Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng oxy hóa của hợp chất polyphenol chiết xuất từ rễ cây mướp gai (Lasia spinosa L.)

Bài viết trình bày khảo sát quy trình tách chiết tốt nhất để thu được hàm lượng polyphenol cao nhất từ rễ cây mướp gai (Lasia spinosa L.) nhằm sử dụng trong việc kháng khuẩn, kháng nấm và kháng oxy hóa.

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM, KHÁNG OXY HÓA CỦA HỢP CHẤT POLYPHENOL CHIẾT XUẤT TỪ RỄ CÂY MƯỚP GAI (LASIA SPINOSA L.) Nguyễn Minh Cẩm Tiên*, Phạm Ngọc Khơi** TĨM TẮT Đặt vấn đề: Các nghiên cứu lâm sàng nước chứng minh khả sử dụng hợp chất sinh học có nguồn gốc từ thực vật việc phòng điều trị bệnh truyền nhiễm, bệnh ký sinh trùng, bệnh nội khoa bệnh ngoại khoa để thay dần việc sử dụng kháng sinh nay, đặc biệt hợp chất polyphenol có thực vật Cây mướp gai (Lasia spinosa L.) xem dược liệu quý nhiều nước giới khai thác chưa có nhiều nghiên cứu loại Việt Nam Nghiên cứu thực nhằm đánh giá ảnh hưởng điều kiện tách chiết đến hàm lượng polyphenol hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, chống oxy hóa mướp gai Đồng Nai Mục tiêu: Khảo sát quy trình tách chiết tốt để thu hàm lượng polyphenol cao từ rễ mướp gai (Lasia spinosa L.) nhằm sử dụng việc kháng khuẩn, kháng nấm kháng oxy hóa Đối tượng phương pháp: Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết polyphenol từ rễ mướp gai Hàm lượng polyphenol xác định phương pháp so màu, hoạt tính chống oxy hóa xác định dựa vào khả khử gốc tự DPPH Xác định khả kháng khuẩn cao chiết phương pháp đặt đĩa kháng sinh chủng Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa Salmonella typhi; kháng nấm cao chiết chủng Candida ablican Kết quả: Dung môi ethanol 90%, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi (1/6), thời gian 150 phút, nhiệt độ 60oC cho hiệu suất chiết tách polyphenol từ rễ mướp gai cao Trong nghiên cứu này, cao chiết polyphenol (60 mg/mL) có khả ức chế lên biểu E.coli, P.aeruginosa, S aureus C ablicans, nhiên cao chiết không kháng B subtilis S typhi Nghiên cứu đánh giá khả kháng oxy hóa cao chiết polyphenol thông qua khả bắt gốc tự DPPH với giá trị IC50 khả bắt gốc tự DPPH 52,50 mg/mL Két luận: Trong nghiên cứu này, chúng tơi tìm điều kiện chiết tách polyphenol từ rễ mướp gai Đánh giá khả kháng oxy hóa cao chiết polyphenol từ rễ mướp gai thông qua khả bắt gốc tự DPPH Cao chiết polyphenol từ rễ mướp gai thể hoạt tính chống oxy hóa thấp vitamin C Cao polyphenol từ rễ mướp gai nồng độ 60 mg/mL cao kháng nhiều loại vi khuẩn nấm bệnh người E coli, P aeruginosa, S aureus C ablicans Từ khóa: Cây mướp gai, polyphenol, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng oxy hóa, bệnh nhiễm khuẩn ABSTRACT ANTIBACTERIAL, ANTIFUNGAL AND ANTIOXIDANT ACTIVITIES OF LASIA SPINOSA L EXTRACTS CONTAINING PHENOLIC COMPOUNDS Nguyen Minh Cam Tien, Pham Ngoc Khoi * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 20 - No - 2016: 436 - 446 * Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Khoa học ứng dụng, Đại học Tôn Đức Thắng, TP.HCM ** Bộ môn Mô Phôi - Di truyền Trường Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch Tác giả liên lạc: TS Phạm Ngọc Khôi ĐT: 0909 097 802 Email: pnkhoi@pnt.edu.vn 436 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học Background: Clinical studies domestic and abroad have demonstrated the possibility of using the biological compounds derived from plants in the prevention and treatment of infectious diseases, parasitic diseases, medical conditions and surgical conditions to gradually replace the use of antibiotics as today, especially the polyphenol compound in plants Lasia spinosa L are considered rare medical plants are many mining countries in the world and there are not many studies on this plant in Vietnam This study was carried out to optimize extracting condition of polyphenol from Lasia spinosa L roots, and antibacterial, antifungal, antioxidant of Lasia spinosa L in Dong Nai province Aims: Surveying the best extraction process to obtain the highest polyphenol content Lasia spinosa L roots to use in antibacterial, antifungal, antioxidants Methods: Survey of factors affecting performance polyphenol extracted from Lasia spinosa L roots Polyphenol content was determined by a colorimetric method, antioxidant activity is based on the ability to eliminate free radicals DPPH Indenting antibacterial extracts of method antibiotic disks set for the strain of Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudononas aeruginosa and Salmonella typhi, antifungal extract of strains of Candida ablicans Results: Ethanol 90%, the ratio of material/solvent (1/6), 150 minutes, 60oC for polyphenol extraction efficiency is the highest Lasia spinosa L roots In this study, polyphenol extracts capable of inhibiting the expression of E coli, P aeruginosa, S aureus and C ablicans However this is not resistant B subtillis and S typhi This study also evaluated the ability to capture free radicals DPPH IC50 value of the ability to capture free radicals DPPH (52.50 mg/mL) Conclusions: In this study, for the first time, we were carried out to optimize extracting conditions of polyphenol from Lasia spinosa L roots Evaluated the ability of antioxidants of polyphenol extracted though the ability to capture free radicals DPPH Polyphenol extracts shown antioxidant activity of vitamin C lower Polyphenol extracts are decent variety of bacterial and fungal diseases in humans, such as E coli, P aeruginosa, S aureus and C ablicans Keywords: Lasia spinosa L., polyphenol, antibacterial, antifungal, antioxidant, infection nhiều mối quan tâm chất kháng oxy hóa ĐẶT VẤN ĐỀ có nguồn gốc từ thực vật có tác dụng ngăn chặn Các cơng trình nghiên cứu lĩnh vực đơng q trình oxy hóa khơng mong muốn y, y dược cổ truyền thu hút ý carotenoid, flavonoid, vitamin C, vitamin E,… nhiều nhà khoa học giới Việt Các hợp chất phenolics chất chống oxy Nam Các nhà khoa học nước ý hóa tự nhiên, phát phổ biến đến việc sử dụng dược liệu thực vật loại thực vật Chúng báo cáo có phòng điều trị bệnh truyền nhiễm, bệnh ký nhiều chức sinh học q chúng có sinh trùng, bệnh nội khoa bệnh ngoại khả trì hỗn hiệu q trình oxy hóa khoa Hiện nay, nhiễm khuẩn đường tiêu hóa chất béo góp phần cải thiện chất lượng trở nên phổ biến Phương pháp dinh dưỡng thực phẩm(3, 5) Polyphenol chữa trị chủ yếu sử dụng kháng hợp chất thơm có nhóm hydroxyl đính sinh Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh dẫn trực tiếp với nhân benzene(4) Polyphenol có đến rủi ro tượng kháng thuốc Do đó, nhiều thực vật rau, quả, hoa việc tìm nguồn nguyên liệu tự nhiên có số phận thực vật Polyphenol đóng vai khả kháng khuẩn cho ta phương trò quan trọng đời sống thực vật pháp điều trị cách hiệu số tạo màu sắc đặc trưng, bảo vệ thực vật khỏi bệnh nhiễm khuẩn Thêm vào đó, ngày có tác nhân xâm hại trùng, oxy Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 437 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 hóa tác dụng tia cực tím Về y học, polyphenol hợp chất tự nhiên có nhiều tác dụng chống oxy hóa mạnh, kháng viêm, kháng khuẩn, chống dị ứng, chống lão hóa số bệnh tật liên quan đến ung thư(3) Cây mướp gai (Lasia spinosa L.) lồi thực vật có hoa họ Ráy (Araceae) Lá non mướp gai dùng làm rau ăn nhiều nước Đông Nam Á dùng làm thuốc trị bệnh, đặc biệt bệnh gan Ngồi mướp gai sử dụng làm thuốc chữa lở ngứa da, trị tê thấp, lưng, gối cẳng chân tê buốt, nhiệt, giải độc Hiện nay, giới chưa có nhiều nghiên cứu Các nhà khoa học Việt Nam bước đầu tìm hiểu, nghiên cứu Những nghiên cứu trước hàm lượng flavonoid lồi Araceae cho thấy lồi Araceae có chứa hợp chất đơn giản flavone Cglycosides, flavonols, flavones (8) proanthocyanidins chất Các nghiên cứu hoạt chất hóa học có nguồn gốc thực vật báo cáo phân lập triglochinin, β-sitosterol acetate, stigmasterol acetate phân lập từ thân rễ cây(2) Nghiên cứu thực nhằm đánh giá ảnh hưởng điều kiện chiết đến hàm lượng polyphenol hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, chống oxy hóa rễ mướp gai vùng Đồng Nai Từ đề điều kiện tách chiết thích hợp Kết nghiên cứu cung cấp liệu khoa học điều kiện tách chiết rễ mướp gai để thu hàm lượng polyphenol hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, chống oxy hóa cao ĐỐITƯỢNG-ƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Vật liệu nghiên cứu Rễ mướp gai thu từ ven suối huyện Cẩm Mỹ, tỉnh Đồng Nai Các chủng vi khuẩn thử nghiệm chủng Bacillussubtilis, Staphylococcus aureus đại diện cho nhóm vi khuẩn gram dương Escherichiacoli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi đại diện 438 cho nhóm vi khuẩn gram âm Chủng nấm bệnh thử nghiệm chủng Candida albicans Các chủng phòng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học, Trường Đại học Tôn Đức Thắng, TP.HCM cung cấp Xử lý mẫu Mẫu sau thu hoạch, xác định thông số sinh trưởng như: chiều cao, mức độ trưởng thành tuổi thu hoạch Mẫu tươi phơi khô tự nhiên Mẫu rễ tươi phơi khơ tự nhiên, sau đem xác định độ ẩm nguyên liệu định tính sơ thành phần hóa học mướp gai Cơng thức thí nghiệm Để nghiên cứu ảnh hưởng dung mơi chiết, sử dụng loại dung mơi có độ phân cực khác nhau, bao gồm: acetone 99,5%, ethanol 99,5%, methanol 99,5%, ethyl acetate 99,5% nước Các thông số thời gian chiết, nhiệt độ chiết tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết giữ cố định với giá trị tương ứng là: 180 phút, 30oC 1/6 (g/mL) Loại dung mơi chiết thích hợp chọn dựa vào hàm lượng polyphenol hàm lượng flavonoid cao Sau sử dụng dung môi để nghiên cứu thông số khác Ảnh hưởng nồng độ dung môi chiết đến hàm lượng polyphenol hàm lượng flavonoid rễ mướp gai thực nồng độ dung môi 50, 60, 70, 80, 90, 96 99,9% Các thông số khác cố định bao gồm: dung môi chiết, nhiệt độ chiết tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết 1/6 (g/mL) Ảnh hưởng tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết nghiên cứu mức 1/4, 1/6, 1/8, 1/10 (g/mL) Các thông số cố định gồm: dung môi chiết, nồng độ dung môi, thời gian chiết 180 phút nhiệt độ chiết 30oC Tỉ lệ nguyên liệu/dung mơi thích hợp lựa chọn dựa vào hàm lượng polyphenol hàm lương flavonoid, cố định thông số để nghiên cứu thơng số lại Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol hàm lượng flavonoid rễ mướp gai thực 30, 40, 50, 60, 70 80oC Các thông số cố định gồm: dung môi chiết, nồng độ dung môi, thời gian chiết 180 phút tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết Nhiệt độ chiết thích hợp lựa chọn dựa vào hàm lượng polyphenol hàm lượng flavonoid, cố định thông số để nghiên cứu thơng số lại Ảnh hưởng thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol hàm lượng flavonoid rễ mướp gai nghiên cứu mốc thời gian 30, 60, 90, 120, 150, 180, 240 300 phút Các thông số khác cố định bao gồm: dung môi chiết, nồng độ dung môi, nhiệt độ chiết tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết Thời gian chiết thích hợp lựa chọn dựa vào hàm lượng polyphenol hàm lương flavonoid cao Xác định hàm lượng polyphenol tổng số Hàm lượng polyphenol tổng xác định theo phương pháp Singleton cộng (1999) với vài hiệu chỉnh nhỏ, cụ thể sau: dịch chiết hòa lỗng nồng độ thích hợp, sau 0,1 mL dịch chiết pha loãng trộn với 0,9 mL nước cất trước thêm mL thuốc thử Folin-Ciocalteu Hỗn hợp trộn trước thêm 2,5 mL Na2CO3 7,5% Sau đó, hỗn hợp phản ứng giữ 30oC 30 phút trước đo bước sóng 760 nm sử dụng máy quang phổ kế (Carry 50, Varian, Australia) Kết báo cáo miligam acid gallic tương đương (mg GAE)/g chất khô Xác định hàm lượng flavonoid tổng số Tổng flavonoid xác định theo phương pháp so màu miêu tả Chang cộng (2002) dựa nguyên tắc: flavonoid tạo phức màu vàng với dung dịch AlCl3 Phản ứng dùng để xác định hàm lượng flavonoid tổng Cường độ màu tỷ lệ thuận với hàm lượng flavonoid xác định bước sóng 415 nm Hút 0,5 mL dịch chiết bổ sung 1,5 mL ethanol Nghiên cứu Y học 95% + 0,1 mL AlCl3 + 0,1 mL CH3COOK 2,8 mL nước cất Sau đó, hỗn hợp lắc để ổn định nhiệt độ phòng vòng 30 phút, tiến hành đo máy UV-Vis bước sóng 415 nm, mẫu trắng sử dụng nước cất Xác định khả khử gốc tự DPPH (1,1diphenyl-2-picrylhydrazyl) Khả khử gốc tự DPPH xác định theo phương pháp Fu Shieh (2002) với vài hiệu chỉnh nhỏ Cụ thể sau: khoảng 20 - 140 µL dịch chiết pha lỗng đến nồng độ thích hợp trộn với nước cất để đạt thể tích tổng cộng mL Sau thêm mL dung dịch DPPH 0,2 mM, lắc để yên bóng tối 30 phút Độ hấp thu quang học đo bước sóng 517 nm (Carry 50, Varian, Australia) Khả khử gốc tự DPPH xác định theo cơng thức sau: DPPH (%) = 100 × (ACT-ASP)/ACT (trong đó: ACT độ hấp thu quang học mẫu trắng không chứa dịch chiết, ASP độ hấp thu quang học mẫu có chứa dịch chiết) Kết báo cáo giá trị IC50 nồng độ dịch chiết khử 50% gốc tự DPPH điều kiện xác định Giá trị IC50 thấp hoạt tính khử gốc tự DPPH cao Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm cao chiết Thí nghiệm tiến hành theo phương pháp đặt đĩa giấy để khảo sát khả kháng khuẩn dịch chiết polyphenol từ rễ mướp gai 1: Mẫu đối chứng (DMSO) 2: Dịch chiết nồng độ 20 mg/mL 3: Dịch chiết nồng độ 40 mg/mL 4: Dịch chiết nồng độ 60 mg/mL Số nghiệm thức/đĩa petri: nghiệm thức Tổng số đĩa petri cho loại vi sinh vật: đĩa Tổng số đĩa petri cho loại khuẩn loại nấm: 18 đĩa Thể tích mơi trường/đĩa petri: 20 mL Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 439 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học Phương pháp xử lý số liệu Tất thí nghiệm bố trí lặp lại lần để đảm bảo tiến hành phân tích ANOVA Số liệu phân tích ANOVA phần mềm xử lý số liệu thống kê chuyên dụng SAS 8.0 Kiểm định Tukey thực để đánh giá mức độ khác biệt có ý nghĩa giá trị với mức ý nghĩa P 100 Kết tủa vàng nhạt Dung dịch màu xanh đen Fehling Kết tủa đỏ Glycosyd Tollens Kết tủa Ag Phản ứng mở Ống có kiềm trong, vòng lacton acid hóa đục Coumarin Phản ứng diazo Dung dịch đỏ thẫm hóa + +++ + ++ ++ ++ ++ ++ ++ polyphenol cao đáng kể so với dung môi chiết acetone 99,5%; ethyl acetate 99,5% nước Trong dung môi khảo sát, ethanol cho hiệu trích ly polyphenol (TPC TFC) hiệu cho TPC đạt 138,40 mgGAE/g db TFC đạt 220,57 µgQE/g, nước cho hiệu chiết thấp với TPC 46,16 mgGAE/g db TFC 114,08 µgQE/g Từ kết thu được, hiệu suất chiết polyphenol dung mơi xếp theo thứ tự giảm dần, có nghĩa ethanol > methanol > acetone > ethyl acetat > nước Sự khác hiệu chiết dung mơi giải thích sau: hiệu chiết dung môi phụ thuộc vào khả khuếch tán dung môi vào sâu bên lớp nguyên liệu Cả năm loại dung môi nghiên cứu có khả chiết polyphenol, loại dung mơi lại có ưu nhược điểm riêng Cấu trúc hóa học hợp chất phenol trình bày phần cho thấy hợp chất có chứa nhiều nhân benzen, mạch nhánh ankane ngắn, mang nhóm chức hydroxyl (-OH), metoxyl (-OCH3), carboxyl (-COOH)… nên nói chung hợp chất phenol có tính phân cực từ trung bình đến mạnh, tùy theo hợp chất có mang hay nhiều nhóm chức hydroxyl, carboxyl… Vì vậy, muốn chiết tách hợp chất khỏi cần sử dụng dung mơi có độ phân cực tăng dần Chú thích: + dương tính, ++ dương tính rõ, +++ dương tính rõ Kết khảo sát hàm lượng polyphenol rễ mướp gai Dung môi tách chiết yếu tố quan trọng có ảnh hưởng đến hiệu chiết Hiệu chiết polyphenol từ nguyên liệu thực vật phụ thuộc vào loại dung môi sử dụng đặc biệt độ phân cực dung môi Ảnh hưởng loại dung môi chiết lên hàm lượng polyphenol dịch chiết thể hình Kết cho thấy dung môi chiết ethanol 99,5%; methanol 99,5% cho hàm lượng 440 Hình 1: Ảnh hưởng loại dung mơi đến hàm lượng polyphenol flavonoid chiết từ rễ mướp gai Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Các kết có hồn tồn phù hợp độ phân cực dung môi dùng để chiết tách tính tan hợp chất polyphenol nguyên liệu Chỉ số phân cực ethyl acetate, acetone, methanol, ethanol 4,4; 5,1; 5,1; 5,2(3) Ethanol methanol dung môi vạn để chiết kiệt hợp chất có bột giá thành rẻ Vì thế, nghiên cứu này, chúng tơi chọn dung mơi ethanol để tiến hành thí nghiệm Ảnh hưởng nồng độ dung môi đến hiệu trích ly polyphenol Nghiên cứu Y học khả khuếch tán hợp chất cao Chính tổng polyphenol dịch chiết tăng dần Tuy nhiên tăng nồng độ ethanol 96% hàm lượng polyphenol giảm Hiện tượng nồng độ ethanol cao gây biến tính tế bào thành tế bào bị nước cục dẫn tới tượng tế bào bị khô co lại, ngăn chặn q trình trích ly hợp chất polyphenol vào dung mơi Vì vậy, thí nghiệm này, chọn nồng độ ethanol 90% để thực thí nghiệm Các kết có hoàn toàn phù hợp độ phân cực dung mơi dùng để chiết tách tính tan hợp chất polyphenol nguyên liệu Chỉ số phân cực ethyl acetate, acetone, methanol, ethanol 4,4; 5,1; 5,1; 5,2(3) Ethanol methanol dung môi vạn để chiết kiệt hợp chất có bột giá thành rẻ Vì thế, nghiên cứu này, chọn dung môi ethanol để tiến hành thí nghiệm Nồng độ ethanol có ảnh hưởng đáng kể đến khả trích ly TPC TFC từ rễ mướp gai Ảnh hưởng dung mơi đến hiệu trích ly polyphenol trình bày hình Kết cho thấy tăng nồng độ dung mơi chiết ethanol TPC TFC dịch tăng dần Ở nồng độ 50% TPC 53,68 mgGAE/g db, TFC 95,64 µgQE/g Khi tăng nồng độ ethanol lên 60%, 70%, 80%, 90% TPC tăng dần tương ứng 79,39; 111,19; 116,30; 136,68 mgGAE/g db TFC tăng dần Trong nồng độ dung mơi mẫu chiết 90% cho giá trị TPC (136,68 mgGAE/g db) TFC (193,65 µgQE/g) cao Tuy nhiên, tăng nồng độ ethanol lên 96% 99,5% TPC TFC mẫu lại giảm, 93,69 mgGAE/g db, 172,83 µgQE/g 90% 40,08 mgGAE/g db, 100,39 µgQE/g 99,5% Nồng độ ethanol tăng khả trích ly chất nhiều thẩm thấu Hình 2: Ảnh hưởng nồng độ dung môi đến hiệu trích ly polyphenol flavonoid Ảnh hưởng tỉ lệ dung mơi đến hiệu trích ly polyphenol Ảnh hưởng tỉ lệ dung mơi đến hiệu trích ly trình bày hình Có thể quan sát thấy tỷ lệ mẫu dung môi ethanol ảnh hưởng đáng kể đến TPC TFC Khi tăng tỉ lệ ngun liệu/dung mơi từ 1/4 lên 1/6 TPC tăng đáng kể 135,3 mgGAE/g db, tăng 1,472 lần TFC 179,97 µgQE/g, tăng 1,149 lần Tỷ lệ mẫu dung môi 1/6 (g/mL) cho hàm lượng cao TPC TFC Gia tăng tỷ lệ mẫu dung môi (tức từ 1/6 - 1/10) giảm hàm lượng TPC TFC Theo Tân cộng (2011), tỷ lệ dung môi Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 441 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 cao tìm thấy cho thuận lợi việc trích ly hợp chất polyphenol Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu trích ly polyphenol Các kết phù hợp với nguyên tắc truyền khối mà động lực cho khối lượng truyền khối coi gradient nồng độ chất rắn dung môi Tỷ lệ dung mơi cao thúc đẩy gradient nồng độ tăng, dẫn đến tăng tốc độ khuếch tán cho phép q trình trích ly chất rắn dung mơi tốt hơn(1) Ngồi ra, hội thành phần hoạt tính sinh học tiếp xúc với dung mơi trích ly mở rộng với gia tăng lượng dung mơi, dẫn đến tăng hiệu suất trích ly Tuy nhiên, sản lượng thành phần hoạt tính sinh học không tiếp tục tăng đạt cân Hình 0: Ảnh hưởng nhiệt độ đến TPC TFC Ứng với nhiệt độ chiết khác cho giá trị TPC TFC thu có khác biệt rõ rệt Điều cho thấy nhiệt độ yếu tố có ảnh hưởng đến trình chiết tách Ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến hiệu trích ly polyphenol trình bày hình Kết cho thấy hàm lượng polyphenol dịch trích ly tăng lên ta tăng nhiệt độ từ 30oC - 60oC từ 43,23 đến 115,67 mgGAE/g db, TFC tăng từ 107,98 đến 139,51 µgQE/g giảm 70oC 80oC Hình 3: Ảnh hưởng tỉ lệ dung môi đến hàm lượng TPC TFC 442 Nhiệt độ cao có tác dụng tăng tốc độ khuếch tán giảm độ nhớt dung dịch, giúp phân tử cần chiết dễ dàng khuếch tán lòng phân tử dung mơi làm tăng tốc độ khuếch tán dẫn đến hiệu thu hồi dịch chiết mang cấu tử cần chiết tốt Mặt khác, nhiệt độ giúp làm biến tính màng tế bào phá hủy màng tế bào nhờ bọt khí tạo thành làm cho q trình chiết tách dễ dàng Theo Shi cộng (2003), nhiệt độ làm suy yếu liên kết phenol lipoprotein polyphenol tương tác với polysaccharide nguyên liệu thực vật từ tốc độ khuếch Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học tán polyphenol từ bên ngun liệu ngồi dung mơi mạnh Mặc dù nhiệt độ tác động tích cực việc trích ly polyphenol, khơng có nghĩa tăng nhiệt độ vô thời hạn Khi nâng nhiệt độ lên đến mức độ làm cho tượng chuyển pha dung môi mãnh liệt đồng thời q trình oxy hóa polyphenol tăng cao nên làm giảm hiệu trích ly Điều giải thích nghiên cứu Abad-Garcia cộng (2007), nhiệt độ cao gây biến tính màng tế bào phân hủy polyphenol phản ứng thủy phân, phản ứng oxy hóa, phản ứng trùng hợp làm giảm hàm lượng, hoạt tính sinh học hợp chất Ảnh hưởng thời gian đến hiệu trích ly polyphenol Thời gian chiết yếu tố quan trọng, ảnh hưởng tới hiệu suất, chất lượng dịch chiết polyphenol tính kinh tế trình Nếu thời gian ngắn, không đủ để dung môi xâm nhập vào tế bào, hòa tan polyphenol khuếch tán ngồi dung mơi hàm lượng polyphenol thấp, ngược lại thời gian chiết dài làm giảm hiệu suất polyphenol bị oxy hóa Tiến hành chiết polyphenol từ rễ mướp gai mức thời gian khác ảnh hưởng đến hiệu trích ly trình bày hình Quan sát kết nghiên cứu cho thấy thời gian chiết 150, 180, 240 300 phút cho TPC cao đáng kể so với thời gian chiết 30, 60, 90 120 phút Khi tăng thời gian chiết từ 30 phút lên 150 phút, hàm lượng polyphenol chiết tăng tương ứng 60,74 lên 133,12 mgGAE/mg db Tuy nhiên, kéo dài thời gian chiết lên 180, 240 300 phút, hàm lượng polyphenol tăng lên không đáng kể khác biệt so với thời gian chiết 150 phút Kết ghi nhận tương tự TFC.Điều cho thấy rễ mướp gai thời gian 150 phút đủ để chiết polyphenol điều kiện xác định, đồng thời tiết kiệm lượng rút ngắn trình chiết Hình 5: Ảnh hưởng thời gian đến TPC TFC Kết giải thích định luật thứ hai Fick khuếch tán dự đoán trạng thái cân cuối nồng độ chất tan ma trận chất rắn dung môi đạt sau thời gian định (Silva cộng sự, 2007) Khi thời gian trích ly tăng lượng polyphenol khuếch tán từ tế bào nhiều Do lúc đầu lượng polyphenol mẫu lớn nên chênh lệch nồng độ bên bên ngồi tế bào cao mà hàm lượng polyphenol dịch trích ly tăng mạnh Tuy nhiên, theo thời gian hàm lượng polyphenol bên bên tế bào gần đạt đến trạng thái cân nên làm cho lượng polyphenol thu tăng không đáng kể Hiệu suất polyphenol q trình trích ly Ảnh hưởng số lần trích ly đến hiệu suất trích ly polyphenol trình bày hình Kết cho thấy số lần trích ly tăng lượng polyphenol khuếch tán từ tế bào nhiều Lúc đầu lượng polyphenol có mẫu lớn làm cho chênh lệch nồng độ bên bên tế bào cao nên hàm lượng polyphenol thu lần trích ly đầu cao Nhưng lần trích ly sau nồng độ Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 443 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 polyphenol dịch chiết gần đạt đến trạng thái bão hòa làm cho hàm lượng polyphenol dịch chiết khơng cao Giả sử sau lần trích ly hàm lượng polyphenol ngun liệu lại khơng đáng kể, tổng lượng polyphenol trích ly mẫu 248,06 mg GAE/g db Hiệu suất trích ly lần 3= = 12,94% Nếu trích ly lần polyphenol bã nhiều (83,18 mgGAE/g db) Nếu trích ly lần polyphenol bã thấp (32,10 mgGAE/g db).Số lần trích ly nhiều hàm lượng polyphenol tăng việc tăng số lần trích ly lại tiêu tốn mặt lượng dung mơi Do đó, số lần trích ly polyphenol thích hợp nên chọn lần Như sau lần trích ly hàm lượng polyphenol thu dịch rễ mướp gai 248,06 mgGAE/g db Kết khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa cao chiết từ rễ mướp gai Các nồng độ vitamin C phần trăm ức chế biểu thị dạng đường thẳng với phương trình y = 1,0707x + 0,9512, với hệ số tương quan R2 = 0,9944 Thay y = 50 vào phương trình tìm IC50 = 45,81 (mg/mL) Đồ thị 1: Tỉ lệ ức chế gốc tự vitamin C Đồ thị 2: Khả bắt gốc tự cao chiết polyphenol từ rễ mướp gai Hình 6: Hiệu suất trích ly polyphenol flavonoid Hiệu suất trích ly lần = = 53,53% Hiệu suất trích ly lần 2= 33,53% 444 = Các nồng độ cao chiết từ rễ mướp gai phần trăm ức chế biểu thị dạng đường thẳng với phương trình y = 1,5024x – 28,878, với hệ số tương quan R2 = 0,9912 Thay y = 50 vào phương trình tìm IC50 = 52,50 (mg/mL) Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 DPPH phương pháp kiểm tra khả làm gốc tự nhóm cho hydro, sử dụng để định lượng chất kháng oxy hóa hệ thống sinh học phức tạp DPPH hợp chất có màu tím hấp thu bước sóng 517 nm Khi điện tử lẻ gốc tự DPPH kết hợp với hydro từ chất kháng oxy hóa hình thành nên DPPH – H lúc màu sắc chuyển từ màu tím sang màu vàng Sự biến đổi màu tương ứng với lượng electron kết hợp với DPPH(7) Do đó, khả làm gốc tự chất cao hấp thu quang phổ đo 517 nm phản ứng DPPH có giá trị giảm ngược lại Hiệu loại bỏ gốc tự rễ mướp gai trình bày đồ thị Từ kết đồ thị cho thấy, hiệu loại bỏ gốc tự DPPH tăng phụ thuộc vào nồng độ cao chiết Khi nồng độ cao chiết tăng hiệu loại bỏ gốc tự DPPH tăng ngược lại Hiệu loại bỏ gốc tự rễ mướp gai so sánh dựa vào khả loại bỏ 50% lượng gốc tự Giá trị IC50 cao polyphenol chiết từ rễ mướp gai vitamin C 52,50 mg/mL 42,81 mg/mL, so sánh giá trị IC50 cho thấy cao polyphenol thu có hoạt tính chống oxy hóa thấp vitamin C Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết từ rễ mướp gai Bảng 2: Đường kính vòng kháng khuẩn cao polyphenol từ rễ mướp gai Đường kính vòng vô khuẩn (mm) Loại vi sinh vật S aureus B subtilis E coli P.aeruginosa S typhi C ablicans Nồng độ cao chiết (mg/mL) 20 c 6,67 0,00 c 0,00 c 12,77 0,00 a 0,00 40 b 8,50 0,00 b 14,70 b 15,63 0,00 b 7,73 60 a 12,00 0,00 a 19,63 a 18,67 0,00 a 11,70 Mẫu đối chứng DMSO 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Các mẫu tự khác (a,b,c,…) biểu thị khác biệt có ý nghĩa với P= 0,05 Nghiên cứu Y học Bảng 3: Đánh giá khả kháng khuẩn cao polyphenol từ rễ mướp gai Đường kính vòng vơ khuẩn (mm) Loại vi sinh vật S aureus B subtilis E coli P aeruginosa S typhi C ablicans Nồng độ cao chiết (mg/mL) 20 + + - 40 + ++ +++ + 60 ++ +++ +++ ++ Kháng cao: +++; kháng trung bình: ++; kháng thấp:+; không kháng: - Từ bảng thấy: Đối với P aeruginosa S aureus: đường kính vòng kháng khuẩn mẫu cao chiết từ rễ mướp gai có nồng độ 20 mg/mL nhỏ nhất, tăng lên cao chiết từ rễ mướp gai có nồng độ 40 mg/mL cao nồng độ 60 mg/mL Cả nồng độ cao chiết có đường kính vòng kháng khuẩn cao so với mẫu DMSO, chứng tỏ cao chiết từ rễ mướp gai có khả kháng P aeruginosa S aureus, khả kháng tương đối cao Đối với E.coli: vòng kháng khuẩn mẫu cao chiết từ rễ mướp gai có nồng độ 20 mg/mL, nồng độ 40 mg/mL có đường kính vòng kháng khuẩn (14,70 mm) cao nồng độ 60 mg/mL (19,63 mm) Chứng tỏ cao chiết từ rễ mướp gai có khả kháng E coli Đối với B subtilis S typhi: tất nồng độ cao chiết, khơng có vòng kháng khuẩn giống mẫu đối chứng DMSO, chứng tỏ cao chiết từ rễ mướp gai khơng có khả kháng hai loại vi khuẩn B subtilis S typhi Đối với nấm men C ablicans: khơng có vòng kháng khuẩn mẫu cao chiết từ rễ mướp gai có nồng độ 20 mg/mL, nồng độ 40 mg/mL có đường kính vòng kháng khuẩn (7,73 mm) cao nồng độ 60 mg/mL (11,70 mm) Chứng tỏ cao chiết từ rễ mướp gai có khả kháng C ablicans Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 445 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Với nồng độ cao chiết từ rễ mướp gai 60 mg/mL, tạo vòng vơ khuẩn có đường kính lớn với P aeruginosa E coli, S aureus, C ablicans cuối B subtilis với khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê Nhìn chung, cao polyphenol chiết từ rễ mướp gai có khả kháng đa dạng loài vi khuẩn BÀN LUẬN Trong nghiên cứu này, chúng tơi tìm điều kiện chiết tách polyphenol từ rễ mướp gai cho hiệu suất cao dung môi ethanol, nồng độ ethanol 90%, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi 1/6 (g/mL), thời gian 150 phút, nhiệt độ 60oC với lần chiết thích hợp Đánh giá khả kháng oxy hóa cao chiết polyphenol từ rễ mướp gai thông qua khả bắt gốc tự DPPH Cao chiết polyphenol từ rễ mướp gai thể hoạt tính chống oxy hóa thấp vitamin C với giá trị IC50 khả bắt gốc tự DPPH 52,50 mg/mL Khảo sát tính kháng khuẩn, kháng nấm cao polyphenol từ rễ mướp gai, nồng độ 60 mg/mL cao kháng E coli, P aeruginosa, S aureus C ablicans không kháng B subtilis S typhi Tuy nhiên, cần có thêm nhiều nghiên cứu để khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình tinh cao polyphenol, thành phần hóa học khảo sát khả kháng số chủng vi khuẩn, nấm gây bệnh khác cao polyphenol từ rễ mướp gai, hay triển khai thử nghiệm in vivo 446 chuột viêm gan hay xơ gan để làm sáng tỏ chế kháng bệnh cao chiết polyphenol TÀI LIỆU THAM KHẢO Ahmad J, Wizarat D, Shamsuddin KM, Zaman A, Connolly JD 1984 Phytochemistry DINDA B et al 2004 Chemical constituents of Lasia spinosa, Mussaenda incana and Wendlandia tinctoria Journal of The Indian Chemical Society 81:73-76 Jin D and Russell JM 2010 Plant phenolic: extraction, analysis and antioxydant and anticancer properties Molecules 15: 7313-7352 Lê Ngọc Tú, Lê Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẫn Và Lê Dỗn Diên 2002 Hóa sinh cơng nghiệp Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Hà Nội Marja PK, Anu IH, Heikki JV, Jussi-Pekka R, Kalevi P, Tytti SK, Marina H 1999 Antioxydant activity of plant extracts containing phenolic compounds J Agric Food Chem 47: 3954-3961 Nguyễn Kim Phi Phụng 2007 Phương pháp cô lập hợp chất hữu Nhà xuất Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Prakash A, Rigelhof F and Miller et al 2000 Antioxidant activity Analytical progress Medallion Laboratories.1-4 Suthikrai W, Jintana R, Sophon S, Hengtakulsin R, Usawang V et al 2007 Effects of Lasia spinosa Thw on growth rate and reproductive hormone of weaned Swamp buffalo and Murrah X Swamp buffalo calves Italian Journal of Animal Science 6: 532-535 Zheng X et al 2013 Extraction characteristics andoptimal parameters of anthocyanin from blueberry powder under microwave-assisted extraction conditions Sep Purif Technol 104:17-25 Ngày nhận báo: 13/03/2016 Ngày phản biện nhận xét báo: 28/03/2016 Ngày báo đăng: 15/04/2016 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 ... điều kiện tách chiết rễ mướp gai để thu hàm lượng polyphenol hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, chống oxy hóa cao ĐỐITƯỢNG-ƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Vật liệu nghiên cứu Rễ mướp gai thu từ ven suối huyện... 60oC với lần chiết thích hợp Đánh giá khả kháng oxy hóa cao chiết polyphenol từ rễ mướp gai thông qua khả bắt gốc tự DPPH Cao chiết polyphenol từ rễ mướp gai thể hoạt tính chống oxy hóa thấp vitamin... polyphenol thu có hoạt tính chống oxy hóa thấp vitamin C Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết từ rễ mướp gai Bảng 2: Đường kính vòng kháng khuẩn cao polyphenol từ rễ mướp gai Đường kính