Vũ Thị Lan và đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 82(06): 65 - 69 65 ẢNH HƯỞNG CỦA TỔ HỢP CÁC CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG VÀ NƯỚC DỪA ĐẾN SINH KHỐI MÔ SẸO CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG (Crinum latifolium L.,) Vũ Thị Lan 1 , Quách Thị Liên 2 , Nguyễn Đức Thành 2 1 Trường Đại học Khoa học – ĐH Thái Nguyên, 2 Viện Công nghệ Sinh học TÓM TẮT Bài báo này trình bày các kết quả nghiên cứu về nuôi cấy thu nhận sinh khối mô sẹo cây Trinh nữ hoàng cung và định tính ancaloit trong các mẫu mô sẹo thu được. Mô sẹo sau khi tạo khoảng 50 ngày, được cắt thành các miếng nhỏ có kích thước khoảng 0,7cm x 0,7cm, trọng lượng khoảng 0,35- 0,40 g, cấy lên các môi trường nuôi cấy sinh khối khác nhau có nền môi trường cơ bản là MS, sucrose 30 g/l, agar 7 g/l, bổ sung kết hợp NAA 2mg/l với BAP ở các nồng độ khác nhau (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l) hoặc kinetin (nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l) hoặc nước dừa ( nồng độ 10; 20; 30; 40 %). Kết quả thu được cho thấy: Môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng mô sẹo để thu sinh khối là: SB1(MS + 2 mg/l NAA + 0,5 mg/l BAP) và SB2 (MS + 2 mg/l NAA + 1,0 mg/l BAP); SK6 (MS + 2 mg/l NAA + 1,0 mg/l kinetin) và SK7 (MS + 2mg/l NAA + 1,5 mg/l kinetin); SN9 (MS + 2mg/l NAA + 10% nước dừa) và SN10 (MS + 2mg/l NAA + 20% nước dừa). Bước đầu đã định tính phát hiện có ancaloit trong các mẫu mô thu được. Từ khoá: Ancaloit, cây Trinh nữ hoàng cung, môi trường, nuôi cấy, sinh khối mô sẹo. ∗ MỞ ĐẦU Hiện nay, các nhà khoa học đang rất quan tâm đến các ứng dụng thực tiễn của công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật để tổng hợp các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học. Những năm gần đây, cây Trinh nữ hoàng cung (TNHC) đã nhận được sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học cả ở trong nước và nước ngoài vì các tính năng dược học quan trọng của nó. Đó là các tính năng chữa bệnh như phì đại tuyến tiền liệt ở nam giới và u xơ tử cung ở phụ nữ, đặc biệt là khả năng chống ung thư [8], [9], [12]. Trinh nữ hoàng cung đang trở thành cây thuốc rất có giá trị trong việc điều trị chứng phì đại lành tính tuyến tiền liệt. Vì vậy, nhu cầu về số lượng và chất lượng nguyên liệu để sản xuất thuốc đối với cây thuốc này ngày càng tăng. Ở Việt Nam, để tăng nguồn cung cấp nguyên liệu cho chế biến thuốc ở qui mô công nghiệp, đã có nhiều công trình nghiên cứu khoa học ứng dụng phương pháp nuôi cấy in vitro vào việc nhân giống Trinh nữ hoàng cung và nhận được những kết quả khả quan, góp phần giải quyết nhu cầu nguồn nguyên liệu [1], [3]. ∗ Tel: 091 4504250, Email: lanvtdhkhtn@gmail.com Hiện nay, không chỉ các tác giả ngoài nước mà đã có nhiều công trình khoa học, các bài báo của các nhà khoa học Việt Nam đã nghiên cứu và xác định tương đối đầy đủ về thành phần hoá học của cây Trinh nữ hoàng cung Việt Nam [4], [6], [7], [10],[11]. Tuy nhiên, vấn đề nghiên cứu quy trình nuôi cấy mô tế bào cây Trinh nữ hoàng cung để thu nhận sinh khối và phân tích các chất có hoạt tính sinh học trong mô chưa được quan tâm. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày một số kết quả về ảnh hưởng của sự tổ hợp các chất điều hòa sinh trưởng và nước dừa đến sinh khối mô sẹo thu được từ mẫu củ cây Trinh nữ hoàng cung và kết quả ban đầu về định tính ancaloit trong các mẫu mô sẹo thu được bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Cây Trinh nữ hoàng cung Crinum latifolium L., thuộc họ Thuỷ tiên Amaryllidaceae do Viện Dược liệu cung cấp. Phương pháp - Phương pháp nuôi cấy sinh khối mô sẹo: Nguồn nguyên liệu, phương pháp tạo mô và môi trường tạo mô sẹo được công bố theo Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Vũ Thị Lan và đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 82(06): 65 - 69 66 Quách Thị Liên và cs, 2005 [5]. Mô sẹo được cắt thành các miếng nhỏ có kích thước khoảng 0,7 cm x 0,7 cm và trọng lượng khoảng 0,35 - 0,4g cấy lên các môi trường nuôi cấy mô sẹo khác nhau với nền môi trường cơ bản là MS, đường sucrose 30 g/l, agar 7 g/l và bổ sung thêm các chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST) với các nồng độ khác nhau. - Phương pháp bố trí thí nghiệm: Các môi trường nuôi cấy thu nhận sinh khối được kí hiệu từ SB1-SN12, chia làm 3 nhóm: kí hiệu SB1 - SB4: MS bổ sung 2 mg/l NAA kết hợp với BAP (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l); kí hiệu SK5 - SK8: MS bổ sung 2 mg/l NAA kết hợp với kinetin (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l); kí hiệu SN10 – SN12: MS bổ sung 2mg/l NAA kết hợp với nước dừa (10; 20; 30; 40%) Mỗi công thức môi trường tiến hành theo dõi trên 10 bình tam giác 250 ml. Mỗi bình cấy 4 mẫu mô. Nuôi cấy trong phòng tối. Sau khoảng thời gian 120 ngày thu sinh khối, cân trọng tươi của mô (g/bình). Mô sẹo sau khi thu được sấy khô ở 40 - 50 0 C đến trọng lượng không đổi. - Phương pháp sắc kí lớp mỏng Định tính alcaloid trong mô sẹo bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng theo Bùi Thị Bằng [2]. Khảo sát dịch chiết: Hoà tan mẫu nghiên cứu trong dung môi chiết. Dùng mao quản hút mẫu chấm lên bản mỏng tráng sẵn Silicagel DC- Alufoluen 60 F254 (Merck 5554). Để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Đưa vào hệ dung môi CHCl 3 : MeOH (9:1) để sắc kí. Hiện kết quả trên bản mỏng bằng thuốc thử Dragendof. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết quả nghiên cứu tạo mô sẹo từ củ Trinh nữ hoàng cung của tác tác Quách Thị Liên và cộng sự cho thấy hai loại auxin nghiên cứu là NAA và 2.4D đều có tác dụng tốt tới khả năng tạo mô sẹo và sự sinh trưởng phát triển của mô sẹo [5]. Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy sự có mặt của 2,4D trong môi trường kích thích sự nhân nhanh và kéo dài tế bào lại ít kích thích sự sản xuất các chất trao đổi thứ cấp bằng IAA và NAA. Mặt khác, 2,4D là chất có khả năng gây ung thư nên được hạn chế dùng hoặc dùng với lượng rất nhỏ. Bảng 1. Ảnh hưởng của tổ hợp các chất ĐHST và nước dừa đến đặc điểm hình thái và sinh trưởng, phát triển mô sẹo cây TNHC. Môi trường NAA (mg/l) BAP (mg/l) Kinetin (mg/l) Nước dừa (%) Đặc điểm hình thái và sinh trưởng, phát triển mô sẹo SB1 2 0,5 Mô sinh trưởng tốt. Khối mô to, rắn chắc, có màu xanh lục. Hầu hết các mô tạo rễ to SB2 2 1,0 SB 3 2 1.5 Mô sinh trưởng tốt, rắn, màu xanh nhạt. Số mô tạo rễ ít SB4 2 2,0 Mô sinh trưởng chậm. Khối mô nhỏ, màu xanh nhạt. SK5 2 0,5 Mô sinh trưởng chậm. Khối mô đen và nhỏ. SK6 2 1,0 Mô sinh trưởng tốt. Khối mô có dạng hạt to, rắn chắc, màu xanh nhạt. Một số mô tạo nhiều rễ nhỏ. SK7 2 1,5 SK8 2 2,0 Mô sinh trưởng chậm. Khối mô nhỏ, màu xanh nhạt, ít rễ. SN9 2 10 Mô sinh trưởng tốt. Khối mô to, có dạng hạt to màu xanh nhạt, rắn chắc. Một số mô tạo rễ to. SN10 2 20 SN11 2 30 Mô sinh trưởng chậm. Khối mô nhỏ có màu xanh nhạt SN12 2 40 Ban đầu mô sùi trắng sau thâm đen và ngừng sinh trưởng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Vũ Thị Lan và đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 82(06): 65 - 69 67 Các thí nghiệm được chúng tôi bố trí trên nền môi trường cơ bản: MS + 30 g/l sucrose + 7% agar + 2mg/l NAA và bổ sung kết hợp với các chất ĐHST là BAP hoặc kinetin hoặc nước dừa ở các nồng độ khác nhau. Kết quả thu được trình bày ở bảng 1 và 2. Kết quả thu được cho thấy: hầu hết các môi trường nuôi cấy bổ sung kết hợp 2 mg/l NAA với BAP hoặc kinetin hoặc nước dừa mô sẹo đều sinh trưởng và phát triển tốt, khối mô to, rắn chắc, có màu xanh lục, vàng nhạt hoặc trắng sáng ngà. Quá trình sinh trưởng và phát triển của mô sẹo có sự liên quan mật thiết với sự phân hóa và phát sinh hình thái rễ. Ở những môi trường mô sẹo không tạo rễ, khối mô sẹo thường nhỏ, sinh trưởng chậm và nhanh già, thâm đen. Điều này hoàn toàn phù hợp vì nuôi cấy mô sẹo thường có xu hướng biệt hoá cơ quan tạo rễ hoặc chồi. Hình thái mô sẹo cây TNHC được chia làm ba loại sau: a) Mô sẹo màu xanh lục, khối mô to, xốp, và phân hoá nhiều rễ to. Loại mô này đặc trưng cho các môi trường bổ sung kết hợp với BAP (SB1 và SB2). b) Mô sẹo có màu vàng nhạt hoặc trắng sáng ngà, khối mô sẹo to, rắn chắc, có nhiều rễ nhỏ. Loại mô này đặc trưng cho các môi trường bổ sung kết hợp với kinetin (SK5, SK6) c) Khối mô sẹo to, dạng hạt, rắn chắc, có màu xanh lục và ít tạo rễ. Loại mô này đặc trưng cho các môi trường bổ sung kết hợp với nước dừa (SN9, SN10). Hình 1. Mô sẹo cây Trinh nữ hoàng cung (a) Rễ to; b) Rễ nhỏ; c) Không tạo rễ) Kết quả thu được ở bảng 2 cho thấy sinh khối mô sẹo thu được trên cả ba nhóm môi trường bổ sing tổ hợp các chất ĐHST khác nhau đã có sự khác biệt nhau rõ rệt. Tỉ lệ NAA/ BAP và NAA/ nước dừa khác nhau có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và phát triển mô sẹo, do vậy sinh khối mô sẹo thu được có sự dao động lớn từ 4,26 g/bình đến 31,66 g/bình sau 120 ngày nuôi cấy. Bảng 2. Ảnh hưởng của các chất ĐHST và nước dừa đến sinh khối mô sẹo cây TNHC Môi trường Trọng lượng tươi của mô (g/ bình) Ban đầu Sau 120 ngày Tăng so với ban đầu (lần) SB1 1,55 ± 0,09 26,5 ± 5,02 17,1 SB2 1,67 ± 0,55 31,66 ± 3,24 18,96 SB 3 1,45 ± 0,17 17,64 ± 5,30 12,17 SB 4 1,53 ± 0,23 5,68± 3,02 3,712 SK5 1,66 ± 0,44 7,02 ± 3,35 4,229 SK6 1,40 ± 0,21 22,59 ± 7,13 16,14 SK7 1,62 ± 0,63 24,88 ± 4,73 15,36 SK8 1,43 ± 0,25 5,02 ± 2,44 3,51 SN9 1,44 ± 0,17 23,26 ± 4,45 16,15 SN10 1,58 ± 0,26 24,3 ± 6,40 15,38 SN11 1,40 ± 0,11 10,99 ± 5,78 7,85 SN12 1,44 ± 0,18 4,21 ± 1,86 2,924 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Vũ Thị Lan và đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 82(06): 65 - 69 68 Đối với các môi trường MS bổ sung kết hợp 2mg/l NAA với BAP (môi trường từ SB1 đến SB4): Mô sẹo sinh trưởng và phát triển rất tốt và đồng đều ở giai đoạn đầu, sau đó tốc độ sinh trưởng của các môI trường mới có sự chênh lệch nhau. Sau 120 ngày nuôi cấy, sinh khối mô sẹo đạt cao ở môi trường SB1và SB2, lần lượt đạt 26,57 và 31,66 g/bình tăng 17,1 và 18,96 so với ban đầu. Sinh khối mô sẹo giảm dần ở các môi trường SB3 và SB4. Đối với các môi trường MS bổ sung kết hợp 2mg/l NAA với kinetin (môi trường từ SK5 đến SK8): Mô sẹo sinh trưởng và phát triển tương đối tốt, tuy nhiên giữa các môi trường khác nhau trọng lượng mô sẹo thu được có sự chênh lệch nhau. Sau 120 ngày nuôi cấy, sinh khối mô sẹo đạt cao và tương đương nhau ở môi trường SK6 và SK7, lần lượt đạt 22,58 và 22,48 g/ bình tăng 16,14 và 15,36 lần so với ban đầu. Đối với các môi trường MS bổ sung kết hợp 2mg/l NAA với nước dừa (môi trường SN10 –SN12): Mô sẹo đều sinh trưởng tốt ở giai đoạn đầu, sau đó mới có sự khác biệt giữa các môi trường. Môi trường SN9 và SN10, mô sinh trưởng và phát triển khá tốt, trọng lượng mô đạt được sau 120 ngày nuôi cấy lần lượt là: 23,26g và 24,30g. Định tính alcaloid trong mô nuôi cấy Sinh khối mô sẹo sau khi thu, được sấy khô và bảo quản để tiến hành các phân tích định tính ancaloit. Quy trình chiết alcaloid như trình bày ở phần phương pháp. Sau khi chiết, chúng tôi tiến hành chạy sắc kí lớp mỏng (SKLM) với hệ dung môi CHCl 3 : MeOH (9:1) đối với 12 mẫu sẹo thu được từ các thí nghiệm nuôi cấy sinh khối. Sắc kí đồ SKLM của các môi trường SB1- SN12 trên hình 2 cho thấy: hầu hết các mẫu mô đều có 1 phân đoạn màu da cam đậm tương đương với Rf của mẫu chuẩn (Rf = 0,6). Điều này chứng tỏ các mẫu mô sẹo nuôi cấy đều có chứa các hợp chất ancaloit. Ngoài ra, các mẫu mô sẹo còn có nhiều hơn từ 2-3 phân đoạn có Rf khác nhau nhưng do chưa được tinh sạch nên chưa tách biệt rõ ràng và ở dạng vết mờ. Hình 2. Sắc ký đồ SKLM, C: mẫu chuẩn; kí hiệu từ 1-12 là thứ tự các công thức SB1- SN12. Chúng tôi vẫn đang tiếp tục nghiên cứu để lựa chọn môi trường nuôi cấy đặc hiệu và tìm ra phương pháp tinh sạch nguyên liệu cho phương pháp SKLM đạt kết quả tốt hơn. KẾT LUẬN Môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng mô sẹo để thu sinh khối từ củ cây Trinh nữ hoàng cung là: - Môi trường SB1(MS + 2 mg/l NAA + 0,5 mg/l BAP) và SB2 (MS + 2 mg/l NAA + 1,0 mg/l BAP) - Môi trường SK6 (MS + 2 mg/l NAA + 1,0 mg/l kinetin) và SK7 (MS + 2mg/l NAA + 1,5 mg/l kinetin); - Môi trường SN9 (MS + 2mg/l NAA + 10% nước dừa) và SN10 (MS + 2 mg/l NAA + 20% nước dừa). Phương pháp sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi CHCl 3 : MeOH (9:1) thích hợp cho việc định tính alcaloid trong mô cây Trinh nữ hoàng cung nuôi cấy in vitro. Bước đầu đã định tính phát hiện có alcaloid trong các mẫu mô thu được TÀI LIỆU THAM KHẢO [1].Tạ Như Thục Anh, Phạm Văn Hiển (1998), ” Nghiên cứu nhân nhanh in vitro cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)”, Tạp chí Dược liệu, 3 (1), tr.13 – 16. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Vũ Thị Lan và đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 82(06): 65 - 69 69 [2]. Bùi Thị Bằng (2006), Các phương pháp sắc ký, Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, CI, Phần IV: Các phương pháp hoá lý ứng dụng trong phát triển và kiểm nghiệm dược liệu, NXB khoa học và kỹ thuật, tr.493 – 607. [3]. Nguyễn Văn Bằng, Vũ Đoan Trang, Nguyễn Thị Thu Hằng (1997), ”Bước đầu nghiên cứu cây Hoàng cung trinh nữ (Crinum Latifolium L) - Một cây thuốc có khả năng chữa bệnh ung thư”, Tạp chí Dược học, số 3, tr. 7-9. [4]. Võ Thị Bạch Huệ, Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, Ngô Vân Thu, Delome Frederic Daniel F, Michel Bechi (1999),”Khảo sát alcaloid chiết từ lá cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L., Amaryllidaceae) bằng kỹ thuật sắc kí ghép với khối phổ (GC- MS)”, Tạp chí Dược học, Số 4, tr.9-11. [5]. Quách Thị Liên, Vũ Thị Lan, Lê Thị Vân Anh, Nguyễn Đức Thành (2005),”Nuôi cấy mô sẹo cây Trinh nữ hoàng cung”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, số 3 (3), 353-362. [6]. Nguyễn Thị Minh, Trần Bạch Dương, Nguyễn Tuấn Anh, Phan Tống Sơn (1997), ” Đóng góp vào việc nghiên cứu các alcaloid của cây Tỏi lơi lá rộng (Crinum latifolium L.) của Việt Nam, Tạp chí HH & CNHC, số 3, tr. 13 - 16. [7]. Mai Đình Trị, Nguyễn Công Hào (2005), Phenylpropanoit và flavonol glycosides được cô lập từ lá tươi Trinh nữ hoàng cung (Crinum Latifolium L.)”, Tạp chí Hoá học, 43(2), 162-164. [8]. Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Kamenarska Z,, Bankova V., Popop S., Zvetkova E., Katzarovo E., Lê Mai Hương (2001),“ Hoạt tính gây độc tế bào của các phân đoạn alcaloid từ cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L. Amaryllidaceae)”, Tạp chí Dược học, số 11, 21 -23. [10]. Trần Văn Sung, Trịnh Phương Liên (1997), “Một số kết quả ban đầu về nghiên cứu thành phần hoá học cây Trinh nữ hoàng cung”, Tạp chí Hoá học, Số 1, 64-65. [11]. Elgorashi E.E., Drewes S.E., Johannes Van Staden (1999), “Alcaloids from Crinum bulbispermum”, Phytochemistry, 52, pp.533-536. [12]. Ghosal S., Sain K.S., Razdan S. (1985), “Crinum alcaloids: their chemistry and biology”, Phytochemistry, 24(10), 2141-2156. [9]. Phan Tống Sơn, Trần Bạch Dương, Phan Minh Giang, Nguyễn Thị Minh, Walter C. Taylor (2001), Nghiên cứu các alcaloid từ củ cây náng lá rộng (Crinum latifolium L., Amaryllidaceae) của Việt Nam“, Tạp chí Hoá học, Số 3, 83-88. SUMMARY EFECT OF GROWTH REGULATOR COMBINATION AND COCONUT MILK ON CALLUS BIOMASS OF (Crinum latifolium L.,) Vu Thi Lan 1∗ , Quach Thi Lien 2 , Nguyen Duc Thanh 2 1 College of Sciences - TNU, 2 Institute of Biotechnology Nowaday, scientists are interested in the practical aspects of plant tissue culture technology in order to biosynthesis of variety of natural compounds or bioactive compounds. In this paper, the results on callus biomass culture of Crinum latiffolium L. are presented. Callus formation affer 50 days having certain size and weight was used for callus biomass culture experiments. Callus pieces were cultured on MS medium containing 30 g/l sucrose, 7 g/l agar and added 2,0mg/l NAA in combination with BAP, kinetin and coconut milk. Affter 120 culture days, the obtained results indicated that the suitable media for callus biomass cultures were SB1and SB2 medium (MS added 2,0 mg/l NAA + 0,5 mg/l or 1,0 mg/l BAP); SK6 and SK7 medium (MS added 2,0 mg/l NAA + 1,0mg/l or 1,5mg/l kinetin); SN9 and SN10 medium (MS added 2,0 mg/l NAA + 10% coconut milk or 20% coconut milk). The method of thin layer chromatography used with solvent system CHCl 3 : MeOH (9:1) was suitable for qualification of alkaloid and early qualitative results showed that the alkaloid was presented in callus tissue biomass. Key words: Alcaloid, callus biomass, culture, Crinum latifolium L., medium. ∗ Tel: 091 4504250, Email: lanvtdhkhtn@gmail.com Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn