẩn tiềm sinh chất kháng khuẩn nên chọn nghiên cứu Định danh phân tử chủng xạ khuẩn Để định danh phân tử chủng xạ khuẩn SS004, sử dụng phương pháp xây dựng phát sinh chủng loại (phylogenetic tree gen 16S rRNA DNA gene tách chiết từ SS004 nhân với cặp primer 27F-1495R [8] phản ứng PCR để thu nguyên liệu cho giải trình tự nucleotide Kết PCR trình bày Hình Hình Kết nhân đoạn gene 16S rRNA SS004 Trang 72 TAÏP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SỐ T5- 2017 Giếng 1: thang DNA 100 bp Giếng 2: sản phẩm PCR DNA gene SS004 với cặp primer 27F1495R Kết điện di Hình cho thấy thu sản phẩm có kích thước khoảng 1,5 kb mong đợi Khơng có vạch sản phẩm ký sinh cho thấy phản ứng PCR có độ đặc hiệu cao Sản phẩm PCR tinh để giải trình tự nucleotide phương pháp Sanger Chúng thực giải trình tự nucleotide sản phẩm PCR 16S rRNA từ SS004 theo hai chiều Sau đó, hiệu chỉnh trình tự nucleotide giải dựa tín hiệu huỳnh quang phần mềm BioEdit kết hợp với so sánh liệu 16S rRNA chủng xạ khuẩn GenBank Đoạn trình tự nucleotide gene 16S rRNA SS004 sau giải hiệu chỉnh sử dụng để xây dựng phát sinh chủng loại bước Để xây dựng phát sinh chủng loại nhằm định danh SS004, chúng tơi thu thập trình tự nucleotide 16S rRNA 1000 chủng xạ khuẩn GenBank Các trình tự sử dụng với trình tự 16S rRNA SS004 để xây dựng nên phát sinh chủng loại nhằm định danh phân tử chủng xạ khuẩn SS004 Phương pháp xây dựng phát sinh loài tiến hành với phần mềm MEGA6 Kết định danh phân tử SS004 trình bày Hình Hình Kết xây dụng phát sinh loài nhằm định danh phân tử chủng xạ khuẩn SS004 Kết từ phát sinh chủng loại cho thấy SS004 có tương đồng cao với chủng xạ khuẩn Streptomyces diastaticus subsp ardesiacus với tỷ lệ bootstrap lên đến 96 % Kết khẳng định SS004 xạ khuẩn Tuy nhiên để khẳng định SS004 có phải Streptomyces diastaticus subsp ardesiacus hay khơng cần thực thêm thí nghiệm khảo sát mặt vi sinh, sinh hóa kết chụp hình kính hiển vi điện tử Khảo sát thời gian sinh chất kháng khuẩn chủng SS004 Để khảo sát thời điểm sinh chất kháng khuẩn, SS004 nuôi cấy môi trường SFM lỏng Mẫu thu thời điểm h, 12 h, 18 h, 24 h, 30 h, 36 h, 42 h, 48 h kể từ thời điểm bắt đầu ni cấy khảo sát hoạt tính kháng khuẩn mơi trường MHA Kết trình bày Hình Hình Khảo sát thời gian sinh chất kháng khuẩn SS004 Trang 73 Science & Technology Development, Vol 5, No.T20- 2017 Kết Hình cho thấy SS004 bắt đầu sinh hợp chất kháng khuẩn sau 18 h kể từ bắt đầu nuôi cấy hợp chất kháng khuẩn đạt nồng độ bão hòa mơi trường lỏng sau 30 h trở Kết chứng tỏ việc sinh chất kháng khuẩn điều hòa biểu chủng SS004 Ở Streptomyces, hợp chất kháng khuẩn thường nhóm gene (gene cluster) chịu trách nhiệm sinh tổng hợp gen nhóm chịu kiểm sốt nhân tố bên lẫn bên cluster Việc sinh hợp chất kháng khuẩn Streptomyces thường xảy giai đoạn sau q trình tăng trưởng có thay đổi mặt hình dạng từ dạng khuẩn ty sơ cấp sang khuẩn ty thứ cấp hình thành bào tử Kết cần thiết cho nghiên cứu sinh tổng hợp đặc biệt điều hòa sinh tổng hợp chất kháng khuẩn SS004 sau Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ khả sinh chất kháng khuẩn chủng SS004 Nhiệt độ nhân tố có ảnh hưởng đến sản sinh chất chuyển hóa thứ cấp Streptomyces Ảnh hưởng nhiệt độ lên việc sinh chất kháng khuẩn SS004 cách nuôi cấy SS004 môi trường SFM khảo sát hai nhiệt độ 28 oC 37 oC ngày Dịch nuôi cấy khảo sát hoạt tính kháng khuẩn kết trình bày Hình Hình Ảnh hưởng nhiệt độ khả sinh chất kháng khuẩn SS004 Kết cho thấy đường kính trung bình vòng kháng khuẩn 28 oC 15,7 mm lớn so với vòng kháng khuẩn 37 oC 12,8 mm (P