kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp và cách xác định thành phẩn amino acid của một số loài nấm bào ngư

Hiện nay, nấm bào ngư đang dần trở thành một trong những khẩu phần chính trong bữa ăn của người dân. Bên cạnh mùi vị thơm ngon, giàu dinh dưỡng, rất dễ chế biến, nấm còn được xem như là một loại “rau sạch” và có giá trị dược liệu. Sản lượng nấm bào ngư tăng lên rất nhanh trong vài thập kỷ qua. Theo thống kê của Chang và ctv (1999) chỉ trong vòng 36 năm trở lại đây tổng sản lượng nấm trồng tăng gấp 21 lần từ 350.000 năm 1965 tăng lên 7,5 triệu tấn, trong đó nấm bào ngư Pleurotus spp. tăng từ 169000 tấn năm 1986 lên 876000 tấn năm1997.

Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Hiện nay, nấm bào ngư dần trở thành phần bữa ăn người dân Bên cạnh mùi vị thơm ngon, giàu dinh dưỡng, dễ chế biến, nấm xem loại “rau sạch” có giá trị dược liệu Sản lượng nấm bào ngư tăng lên nhanh vài thập kỷ qua Theo thống kê Chang ctv (1999) vòng 36 năm trở lại tổng sản lượng nấm trồng tăng gấp 21 lần từ 350.000 năm 1965 tăng lên 7,5 triệu tấn, nấm bào ngư Pleurotus spp tăng từ 169000 năm 1986 lên 876000 năm1997 Gần đây, Việt Nam phát triển cơng nghệ trồng nấm nước Vì thế, ngồi việc khai thác nấm hoang dại đem trồng, nước ta nhập nhiều loại nấm bào ngư khác từ nước Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản Trong số đó, có số lồi biết rõ thành phần dinh dưỡng, số loài cịn lại thành phần chưa cơng bố thức, đặc biệt thành phần amino acid Vì thế, việc xác định thành phần amino acid nấm bào ngư Việt Nam điều cần thiết để đánh giá giá trị sinh học, so sánh khác chúng Từ xưa đến nay, việc xác định amino acid thực nhiều công cụ khác như: sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng Phân tích amino acid cơng cụ phân tích truyền thống đòi hỏi nhiều thời gian phức tạp Ngày nay, với phát triển kỹ thuật phân tích, việc xác định thành phần amino acid mẫu sinh hóa đơn giản nhiều, hầu hết cơng cụ tự động hóa nối trực tiếp phận xử lý số liệu Hiện nay, thị trường tồn nhiều kỹ thuật phân tích amino acid như: sắc ký lỏng cao áp, HPLC (high performance liquid chromatography), sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography), điện di mao quản (capillary electrophoresis) Trong phạm vi cho phép, thực “Phân tích amino acid sắc ký lỏng cao áp” số lồi nấm có thị trường Việt Nam Từ đó, với kết thu tiến hành so sánh với đối tượng khác khác chúng liệu thành phần amino acid loài nấm bào ngư lưu lại để làm sở cho nghiên cứu sau 1.2 Mục đích So sánh thành phần amino acid lồi nấm bào ngư có thị trường Việt Nam Khi đó, chúng tơi chọn loài phù hợp để so sánh thành phần amino acid trồng chất khác 1.3 Yêu cầu Tạo đựợc mẫu có độ tinh cao Tránh tượng làm thay đổi tính chất mẫu oxy hóa, halogen hóa, hay làm mẫu bị hủy hồn tồn trình thủy phân Sử dụng thiết bị HPLC (high performance liquid chromatography) Trung tâm Phân Tích Hóa Lý để phân tích thành phần amino acid loài nấm kể 1.4 Nội dung thực Thu thập nhân giống lồi nấm có thị trường Ni trồng lồi nấm mơi trường mùn cưa có bổ sung số vi lượng Tiến hành thu thể Xác định thành phần amino acid loài nấm bào ngư sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nấm trồng 2.1.1 Khái niệm nấm Hiện nay, số loài nấm trồng chiếm phần nhỏ số nấm ăn thiên nhiên Ngoài đặc điểm chung thể hay tai nấm có kích thước lớn (đa số dạng tán dù), chúng cịn ăn ngon giàu dinh dưỡng [5] Nấm phong phú đa dạng, bao gồm loại ăn khơng ăn được, lồi cho thể lớn thấy mắt thường lồi phải sử dụng kính hiển vi quan sát [5] Ban đầu nấm xếp vào giới thực vật Tuy nhiên, quan điểm ngày khơng cịn thuyết phục nhiều nhà phân loại học đề nghị xếp nấm vào giới riêng, gọi giới nấm Sở dĩ xếp Nấm thành giới riêng mà khơng xếp vào giới Thực vật nấm khơng có lục lạp, khơng có sắc tố quang hợp, khơng có đời sống tự dưỡng thực vật, khơng có phân hóa thành rễ, thân, lá, khơng có hoa, phần lớn không chứa cellulose thành tế bào [1] Thành tế bào Nhân Lysosome Màng tế bào chất Bộ máy golgi Ti thể Ribosome Mạng lưới nội chất Hình 2.1 Cấc trúc tế bào nấm (Nguyên Lân Dũng, 2001) Nấm ăn có cấu tạo chủ yếu hệ sợi nấm Các sợi nấm ăn có dạng ống trịn Các ống có vách ngăn Sợi nấm cịn gọi khuẩn ty (hypha), hệ sợi nấm gọi khuẩn ty thể (mycelium) Khoảng cách hai vách ngăn gọi tế bào Tế bào nấm có đặc trưng riêng, khác biệt với tế bào động vật thực vật Trước hết thành tế bào Dưới kính hiển vi điện tử quan sát thấy thành tế bào cấu tạo nhiều lớp Nếu thành tế bào thực vật cấu tạo chủ yếu cellulose thành tế bào nhóm nấm khác lại có cấu tạo thành phần khác Hầu hết lồi nấm đảm có thành tế bào cấu tạo chủ yếu kitin- glucan Thông qua lỗ vách ngăn, chất nguyên sinh di chuyển dễ dàng sợi nấm.[1] Trong tế bào sơi nấm quan sát kính hiển vi quang học phóng đại từ 1000 đến 1500 lần (Hình 2.1) thấy Màng tế bào Nhân tế bào Bộ máy golgi Ribosome Lysosome Ti thể Mạng lưới nơi chất Sợi nấm phát triển từ bào tử hay tử đoạn sợi nấm Bào tử nảy mầm theo nhiều hướng khác nhau, sợi nấm phân nhánh nhiều lần, tạo nên hệ sợi chằng chịt thường có màu trắng Riêng nấm đảm nói chung thường có tới cấp sợi nấm Sợi nấm cấp (sơ sinh), sợi nấm cấp hai (thứ sinh) sợi nấm cấp ba (tam sinh) Sợi nấm cấp lúc đầu khơng có vách ngăn có nhiều nhân, dần tạo thành vách ngăn phân thành nhiều tế bào đơn nhân sợi nấm Sợi nấm cấp hai tạo thành phối trộn hai sợi nấm cấp Khi nguyên sinh chất hai sợi nấm phối trộn với Hai nhân đứng riêng rẽ làm cho tế bào có hai nhân Người ta gọi sợi nấm loại sợi nấm song nhân (dycaryolic hyphae) Sợi nấm cấp ba sợi nấm cấp hai phát triển thành Các sợi nấm nà y liên kết chặt chẽ với tạo thành thể [1] 2.1.2 Sinh sản chu trình sống Khả sinh sản đặc điểm quan trọng nấm Một tai nấm rơm trưởng thành phóng hàng tỉ bào tử Nhờ vậy, nấm phát triển nhanh phân bố rộng Bào tử nấm phổ biến có hai dạng: vơ tính hữu tính Ở vi nấm, nấm mốc lan truyền chủ yếu nhờ bào tử vơ tính, chúng gây nhiễm khắp nơi dạng hạt bụi nhỏ li ti, màu sắc khác tùy loài Riêng nấm ăn, bào tử sinh bên cấu trúc đặc bịêt gọi mũ nấm hay tai nấm Mũ nấm thường có cuống nâng lên cao để nhờ gió đưa bào tử xa Bào tử nẩy mầm cho lại hệ sợi nấm [3] Người ta quen gọi hệ sợi nấm giai đoạn tăng trưởng (hay dinh dưỡng) tản dinh dưỡng, phân biệt với thể nấm (hay quan sinh bào tử hữu tính nấm) tản sinh sản Hầu hết nấm trồng nấm đảm, quan sinh sản có có cấu tạo đặc biệt tai nấm Tai nấm chủ yếu gồm mũ cuống nấm Mũ thường có dạng nón hay phễu, với cuống đính hay bên Mặt mũ nhóm cấu tạo phiến mỏng xếp sát vao hình nan quạt Ở số trường hợp, phiến nấm kéo dài từ mũ xuống cuống (chân nấm), nấm bào ngư (Pleurotus) [3] Bào tử đảm (basidiospore) tạo bề mặt phiến, cấu trúc đặc biệt gọi đảm (basidium) Riêng nấm đậu (Coprinus), tai nấm trưởng thành mũ nấm chảy thành dịch nước đen mang theo bào tử đảm; bào tử khác rụng bay theo gió Đảm tạo thành từ đầu sợi nấm Tế bào phồng to bên hai nhân đứng riêng lẻ, nhập lại thành nhân Quá trình gọi trình thụ tinh [3] Nhân thụ tinh phân chia cuối tạo nhân Bình thường nhân khối sinh chất đẩy vào gai nhỏ (xuất đảm) để tạo đảm bào tử, đảm bào tử lúc hai nhân nấm rơm (tỉ lệ chiếm đến 1/4) đặc biệt nấm mỡ (Agaricus bisporus) sinh hai đảm tử, bào tử chứa hai nhân Các tế bào đảm hợp lại thành lớp bề mặt phiến, gọi lớp thụ tầng (hymennium) đảm bào tử thành lớp phủ trên bề mặt phiến Điều thấy rõ nấm rơm, trưởng thành phiến nấm chuyển sang màu đỏ màu bào tử Người ta phân biệt nấm đồng đảm (homobasidiomycetidae) nấm dị đảm (hemibasidiomycetidae) dựa vào cấu trúc đảm Nấm đồng đảm có đảm tế bào đồng nhất, nấm dị đảm hay tiền đảm chia làm phần, phần tạo đảm bào tử Đảm bào tử bào tử hữu tính, rụng bay khắp nơi Khi gặp điều Quả thể Phiến nấm Hình thành thể Sợi nấm song nhân Quá trình dung hợp Sợi nấm thứ cấp (song nhân) Sợi âm Giảm phân hình thành bào tử đảm Hợp tử Bào tử đảm Sợi dương Sợi nấm sơ cấp (đơn nhân) Hình 2.2 Chu kỳ sống nấm đảm ( Peter H Raven ctv, 1992) kiện thuận lợi nẩy mầm cho lại hệ sợi nấm Hệ sợi nấm thường có nhân nên gọi sợi nấm sơ cấp (primary mycelium) Đối với nấm dị tản (heterothallic), phải có phối hợp hai sợi nấm sơ cấp phát sinh từ hai bào tử có đặc tính di truyền khác hoàn thành sợi nấm thứ cấp (secondary mycelium) Trong nấm đồng tản (homothallic) cần hệ sợi sơ cấp từ bào tử nẩy mầm tự phối cho hệ sợi nấm thứ cấp Từ hệ sợi nấm thứ cấp chứa hai nhân, nấm phát triển thành mạng sợi, lan khắp nơi chất để hút chất dinh dưỡng Trong trường hợp bị đứt khúc, sợi nấm tự làm lành vết thương tái lập lại hệ sợi, tương tự trồng giâm hay chiết cành Ở điều kiện định, ẩm độ, nhiệt độ thích hợp, hệ sợi nấm bện lại tạo thành hạch nấm Hạch nấm tiếp tục phát triển cho thể trưởng thành.[3] Ở nấm đảm, phối hợp nguyên sinh chất hai sợi nấm cấp xảy sớm, sợi nấm song nhân hình thái chủ yếu sợi nấm Quả thể sợi nấm song nhân liên kết lại tạo thành Sợi nấm song nhân mặt di truyền đuợc biểu thị (n+n) khác với sợi nấm đơn nhân n hợp tử 2n [1] Ở số lồi cịn có dạng bào tử khác gọi hậu bào tử hay bào tử màng dày (Chlamydospore), thí dụ nấm rơm Hậu bào tử giống bào tử thu nhỏ với đầy đủ nguyên sinh chất hai nhân đặc có vách tương đối dày bao bọc Có thể xem dạng sống tiềm sinh nấm sau bào tử nẩy mầm cho lại hệ sợi nấm thứ cấp [3] 2.1.3 Đặc điểm biến dưỡng sinh lý Nấm chủ yếu sống dị dưỡng, lấy thức ăn từ nguồn hữu (động vật thực vật) Ngoại trừ niêm khuẩn thay đổi hình dạng tế bào để nuốt lấy thức ăn (tương tự động vật), cịn lại hầu hết lồi nấm nấm lấy dinh dưỡng qua màng tế bào hệ sợi (giống rễ thực vật) Nhiều lồi nấm có hệ enzym phân giải tương đối mạnh, giúp chúng sử dụng dạng thức ăn phức tạp, bao gồm đại phân tử (cellulose, hemicellulose), chất đạm (protein), chất bột (amidon, polysaccharide), lignin.Với cấu trúc sợi, tơ nấm len lỏi sâu vào chất (rơm, rạ, mạt cưa nhiều chất khác) rút lấy thức ăn đem nuôi toàn thể nấm (tản dinh dưỡng hay tản sinh sản) [3] Dựa theo cách thức dinh dưỡng nấm chia thành nhóm: Hoại sinh: Đặc tính chung hầu hết lồi nấm, có nấm trồng Thức ăn chúng xác bã động thực vật Nhóm nấm có hệ enzym tiêu hoá tương đối mạnh, phân giải nhiều loại chất Chúng có khả biến chất thành chất có thành phần đơn giản để hấp thụ Tuy nhiên, có trường hợp nấm phân giải chất mà phải nhờ vào vi sinh vật khác (vi khuẩn, nâm mốc, xạ khuẩn) tiến hành trước bước[3] Ký sinh: Bao gồm chủ yếu loại nấm gây bệnh Chúng sống bám vào loài sinh vật khác (động vật, thực vật, lồi nấm khác) Thức ăn chúng chất lấy từ thể ký chủ, làm suy yếu làm tổn thương ký chủ Một số nấm ăn sống cịn tươi đời sống thực hoại sinh, nên xếp vào nhóm trung gian, gọi nhóm bán ký sinh (trường hợp nấm mèo) Cộng sinh: Đây nhóm đặc biệt, lấy thức ăn từ thể chủ không làm chết gây tổn thương ký chủ, ngược lại giúp chúng phát triển tốt Vì lồi ký chủ có mối quan hệ mật thiết với Do đó, việc nuôi trồng trở nên phức tạp hơn, thường giống nấm cấy lúc với việc trồng (thí dụ nấm Tuber Boletus) 2.2 Nấm bào ngư 2.2.1 Giới thiệu Nấm bào ngư (còn gọi nấm sò, nấm bình cơ, oyster mushroom) gồm nhiều lồi thuộc: Chi Pleurotus Họ Pleurotaceae Bộ Agaricales Lớp phụ Hymenomycetidae Lớp Hymenomycetes Ngành phụ Basidiomycotina Ngành nấm thật-Eumycota Giới nấm Mycota hay Fungi Nấm bào ngư có tới 50 lồi khác Tuy nhiên, số lồi ni trồng khơng nhiều, khoảng 10 lồi [2] Nấm bào ngư ni trồng rộng rãi giới Ở châu Âu nấm bào ngư trồng Hungary, Đức, Ý, Pháp, Hà Lan Ở Châu Á nấm bào ngư trồng Trung Quốc với sản lượng cao (khoảng 12 nghìn năm) giá khoảng 2.2 triệu đồng Việt Nam Ngoài Trung Quốc, nấm trồng Nhật Bản, Việt Nam, Hàn Quốc, Thái Lan Ấn Độ [2] Nấm bào ngư khơng ăn ngon mà cịn có giá trị dinh dưỡng cao Trong nấm chứa đầy đủ amino acid Ngồi giá trị dinh dưỡng, nấm bào ngư cịn có giá trị dược liệu Nhiều nghiên cứu cho thấy nấm bào ngư số nấm ăn khác có tác dụng chống ung thư Bằng phương pháp khuếch tán vào thạch nhóm nghiên cứu Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên cho thấy nấm bào ngư Pleurotus sajor - caju dạng bán cầu lệch có tác dụng ức chế chủng Vi khuẩn Gran dương S aureus B subtilis chủng Gram âm E coli Pseudomonas aeruginosa [5] Ngoài ra, theo nghiên nhà khoa học Trung Quốc – Phó Liên Giang nấm bào ngư cịn có khả làm giảm lượng cholesterol máu [3] Một đặc điểm quan trọng nấm hệ enzym Nhờ enzym cellulase số enzym khác, nấm bào ngư khả chuyển hố cellulose thành chất góp phần giải nạn ô nhiễm môi trường chất thải nông nghiệp tạo bã mía, rơm rạ Ngồi ra, nấm cịn có khả phân hủy thuốc trừ cỏ Antrazin nhờ vào gia tăng enzym P – 450 hệ Cytochromeoxxygenase peroxydase (Sannia ctv, 1990) [3] Nấm bào ngư có đặc điểm chung tai nấm dạng phễu lệch, phiến nấm mang bào tử kéo dài xuống chân Cuống nấm gần gốc có lơng mịn Tai nấm cịn non có màu sắc tối, trưởng thành trở nên sáng Quả thể nấm bào ngư phát triển qua nhiều giai đọan, dựa theo hình thái tai nấm mà tên gọi cho giai đoạn khác Dạng san hô: thể tạo thành dạng sợi mãnh hình chùm Dạng dùi trống: mũ xuất dạng khối tròn Dạng phễu: mũ mở rộng cuống Dạng bán cầu lệch: cuống lớn nhanh bên so với vị trí trung bình Dạng lục bình: cuống ngừng tăng trưởng, mũ phát triển Nấm bào ngư có chu trình phát triển loài nấm đảm khác, bắt đầu đảm bào tử hữu tính, nẩy mầm cho hệ sợi tơ dinh dưỡng (sơ cấp thứ cấp) “kết thúc” việc hình thành quan sinh sản tai nấm Tai nấm sinh đảm bào tử chu trình lại tiếp tục [3] 2.2.2 Một số lồi nấm bào ngư ni trồng VIệt Nam Hiện nay, nấm bào ngư trồng rộng rãi Việt Nam miền Bắc lẫn miền Nam khí hậu nước ta thuận lợi cho việc phát triển loài nấm Hiện nay, nấm bào ngư trồng với nhiều chủng loại (khoảng loại) tập trung nhiều Đà Lạt Hầu hết dòng nấm nuôi trồng nước ta giống nhập từ nước ngồi Tuy nhiên có số khai thác địa lý Việt Nam sau đêm ni trồng điều kiện nhân tạo 10 Bảng 2.1 Nhiệt độ thích hợp số nấm bào ngư (Lê Duy Thắng, 1999) Lồi nấm Nhiệt độ thích Nhiệt độ thích hợp hợp cho tơ tăng cho nấm ( C) 0 trưởng ( C) Pleurotus floridanus 25-30 25 Pleurotus sajor - caju 25-30 25 Pleurotus pulmonarius 22-28 25 Pleurotus abalonus 27-32 25 Pleurotus flabellatus 20-28 20-25 2.2.2.1 Nấm bào ngư Pleurotus floridanus (Hình 2.6) o Đây lồi thích nghi với nhiệt độ rộng từ - 30 C Quả thể màu trắng sữa Có tính kháng tạp nấm, tạp khuẩn cao Sợi nấm có họat tính mạnh việc phân giải cellulose Sản lượng đơn vị nguyên liệu tương đối cao Nấm thích nghi với nhiều loại chất khác nhau: bã mía, mùn cưa, rơm, trấu Khi trồng trấu, suất đạt đợt thể 114g nấm tươi 360 g nguyên liệu có bổ sung ure, KH2PO4, cám gạo [4] 2.2.2.2 Nấm bào ngư Pleurotus sajor - caju (nấm sò phượng vỹ hay nấm sị dạng phễu) Quả thể hình thành nhiệt độ tương đối cao so với loài nấm khác Gần đây, nấm dần chiếm thị trường thể chắc, ăn ngon thích hợp khí hậu Việt Nam Ngồi ra, dịch chiết từ nấm ức chế số loài vi khuẩn: S aureus B subtilis, E coli Pseudomonas aeruginosa [5] Ngồi chất thơng thường, gần nấm trồng chất mai dương để chống xâm lấn chúng góp phần giải nạn mơi trường Lồi nấm nhập từ Nhật Bản nuôi trồng thành công mùn cưa 23 PHẦN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1.Thời gian, địa điểm thực vật liệu nghiên cứu 3.1.1 Thời gian thực Khóa luận thực từ ngày 14/2/2005 đến ngày18/8/2005 3.1.2 Địa điểm Trung tâm Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nơng Lâm Phịng Hóa Lý, Trung tâm Phân Tích Thí nghiệm Hóa Sinh, Đại học Nông Lâm 3.1.3 Vật liệu nghiên cứu Giống nấm Nguồn cung cấp Pleurotus floridanus Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP Hồ Chí Minh Pleurotus sajor – caju Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP Hồ Chí Minh Pleurtus abalonus Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP Hồ Chí Minh Pleurotus pulmonarius Viện hạt nhân Đà Lạt (Lê Viết Ngọc) Pleurotus flabellatus Viện hạt nhân Đà Lạt (Lê Viết Ngọc) 3.2 Hóa chất, dụng cụ thiết bị 3.2.1 Hóa chất HCl 6N ACN (Acetonitril) Phenol Glucose PITC (phenylisothiocyanate) Saccharose Methanol KH2PO4 Ethanol MgSO4 Nước khử ion Sodium acetate TEA (Triethylamine) HNO3 đậm đặc Chuẩn hỗn hợp 17 amino acid EDTA 24 3.2.2 Thiết bị dụng cụ 3.3 Thiết bị Dụng cụ Tủ cấy vô trùng Ống nghiệm Tủ sấy Đĩa petri Φ cm Tủ mát Bình tam giác Nồi hấp khử trùng Bình lê Máy HPLC Pipett 0.1-10 µl Thiết bị thổi khí trơ Pipett 10-100 µl Cột Pico-Tag Filter Φ 0.20 µm Phương pháp nhân giống trồng nấm 3.3.1 Môi trường Môi trường Môi trường hạt Môi trường giá môi Môi trường giá thể thạch (PGA) Cám gạo Khoai mì Mùn cưa Khoai tây CaCO3 Cám gạo Cám gạo Lúa KH2PO4 KH2PO4 Glucose Agar MgSO4 CaCO3 MgSO4 25 3.3.2 Phương pháp 3.2.2.1 Chuẩn bị mơi trường PGA - Khoai tây bóc vỏ, rửa Cân 200 g, đun sôi, lọc lấy nuớc - Thêm 20 g agar, cho thêm nước cất để đủ lít, đun tan agar - Cho vào ống nghiệm (khoảng 1/5 so với chiều cao ống nghiệm), đậy nút - Hấp khử trùng 121 C, 1.2 atm, 20 phút Lấy ra, để nghiêng chuẩn bị cho cấy chuyền - dòng nấm bào ngư sau đem phịng thí nghiệm, tiến hành cấy o chuyền sang môi trường thạch nghiêng PGA 3.2.2.2 Chuẩn bị môi trường hạt - Lúa đun sôi, nứt nanh, trộn với CaCO3 (2%) , cám gạo (10%) - Cho vào bình tam giác, hoăc bình thủy tinh, hấp khử trùng 121 C, 1,2 atm, o 90 phút - Khi tơ nấm phát triển đầy ống nghiệm, chúng cấy sang môi trường hạt đem để bóng tối Tùy theo lồi mà thời gian phát triển đầy bình khác Trong q trình đó, chuẩn bị môi trường giá môi 3.3.2.3 Chuẩn bị môi trường giá mơi - Cọng mì cắt khoảng 15 – 20 cm, tùy theo kích thước túi ny lơng, ngâm khoảng 24 giờ, trộn với số hóa chất khác KH2PO4, MgSO4 với tỉ lệ định ( 2% MgSO4 % KH2PO4) o - Hấp khử trùng 121 C , 1,2 atm 90 phút - Khi tơ nấm phát triển đầy bình tam giác, tạo màu trắng mịn bình, cấy sang mơi trường giá mơi 3.2.2.4 Chuẩn bị môi trường nuôi trồng - Mùn cưa sàn lọc loại bỏ rác mảnh có kích thước lớn - Ngâm nước vôi 5% 24 - Bổ sung cám gạo, bột bắp, cho vào túi ny lơng bình thủy tinh o - Hấp khử trùng 90 phút, 1atm, 121 C để ngày sau hấp khử trùng tiếp lần thứ 26 - Cấy giống từ môi trường giá môi sang - Ủ tối, thấy tơ phát triển đầy trắng , phủ kín bịt phơi, có giọt nước li ti thành túi tiến hành cắt túi dụng cụ khử trùng - Đem nhà ni trồng, tưới đón nấm - Nấm sau hái, cân tính trọng lượng tươi, sau đem sấy khô, bảo quản tủ lạnh, để chuẩn bị cho phân tích amino acid - Tiếp tục tưới đón nấm - Sau hái nấm lần hai, nấm lượng nấm đem cân trọng lượng tươi, chất đem sấy khơ, tính trọng lượng chúng - Tính suất sản phẩm - Tất nấm hái đem đo đường kính để tính trung bình 3.2.2.5 Tóm tắt quy trình [1, 2] - Khoai tây 200 g / lít - Glucose 20 g / lít Giống nấm - Agar 20 g / lít - Lúa nấu (88 %) - CaCO3 (2%) Môi trường hạt - Cám gạo (10%) Cấy sang môi trường giá môi Môi trường giá mơi - Cọng mì (87 %) - MgSO4 ( 2%) - KH2PO4 (1 %) - Cám gạo (10 %) - Mùn cưa (84 %) - Cám gạo (10 %) Giá thể trồng ủ tối Tưới đón nấm Thu thể - Bột bắp (5,5 %) - KH2PO4 (0,5 %) 27 3.3.3 Phân tích amino acid Mẫu nấm sau thu hoạch đem phân tích thành phần amino acid Chúng tơi tiến hành phân tích mẫu: Pleurotus pulmonarius, Pleurotus flabellatus Q trình phân tích thành phần amino acid loại nấm thực theo quy trình Thomas T Andersen cộng 3.3.3.1.Thủy phân mẫu - Cho g mẫu cắt nhỏ vào tube chịu nhiệt làm khô - Thêm vào 10 ml dung dịch HCl 6N - Loại bỏ khơng khí cách thổi khí trơ vào khoảng không tube đựng dung dịch mẫu o - Thủy phân 152 C 1h Lấy ra, để nguội, lọc qua giấy lọc - Cho vào lọ, dán nhãn để tủ mát Với nhiệt độ cao điều kiện acid có nồng độ cao (HCl 6N), protein sê phân cắt thành amino acid đơn (Hình 2.10) 3.3.3.2 Tạo dẫn xuất Khi phân tích thành phần amino acid HPLC, mẫu phải tạo dẫn xuất với PITC để phát thơng qua detector Q trình tạo dẫn xuất thực sau: - Hút 2µl mẫu cho vào bình lê có đáy nhọn - Làm khơ hỗn hợp dung dịch ethanol, nước TEA với tỷ lệ tương ứng 2:2:1 Quá trình thực điều kiện có thổi khí trơ để loại bỏ acid cịn thừa lại q trình thủy phân giúp cho PITC bắt với amino acid dễ dàng Bởi tác động phức hợp đăc biệt TEA giúp cho amino bị khử proton, PITC gắn vào - Mẫu tạo dẫn xuất với dung dịch ethanol: nước: TEA: PITC = 7:1:1:1 khoảng đến 10 phút tối Khi PITC gắn vào đầu amin amino acid (Hình 2.11), Theo Molnar-Perl, (1994), phản ứng gắn bền, bảo quản điều kiện lạnh chúng ổn định tháng) 28 - Mẫu phân tích đem thổi khơ với khí trơ Bước quan trọng trình tạo dẫn xuất loại bỏ tác nhân sau dẫn xuất Điều thực điều kiện chân khơng thổi khí trơ trích với heptane (Thomas T Andersen, 1995) Với điều kiện phịng thí nghiệm chúng tơi tiến hành phương pháp thổi khơ với khí trơ Nếu PITC khơng loại thải tốt làm hư phá hủy cột HPLC - Mẫu pha loãng ml dung dịch pha loãng mẫu lọc qua phận lọc đường kính 20 µm để chuẩn bị cho phân tích HPLC 3.3.3.3 Phân tích HPLC Quá trình thực phân tách HPLC thực với: Buffer A: sodium acetate TEA, pH 6,8 Buffer B: 60% acetonitile, nước 40% (v/v) Cột: Pico- Tag, 3.9 mm x 15 cm Detector: Ultra-violet (UV) Tốc độ dịng: ml / phút Bước sóng: 254 nm Q trình thực hiện: - Hút 20 µl dung dịch chuẩn 17 amino acid, bơm theo dõi - Lưu lại thơng số cần thiết để tiến hành định tính định lượng (thời gian lưu, diện tích peak,…) - Hút 20 µl mẫu, tiến hành tương tự chuẩn 3.3.3.4 Phân tích tính tốn kết Sau bơm chuẩn, ta có liệu thu từ máy tính thời gian phát peak, diện tích peak thể sắc ký đồ Các thông số lưu lại để tính hay để định lượng cho mẫu phân tích Có nhiều cách để định lượng amino acid đơn: Dùng chuẩn với nồng độ khác nhau, sau lập phương trình hồi quy diện tích peak nồng độ với hệ số tương quan xác định Từ diện tích peak mẫu biết qua q trình chạy ta tính nồng độ tương ứng cho amino acid Đây phương pháp xác để tính nồng độ amino acid 29 Chỉ bơm chuẩn lần, ghi lại diện tích peak thu sắc ký đồ sau phân tích kết thúc Sau lặp tỷ lệ diện tích peak nồng độ chuẩn mẫu, từ tính nồng độ amino acid mẫu 30 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết trồng nấm 4.1.1 Sự tăng trưởng hệ sợi môi trường Sau thực ni trồng theo quy trình mục 3.2.2.5, chúng tơi đạt số kết trình bày bảng 4.1 Bảng 4.1 Thời gian lan tơ đầy dịng nấm Dịng nấm Mơi trường Mơi trường Mơi trường nuôi lúa giá môi trồng Pleurotus pulmonarius 15 ngày 17 ngày 25 ngày Pleurotus flabellatus 15 ngày 18 ngày 27 ngày Pleurotus floridanus 18 ngày 20 ngày 30 ngày Pleurotus abalonus 30 ngày 40 ngày 40 ngày Nhận xét: Tất loài nấm thực tiến hành thiết bị giống tương ứng với mơi trường (mơi trường lúa bình tam giác, mơi trường cọng mì túi ny lơng) chuyển sang môi trường nuôi trồng, thực Pleurotus floridanus, Pleurotus abalonus túi ny lông, đồng thời với hai loại Pleurotus flabellatus, Pleurotus pulmonarius thực lọ thủy tinh Vì thế, so sánh hai môi trường đầu với dịng nấm cịn mơi trường ni trồng chúng tơi phân cặp để so sánh Với kết thu (Bảng 4.1), nhận thấy rằng: Thời gian tăng trưởng môi trường hạt Pleurotus abalonus chậm nhất, Pleurotus floridanus; Pleurotus flabellatus Pleurotus pulmonarius có thời gian tăng trưởng tương đương Cả dòng nấm Pleurotus floridanus; Pleurotus flabellatus Pleurotus pulmonarius có hệ sợi tơ trắng Pleurotus floridanus trắng hệ sợi khơng thưa hai dịng cịn lại (Hình 4.1) Khi cấy sang mơi truờng giá mơi, kết giống môi trường hạt, thời gian sinh trưởng Pleurotus abalonus chậm Và mơi trường này, nấm khác so với nấm lại đầu sợi nấm có màu đen, chứa bào tử.( Hình 4.2 Hình 4.3) 31 4.1.2 Sự hình thành thể Bảng 4.2 Đặc tính thể lồi nấm Lồi nấm Đường kính trung Năng suất sản phẩm bình thể (%) Pleurotus floridanus cm 70 Pleurotus abalonus 13 cm 62 Pleurotus pulmonarius 11 cm 60 Pleurotus flabellatus 10 cm 56 Năng suất sản phẩm = Trọng lượng nấm tươi / Trọng lượng chất khơ Về hình thái Sau đem nhà trồng, tuới đón nấm, chúng tơi thu hình thái dịng nấm sau - Pleurotus floridanus (Hình 4.1) thể màu trắng, phủ lông mịn gốc thể mọc thành chùm Khi đem quan sát duới kính hiển vi thấy bào tử đảm (Hình 4.4) - Pleurotus abalonus (Hình 4.2) thể có màu trắng đục, dày, chắc, bề mặt có vảy nhỏ Cuống nấm to Đem quan sát kính hiển vi quang học, chúng tơi thấy bào tử đảm tuơng đối lớn so với - Pleurotus pulmonarius (Hình 4.3) Phiến nấm mỏng, có màu trắng ngả xám, xẻ thùy mặt phiến - Pleurotus flabellatus (Hình 4.4) phiến nấm có màu xám đậm, cánh mỏng, giống với Pleurotus pulmonarius Như , hình thái dịng nấn hồn tồn khác Pleurotus abalonus có thể to dày nhất, Pleurotus floridanus; hai lồi cịn lại mặt hình thái tương đối giống nhau, khác nhầumu sắc mặt phiến nấm Về suất sản phẩm: suất sản phẩm tính trọng lượng nấm tươi/trọng ượng chất khô Theo bảng 4.2 suất Pleurotus floridanus cao Các dịng lại suất tương đối cao 32 Hình 4.1 Sinh trưởng tơ nấm mơi trường lúa Pleurotus floridanus, Pleurotus flabellatus, Pleurotus flabellatus Thân mì Bào tử Hình 4.2 Pleurotus abalonus mơi trường Hình 4.3 Bào tử Pleurotus abalonus thân mì bổ sung MgSO4 ( 2%), quan sát hệ sợi tơ (bào tử đơn) KH2PO4 (1 %), Cám gạo (10 %) Bào tử đảm Hình 4.4 Bào tử đảm quan sát thể nấm Pleurotus floridanus Bào tử đảm Hình Bào tử đảm quan sát thể nấm Pleurotus abalonus 33 Quả thể Quả thể Hình 4.6 Quả thể nấm Pleurotus Hình 4.7 Quả thể nấm Pleurotus abalonus floridanus túi ny lông chứa mùn cưa túi ny lơng chứa mùn cưa có bổ sung: có bổ sung: Cám gạo (10 %) Bột bắp (5,5 Cám gạo (10 %) Bột bắp (5,5 %) %) KH2PO4 (0,5%) ) KH2PO4 (0,5 %) Quả thể Quả thể Hình 4.8 Quả thể nấm Pleurotus flabellatus Hình 4.9 Quả thể nấm Pleurotus pulmonarius bình thủy tinh chứa mùn cưa có bổ sung bình thủy tinh chứa mùn cưa có bổ sung: Cám gạo (10 %) Bột bắp (5,5 %) Cám gạo (10 %) Bột bắp (5,5 %) KH2PO4 (0,5%) KH2PO4 (0,5%) 4.2 Kết phân tích amino acid Sau tiến hành phân tích, dịng nấm Pleurotus pulmonaius, Pleurotus flabellatus HPLC, thu thành phần amino acid liệt kê bảng 4.3 34 Hình 4.9 Sắc ký đồ chuẩn amin acid ASP: Aspartic acid; GLU Glutamate; SER: Serine; GLY: Glycine ; HIS: Histidine ARG: Arginine; THR: Threonine; ALA :Alanine; PRO: Proline; TYR: Tyrosine ; VAL: Valine ; MET: Methionine; CYS: Cysteine; ILEU: Isoleucine; LEU: Leucine; PHE : Phenylalanine; LYS: lysine Hình 4.10 Sắc ký đồ mẫu nấm Pleurotus flabellatus ASP: Aspartic acid; GLU Glucine; SER: Serine; GLY: Glycine ; HIS: Histidine ARG: Arginine; THR: Threonine; ALA :Alanine; PRO: Proline; TYR: Tyrosine ; VAL: Valine ; MET: Methionine; CYS: Cysteine; ILEU: Isoleucine; LEU: Leucine; PHE : Phenylalanine; LYS: lysine 35 Hình 4.11 Sắc ký đồ mẫu nấm Pleurotus pulmonarius ASP: Aspartic acid; GLU Gluatamate; SER: Serine; GLY: Glycine ; HIS: Histidine ARG: Arginine; THR: Threonine; ALA :Alanine; PRO: Proline; TYR: Tyrosine ; VAL: Valine ; MET: Methionine; CYS: Cysteine; ILEU: Isoleucine; LEU: Leucine; PHE : Phenylalanine; LYS: lysine Theo bảng này, dịng chứa đầy đủ 17 amino acid Trong nấm Pleurotus pulmonaius hàm lượng Leu chiếm với tỷ lệ cao nhất, amino acid Val, Asp, Cys, Met, Ileu, Lys, Glu chiếm với tỷ lệ thấp, đặc biệt Glu chiếm tỷ trọng thấp 17 amino acid phát Với nấm Pleurotus flabellatus tương tự Pleurotus pulmonaius , Leu chiếm tỷ lệ cao 17 amino acid; Val chiếm tỷ lệ thấp Trong 17 amino acid này, chứa đến amino acid thiết yếu (được in nghiêng bản) người, ngoại trừ Tryp chưa xác định Những amino acid thể người tổng hợp mà phải cung cấp từ bên Các amino acid thiết yếu chiếm đến 42 % tổng số amino acid Pleurotus pulmonaius 44 % tổng số amino acid nấm Pleurotus flabellatus Tỷ lệ cao so với nấm rơm (38,2 %) nấm mỡ (38,4 %) [Nguyễn Lân Dũng, 2002] Khi so sánh với thành phần amino acid với thực vật bắp, đậu nành thành phần amino acid nấm bào ngư cao 36 Bảng Thành phần amino acid Pleurotus pulmonaius, Pleurotus flabellatus Số thứ tự Amino acid Leucine Pleurotus pulmonarius (mg/g) 21, 15 Pleurotus flabellatus (mg/g) 17, 15 Glycine 8, 92 11, 39 Serine 7, 74 7, 85 Arginine 6, 49 5, 26 Alanine 5, 93 4, 95 Proline 4, 50 3, 08 Histidine 4, 42 5, 48 Tyrosine 3, 75 6, 78 Threonine 3, 67 2, 68 10 Phenylalanine 2, 21 0, 97 11 Valine 1, 88 0, 91 12 Asparagine 1, 88 1, 63 13 Cysteine 1, 79 2, 59 14 Methionine 1, 77 4, 49 15 Isoleucine 1, 31 13, 19 16 Lysine 1, 15 0, 89 17 Glutamate 0, 25 2, 04 Như vậy, nấm bào ngư xem thực phẩm giàu dinh dưỡng chứa gần đầy đủ amino acid thiết yếu Thành phần amin acid cao hầu hết loại rau Khi so sánh loài nấm, thành phần amino acid (aa) chúng tương đương (đều chứa 17aa) Nhưng xét riêng amino acid, chúng có khác biệt Glu nấm Pleurotus flabellatus cao gấp lần so với Glu (chỉ phát dạng vết: 0,25 mg) Pleurotus pulmonaius, Ileu cao gấp 10 lần Tất aa lại có khác biệt khơng lớn 37 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Đã trồng loại nấm bào ngư Trong đó, có hai loài chưa trồng : Pleurotus pulmonarius Pleurotus flabellatus Với suất sản phẩm đạt khoảng 55- 70%, điều kiện nhiệt độ 28 C, ẩm độ 70% Bằng sắc ký lỏng cao áp HPLC, phát định lượng thành phần amino acid loài nấm Pleurotus pulmonarius Pleurotus flabellatus Hai loài chứa đầy đủ 17 amino acid, leucine chiếm tỷ lệ cao 21,15% Pleurotus pulmonarius 17,15% Pleurotus flabellatus Trong nấm Pleurotus pulmonarius Glutamate chiếm tỷ lệ thấp nhất, nấm Pleurotus flabellatus (0,25%), Valine chiếm tỷ lệ thấp (0,91%) 5.2 Đề nghị Sau phân tích amino acid, nên tiến hành trồng loại chất khác sau phân tích tiếp amino acid để xem khác biệt ảnh hưởng chất ... Rây (sắc ký gel) Lỏng Lỏng Cột Theo kích thước Lỏng phân tử 2.4 Một số phương pháp sắc ký phân tích amino acid Phân tích amino acid phương pháp xác định thành phần amino acid định lượng chúng... định thành phần amino acid loài nấm bào ngư sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 3 Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nấm trồng 2.1.1 Khái niệm nấm Hiện nay, số loài nấm trồng chiếm phần nhỏ số nấm ăn thiên nhiên... thái lỏng rắn Dựa vào trạng thái tập hợp pha động, ngư? ??i ta chia sắc ký thành hai nhóm sắc ký khí sắc ký lỏng Dựa vào chế trao đổi chất pha động pha tĩnh mà ngư? ??i ta lại chia phương pháp sắc ký thành