Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ.
BÀI BÁO CÁO Chủ đề: SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Tài liệu tham khảo: _TCVN 6427-2:1998 _LeoM.L.Nollet năm [1992], Food analysis by HPLC. Bùi Thị Như Thuận, Phạm Văn Sổ [1975], Kiểm nghiệm lương thực, thực phẩm của, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật – Hà nội. I. Khái niệm Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu: • Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý → sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography). • Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết (bonded phase chromatography) Pha động trong sắc ký pha đảo Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau: • Hòa tan mẫu phân tích. • Phù hợp với đầu dò. • Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh. • Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao. • Tinh khiết dùng cho sắc ký (HPLC grade). Trong đó độ phân cực và độ rửa giải có tác động lớn lên khả năng phân tách của các mũi sắc ký. Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt. II. Phân loại Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại: • Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography). • Sắc ký phân bố (partition chromatography). • Sắc ký ion (ion chromatography). • Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography). III. Sơ lược về hệ thống HPLC HPLC 10A HPLC 20A Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao gồm có các bộ phận cơ bản như sau: Hình 1: Sơ đồ hệ thống HPLC Trong đó: 1: Bình chứa pha động. 2: Bộ phận khử khí 3: Bơm cao áp 4: Bộ phận tiêm mẫu 5: Cột sắc ký (pha tĩnh) 6: Đầu dò 7: Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống. 8: In dữ liệu. IV.Nguyên lý hoạt động: Hệ thống dung môi (1) đóng vai trò là pha động được trộn với nhau theo một tỷ lệ thích hợp (được điếu chình bằng máy tính) và có thể thay đối thành phần bởi hệ thống (2) Gradient. Pha động được bơm liên tục nhờ hệ thống bơm cao áp (3) Mẫu phân tích được đưa vào cột phân tích nhờ bộ phận tiêm mẫu (4), sau đó được pha động đưa vào cột tách (5), quá trình tách xảy ra ở đây. Các chất ra khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau lần lượt vào deteeto (đầu dò 6), thích hợp và được chuyển thành thế hiệu điện rồi được khuếch đại và được chuyển tới hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống (7). Sau đó số liệu sẽ được in ra ở bộ phận in dữ liệu(8). 1. Bình chứa pha động : Máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp cho phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn và tổng tỉ lệ của 4 đường là 100%. Tuy nhiên, theo kinh nghiệm, ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng một lúc mà thường sử dụng 2 hoặc 3 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn giúp ổn định quá trình rửa giải. Lưu ý: Tất cả dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết sử dụng cho HPLC. Tất cả các hóa chất dùng để chuẩn bị mẫu và pha hệ đệm đều phải là hóa chất tinh khiết dùng cho phân tích. Việc sử dụng hóa chất tinh khiết nhằm tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo nên các peak tạp trong quá trình phân tích. 2. Bộ khử khí Degases Mục đích sử dụng bộ khử khí nhằm lọai trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động, tránh xảy ra một số hiện tượng có thể có như sau: • Tỷ lệ pha động của các đường dung môi không đúng làm cho thời gian lưu của peak thay đổi. • Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể lọai trừ hết được thì bơm cao áp có thể không hút được dung môi, khi đó ảnh hưởng đến áp suất và hoạt động của cả hệ thống HPLC. Trong các trường hợp trên đều dẫn đến sai kết quả phân tích. 3. Bơm cao áp Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký. Bơm phải tạt được áp suất cao khỏang 250-600bar và tạo dòng liên tục. Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 10ml/phút. 4. Bộ phận tiêm mẫu Để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm có thể thay đồi. Có 2 cách đưa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu tự động. 5. Cột sắc ký Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao. Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột thay đổi từ 5- 25cm đường kính trong 1-10mm, hạt nhồi cỡ 0.3-5µm,… Chất nhồi cột phụ thuộc vào lọai cột và kiểu sắc ký. 6. Đầu dò Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo tính chất của các chất phân tích mà người ta lựa chọn lọai đầu dò phù hợp. Tín hiệu đầu dò thu được có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,… Trên cơ sở đó, người ta sản xuất các lọai đầu dò sau: - Đầu dò quang phổ tử ngọai 190-360nm để phát hiện UV - Đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) (190-900nm) để phát hiện các chất hấp thụ quang. Đây là lọai đầu dò thông dụng nhất. - Đầu dò hùynh quang (RF) để phát hiện các chất hữu cơ chứa huỳnh quang tự nhiên và các dẫn suất có huỳnh quang. - Đầu dò DAD (Detector Diod Array) có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thụ cực đại của các chất. - Đầu dò khúc xạ (chiết suất vi sai) thường dùng đó các loại đường. - Đầu dò điện hóa: đo dòng, cực phổ, độ dẫn. - Đầu dò đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt,… 7. Bộ phận ghi nhận tín hiệu Bộ phận này ghi tín hiệu do đầu dò phát hiện. Đối với các hệ thống HPLC hiện đại, phần này được phần mềm trong hệ thống ghi nhận, lưu các thông số, sắc ký đồ, các thông số liên quan đến peak như tính đối xứng, hệ số phân giải,… đồng thời tính tóan, xử lý các thông số liên quan đến kết quả phân tich. 8. In dữ liệu Sau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ được in ra qua máy in kết nối với máy tính có cài phần mềm điều khiển. V. Ứng dụng HPLC phân tích mẫu tại CASE Phân tích đa lượng vitamin, kháng sinh, kháng khuẩn, chất bảo quản phụ gia thực phẩm, các loại đường,… trong thực phẩm, dược liệu, hóa chất, phân bón, thức ăn gia súc,… Phân tích vi lượng các vitamin trong trái cây, sữa, bánh kẹo, nước, thủy hải sản. Phân tích dộc tố sinh học biển trong nghêu (ASP). Phân tích các acid hữu cơ. Chiết vitamin B2 từ thực phẩm. 1.Chuẩn bị hoá chất thuốc thử: Hoá chất thuốc thử sử dụng là loại tinh khiết PA _ Dung dịch HCl 1N _ Dung dịch CH3COONa 0,05M _ Dung môi Methanol (Merck) _ Men amilase (Prolabo) _Acid acetic (Merck) _Dung dịch vitamin B2 chuẩn gốc 100ppm: Cân 0,0250g chuẩn vitaminB2 dạng riboflavin cho vào bình định mức 250ml, hoà tan và pha loãng tới vạch mức bằng nước. (Lắc và siêu âm để tan hoàn toàn, bọc giấy bạc tránh ánh sáng và bảo quản ở nhiệt độ 4oC) _dịch chuẩn làm việc vitamin B2 nồng độ 50, 25, 10, 5 ppm pha khi dùng. 2.Xử lý mẫu: - Đối với mẫu rắn phải nghiền hoặc xay nhỏ và đồng nhất kỹ đóng vào túi nilon hay hộp kín tránh hút ẩm. - Với mẫu thực phẩm lỏng: Đồng nhất và lắc trộn kỹ. - Với thực phẩm vừa lỏng vừa rắn phải lấy cả cái và nước đem nghiền kỹ và đồng nhất trước khi cân. * Tiến hành - Cân chính xác khoảng 0,1- 10g mẫu cho vào bình nón 250 ml. - Thêm vào mỗi bình 10 ml HCl 1N và 90 ml nước - Thuỷ phân trong nồi cách thuỷ ở 1000 o C trong 1 giờ. - Thêm vào mỗi bình 0,1g men Amilase - Đặt bình vào tủ ấm ủ 370 o C trong 18 giờ. - Định mức dung dịch đến 200ml hoặc 250 ml bằng nước cất và lọc. - Dịch lọc mẫu và chuẩn được bơm vào HPLC 3 Xây dựng đường chuẩn: Các dung dịch chuẩn vitaminB2 để xây dựng đường chuẩn có nồng độ là 20; 10; 5; 1, 0.5 mcg/ml. Dung dịch các chuẩn bơm vào máy HPLC, phần mềm của máy sẽ lập đường chuẩn tương quan giữa diện tích hoặc chiều cao pic với nồng độ chuẩn tương ứng. 4 Điều kiện chạy sắc ký. - Chạy sắc ký với detector FL bước sóng kích thích 422 và bước sóng phát xạ 522nm - Dung môi pha động Pha động: CH3COONa 0,05M. - Cột sắc ký pha ngược C18 - Tốc độ dòng 1ml/phút 5 Tính kết quả Căn cứ vào diện tích hay chiều cao pic của mẫu và đường chuẩn xây dựng được, tính hàm lượng vitaminB2 theo công thức sau. X(mcg/g)= 200 x Cm / m Trong đó : 200 là thể tích bình định mức của dịch sau thuỷ phân (ml) Cm là nồng độ mẫu phân tích tính theo đường chuẩn (mcg/ml) hay nồng độ một dung dịch chuẩn. m Khối lượng mẫu lấy phân tích (g). Định lượng vitamin C 1.Chuẩn bị hoá chất thuốc thử: Hoá chất thuốc thử sử dụng là loại tinh khiết PA _ Dung dịch HCl 1N _ Dung dịch CH3COONa 0,05M _ Dung môi Methanol (Merck) _Men amilase (Prolabo) _ Acid acetic (Merck) _ Dung dịch vitamin B2 chuẩn gốc 100ppm: Cân 0,0250g chuẩn vitaminB2 dạng riboflavin cho vào bình định mức 250ml, hoà tan và pha loãng tới vạch mức bằng nước. (Lắc và siêu âm để tan hoàn toàn, bọc giấy bạc tránh ánh sáng và bảo quản ở nhiệt độ 4oC) 6.7 Dung dịch chuẩn làm việc vitamin B2 nồng độ 50, 25, 10, 5 ppm pha khi dùng. 2.Lấy mẫu và xử lý mẫu Cần loại bỏ hạt và những vách cứng của khoang chứa hạt rồi trộn kĩ mẫu. Vitamin C rất dễ bị oxi hóa trong không khí nhất là khi có sự hiện diện của các ion kim loại (Fe, Cu). Vì vậy trong khi chuẩn bị mẫu phải cắt hoặc nghiền bằng dao không rỉ và làm nhanh. Lọc và tiến hành xác định với dung dịch lọc. Để sản phẩm tan trong một bình kín và dịch tan chảy này vào sản phẩm trước khi nghiền trộn mẫu 3.Chuẩn bị mẫu: Cân chính xác 10 g chuẩn (±0.1 mg) cho vào bình định mức 10ml,hòa tan bằng dung môi methanol.Từ chuẩn 1000 ppm,ta pha thành các chuẩn 100 ppm,50 ppm,10 ppm. 4.Tiến hành phân tích trên HPLC : Điều kiện phân tích - Cột sắc ký : cột pha đảo - Pha động: Hỗn hợp (methanol: acetonitrile) - Tốc độ dòng : 0.7ml/phút - Bước sóng cài đặt cho đầu dò : 254nm Tiêm các dung dịch mẫu thử nghiệm theo thứ tự : - Các dung dịch chuẩn. Dựng đường chuẩn giữa nồng độ các vitamin C và diện tích của các chuẩn Vitamin C. Tính toán hệ số tương quan hồi quy tuyến tính. - Các dung dịch mẫu thử nghiệm. Tính hàm lượng Vitamin C trong dịch chiết (Co) thông qua đường chuẩn đã xây dựng. Đảm bảo chất lượng : Đường chuẩn phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quang hồi quy tuyến tính (R 2 ) phải lớn hơn hoặc bằng 99. 5.Tính Kết Quả : Hàm lượng Vitamin C (mg/kg) có trong mẫu ớt được tính theo công thức sau C=( ) × Vdd × f Trong đó : C là hàm lượng Vitamin C có trong mẫu, tính theo mg/kg Co: Hàm lượng Vitamin C Có trong dịch chiết ( Co) thông qua đường chuẩn mg/l f: hệ số pha loãng (nếu có) . HPLC thành 4 loại: • Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography). • Sắc ký phân bố (partition chromatography). • Sắc ký ion (ion chromatography). • Sắc ký rây phân tử (size. pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng. thống sắc ký lỏng hiệu năng cao gồm có các bộ phận cơ bản như sau: Hình 1: Sơ đồ hệ thống HPLC Trong đó: 1: Bình chứa pha động. 2: Bộ phận khử khí 3: Bơm cao áp 4: Bộ phận tiêm mẫu 5: Cột sắc ký