xác định đặc tính virut rota gây bệnh năm 2010 tại việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phạm Thị Thu Thủy XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH VIRUT ROTA GÂY BỆNH NĂM 2010 TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Di Truyền Học Mã số: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. LÊ THỊ LUÂN Hà Nội – Năm 2011 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phạm Thị Thu Thủy XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH VIRUT ROTA GÂY BỆNH NĂM 2010 TẠI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2011 LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Thu Thñy 1 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8 1.1. VIRUT HỌC 8 1.1.1. Sơ lƣợc lịch sử phát hiện RV 8 1.1.2. Hình thái và cấu trúc 9 1.1.3. Thành phần hóa học của virut Rota và chức năng 10 1.1.4. Phân nhóm và týp huyết thanh trên động vật và ngƣời 14 1.1.5. Tính chất lý hóa 15 1.1.6. Quá trình nhân lên của virut Rota 16 1.1.7. Khả năng gây bệnh cho ngƣời 18 1.1.8. Cơ chế gây bệnh 19 1.2. DỊCH TỄ HỌC BỆNH TCC DO RV 19 1.2.1. Nguồn bệnh 19 1.2.2. Đƣờng lây truyền 19 1.2.3. Mùa bệnh 20 1.2.4. Lứa tuổi mắc bệnh 20 1.2.5. Sự liên quan giữa giới tính và tỉ lệ mắc bệnh 21 1.2.6. Miễn dịch 21 1.3. SỰ PHÂN BỐ CÁC KIỂU GEN CỦA VIRUT ROTA 22 1.3.1. Phân bố trên thế giới 22 1.3.2. Phân bố tại Việt Nam 23 1.4. TÌNH HÌNH MẮC BỆNH TCC VÀ VẮC XIN PHÒNG NGỪA BỆNH TCC DO RV 24 1.4.1. Triệu chứng lâm sàng 24 1.4.2. Các phƣơng pháp chẩn đoán RV 25 1.4.3. Tình hình mắc bệnh TCC do RV trên thế giới và Việt Nam 26 1.4.4. Tình hình sử dụng vắc xin phòng ngừa bệnh TCC do RV 28 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 31 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu 31 LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Thu Thñy 2 2.2.2. Phƣơng pháp thực hiện 32 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 47 3.1. XÁC ĐỊNH TỶ LỆ TCC DO RV TẠI VIỆT NAM NĂM 2010 47 3.2. TỶ LỆ BỆNH NHÂN TCC DO RV THEO THÁNG 49 3.3. TỶ LỆ BỆNH NHÂN TCC DO RV THEO VÙNG ĐỊA LÝ 51 3.4. TỶ LỆ BỆNH NHÂN TCC DO RV THEO NHÓM TUỔI 51 3.5. TỶ LỆ BỆNH NHÂN TCC DO RV THEO GIỚI TÍNH 49 3.6. ĐẶC TÍNH CÁC CHỦNG RV LƢU HÀNH TẠI VIỆT NAM NĂM 2010 55 3.6.1. Đặc tính chủng P 55 3.6.2. Đặc tính chủng G 60 3.6.3. Sự lƣu hành các chủng tổ hợp G – P của RV 65 KẾT LUẬN 69 KIẾN NGHỊ 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Thu Thñy 3 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Deoxyribonucleic Acid Axit Deoxyribonucleic CDC Centers for Disease Control and Prevention Trung tâm Kiểm soát và phòng chống bệnh, Mỹ ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme Gmix Mixed G-genotype Chủng virut Rota có kiểu gen G hỗn hợp Gnt Untypable G- genotype Chủng virut Rota không thể xác định kiểu gen G IgA Immuno globulin A Globulin miễn dịch A IgG Immuno globulin G Globulin miễn dịch G NSP Non-structure Protein Protein không cấu trúc OD Optical density Mật độ quang học Pmix Mix P-type Chủng virut Rota có kiểu gen P hỗn hợp Pnt Untýpable P-genotype Chủng virut Rota không thể xác định kiểu gen P ARN Ribonucleic Acid Axit Ribonucleic RT- PCR Reverse transcription polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi Polymerase phiên mã ngƣợc RV Rotavirus Virut Rota TCC Tiêu chảy cấp WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới 1. LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Thu Thñy 4 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Đặc điểm chuỗi nucleotit các đoạn gen của RV 11 Bảng 2. Các gen và protein của RV 12 Bảng 3. Týp huyết thanh của RV 15 Bảng 4. Sự phân bố các chủng lƣu hành trên toàn cầu, năm 2001 – 2008 22 Bảng 5. Các primer đƣợc sử dụng để định týp G và týp P 39 Bảng 6. Bảng tra kích thƣớc các kiểu gen G, P sau khi điện di 45 Bảng 7. Số mẫu thu thập từ các địa điểm trong nƣớc năm 2010 47 Bảng 8. Tỷ lệ TCC do RV hàng năm tại Việt Nam 48 Bảng 9. Phân bố theo tháng tỷ lệ trẻ mắc bệnh TCC do RV tại Việt Nam năm 2010 49 Bảng 10. Tỷ lệ mắc RV theo nhóm tuổi tại Việt Nam năm 2010 51 Bảng 11. Tỷ lệ mắc bệnh do RV theo giới tính 54 Bảng 12. Tỷ lệ lƣu hành các kiểu gen P tại Việt Nam năm 2010 56 Bảng 13. Sự phân bố các kiểu gen theo khu vực trong cả nƣớc 57 Bảng 14. Tỷ lệ các kiểu gen P lƣu hành theo thời gian 58 Bảng 15. Tỷ lệ lƣu hành các kiểu gen G tại Việt Nam 60 Bảng 16. Sự phân bố các chủng G theo khu vực 62 Bảng 17. Tỷ lệ lƣu hành các kiểu gen G theo thời gian 58 Bảng 18. Sự lƣu hành các chủng G – P tại Việt Nam năm 2010 65 Bảng 19. Sự lƣu hành các chủng tổ hợp G – P theo thời gian tại Việt Nam 66 2. LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Thu Thñy 5 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Hình ảnh RV chụp dƣới kính hiển vi điện tử 9 Hình 2. Hình minh họa cấu trúc của RV 10 Hình 3. Chu trình nhân lên của RV trong tế bào 17 Hình 4. Sự phân bố tỷ lệ nhiễm RV phân bố theo nhóm tuổi ở một số nƣớc Châu Mỹ La Tinh . 21 Hình 5. Sự phân bố số bệnh nhân tử vong theo khu vực trên thế giới và số bệnh nhân tử vong tại các quốc gia Châu Á 27 Hình 6. Sơ đồ tóm tắt quy trình thực hiện 32 Hình 7. Sơ đồ mô tả nguyên lý của phƣơng pháp ELISA 33 Hình 8. Kết quả ELISA khi chƣa cho chất dừng phản ứng 35 Hình 9. Kết quả ELISA sau khi cho chất dừng phản ứng 35 Hình 10. Đọc kết quả mẫu bệnh phẩm trên máy ELISA 36 Hình 11. Vị trí các Primer và bản sao ADN thu đƣợc để xác định kiểu gen G 40 Hình 12. Vị trí các Primer và bản sao ADN thu đƣợc để xác định kiểu gen P 40 Hình 13. ảnh minh họa vị trí mẫu trên bản gel 45 Hình 14. ảnh minh họa kiểu gen G phân tích trên gel agarose 2% 46 Hình 15. ảnh minh họa kiểu gen P phân tích trên gel agarose 2% 46 Hình 16. Tỷ lệ bệnh nhân mắc bệnh TCC vào bệnh viện năm 2010 tại Việt Nam 47 Hình 17. Biểu đồ tỷ lệ trẻ em mắc bệnh TCC do RV theo tháng tại các khu vực 50 Hình 18. Sự phân bố TCC do RV theo nhóm tuổi 53 Hình 19. Tỷ lệ trẻ dƣơng tính với RV phân bố theo giới tính tại Việt Nam 2010 54 Hình 20. Kết quả điện di trên gel agarose xác định kiểu gen P 55 Hình 21. Tỷ lệ các kiểu gen P tại việt Nam 56 Hình 22. Sự phân bố kiểu gen P theo thời gian 59 Hình 23. Kết quả điện gi trên gel agarose xác định kiểu gen G 60 Hình 24. Sự phân bố các kiểu gen G lƣu hành tại Việt Nam 61 Hình 25. Sự lƣu hành các kiểu gen G theo thời gian 64 Hình 26. Sự phân bố các tổ hợp G – P của RV 66 Hình 27. Sự lƣu hành các chủng tổ hợp G – P theo thời gian 67 Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Thu Thủy 6 M U Virut Rota (RV) c phỏt hin u nhng nm 70 ca th k XX, l mt virut ARN si ụi thuc h Reoviridae. Bnh viờm d dy rut do RV l nguyờn nhõn hng u gõy ra cn bnh tiờu chy tr s sinh v tr nh trờn th gii, Vic nhim virut rota trm trng nht tr s sinh v tr nh t 6 - 36 thỏng tui, ngoi ra cng thy tr ln hn v ngi ln [10, 13, 25, 49]. M, hng nm cú khong 3 triu tr s sinh v tr nh b tiờu chy do RV gõy ra, trong ú 82.000 tr phi iu tr ti bnh vin v khong 150 ca t vong. cỏc nc ang phỏt trin RV cng l nguyờn nhõn thụng thng gõy viờm d dy rut cho tr em di 2 tui dn n khong 873.000 cỏi cht mi nm [13]. Ti Vit Nam , theo thng kờ dch t t l tr em mc bnh tiờu chy cp (TCC) do RV chim trờn 50% trong tng s tr mc TCC phi nhp vin hng nm, s tr cht do RV chim t 4% - 8% trong tng s tr di 5 tui b cht vỡ mi nguyờn nhõn [10] Bnh TCC do RV ch yu lõy qua ng phõn ming nờn d gõy thnh dch khi gp iu kin thun li. Hin nay, cha cú bin phỏp hiu qu no thanh toỏn hon ton bnh do nhim RV hay s lõy truyn ca nú. Vic cung cp nc sch v ci thin iu kin v sinh cng khụng lm gim tiờu chy do virut rota nhiu quc gia. Hin nay, trờn th gii ó cp phộp lu hnh hai loi vc xin l: vc xin Rotarix ca hóng Glaxo Smith Kline v Rotateq ca Merck. Cỏc vc xin ny c s dng nhiu quc gia nhng hiu lc bo v li khỏc nhau theo khu vc, iu ny c gii thớch l do tớnh a dng v di truyn ca cỏc chng RV v s lu hnh cỏc chng cú s bin i theo khụng gian v thi gian [6, 10,19, 24, 29]. Ti Vit Nam ó sn xut c vc xin RV ung, t chng ph bin G[1]P[8] ó c lm gim c lc Kt qu th nghim lõm sng c ỏnh giỏ l t v mc an ton trờn c th ngi ln v tr em [5, 7, 12, 16]. Vic giỏm sỏt dch t hc v xỏc nh c tớnh ca cỏc chng RV trong thi gian di trờn th gii cng nh ti Vit Nam, trc v sau khi s dng vc xin l c s ỏnh giỏ hiu qu ca cỏc vc xin ang LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Thu Thñy 7 sử dụng, sự biến đổi bất thƣờng của các chủng RV để từ đó có hƣớng phát triển vắc xin mới hiệu quả hơn. Do vậy, xác đinh đặc tính RV lƣu hành tại việt Nam qua các năm là cơ sở cho việc mở rộng các nghiên cứu nhằm tìm ra các biện pháp ngăn chặn, làm giảm tỉ lệ mắc và tử vong do căn bệnh này. Xuất phát từ thực tiễn trên chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “ Xác định đặc tính virut Rota gây bệnh năm 2010 tại Việt Nam” nhằm mục tiêu sau: - Nghiên cứu, đánh giá tỷ lệ tiêu chảy cấp do virut Rota tại Việt Nam năm 2010 và mối liên quan với yếu tố mùa, giới tính và lứa tuổi. - Đánh giá sự lƣu hành các chủng virut Rota tại Việt Nam năm 2010 và từ đó đánh giá xu hƣớng biến đổi các chủng virut Rota lƣu hành qua các năm. LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Thu Thñy 8 1. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. VIRUT HỌC 1.1.1. Sơ lược lịch sử phát hiện RV Năm 1943, Jacob Light và Horace Hodes đã chứng minh rằng các tác nhân đi qua màng lọc vi khuẩn có khả năng gây ra tiêu chảy cho bò. Năm 1972, Kapikian lần đầu tiên phát hiện ra chủng virut có liên quan đến bệnh tiêu chảy và đặt tên là Norwalk. Năm 1973 Bishop R.F và cộng sự quan sát bằng kính hiển vi điện tử mảnh sinh thiết ruột non của trẻ em chết vì bệnh TCC thấy có virut giống nhƣ Reovirus (Reovirus – like), có đƣờng kính 70nm và ông đặt tên cho virut này là Rotavirus vì hình thể của nó rất giống cái bánh xe với các nan hoa (hình 1). Năm 1974, Flewett. Bryden, Midleton cũng đề cập tới vai trò của RV trong bệnh viêm dạ dày ruột. Sau này những nghiên cứu về hình thái học bằng âm bản những lát cắt cực mỏng của tổ chức nhiễm RV, quan sát dƣới kính hiển vi điện tử cho phép xác định RV thuộc họ Reoviridae [3, 8,10, 13, 22, 25, 49]. Trong vòng 5 năm ( 1973 - 1978), virut rota đã đƣợc công nhận là nguyên nhân phổ biến nhất thƣờng gây tiêu chảy ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ trên khắp thế giới, nhất là trẻ em dƣới 5 tuổi [10]. Việc phát hiện ra RV là một trong những căn nguyên chính gây nên tiêu chảy ở trẻ em đã dẫn tới việc mở rộng các nghiên cứu nhằm tìm ra các biện pháp ngăn chặn, làm giảm tỉ lệ mắc và tử vong do căn bệnh này. Ở Việt Nam mãi đến năm 1980 mới nghiên cứu và xác định virut này là nguyên nhân chính gây nên bệnh tiêu chảy ở trẻ em. Từ năm 1998 dến nay, đƣợc sự hợp tác và tài trợ của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa bệnh tật CDC-Atlantta- Mỹ, Trung tâm nghiên cứu, sản xuất vắc xin và Sinh phẩm y tế đã tiến hành giám sát bệnh tiêu chảy do RV và xác định các chủng lƣu hành phổ biến tại Việt Nam [10,13]. [...]... vic xỏc nh khỏng nguyờn virut rota, v rt phự hp cho vic phõn tớch mt lng mu ln [8, 10] 1.4.2.2 K thut RT-PCR xỏc nh týp virut rota PCR c s dng xỏc nh kiu gen ca virut rota da trờn cỏc ARN c tỏch chit t cỏc mu phõn cú virut rota dng tớnh, nhm xỏc nh c im ca cỏc protein capsit lp ngoi G v P [10] 1.4.2.3 K thut min dch hunh quang xỏc nh khỏng nguyờn virut rota xỏc nh hiu giỏ ca virut nhúm A, cú 2 phng... [10, 25], - 200C virut cú th tn ti nhiu nm [19, 20] Virut d b bt hot nhit cao trờn 450C Nu ụng tan bng nhiu ln thỡ virut mt kh nng gõy nhim trựng [25] Virut cú kh nng tn ti lõu trong bung bnh nhõn nờn t l nhim trựng bnh vin khỏ cao [10, 25] 15 Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Thu Thủy 1.1.5.3 Tớnh nhy cm Kh nng gõy nhim trựng ca virut rota tựy thuc vo s cú mt ca lp v capsớt [10, 13] Virut rota nhy cm vi EDTA... bo Sau khi gn vo t bo khong 60 n 90 phỳt, virut xõm nhp vo t bo nh enzym phõn gii protein Enzym lysosome ca t bo cú tỏc dng phỏ v capsit lp ngoi ca virut [29] S xõm nhp ca virut rota ngi ph thuc vo vic tỏch lp v ngoi ca virut bng trypsin Virut ó c x lý trc bng trypsin s trc tip xõm nhp qua mng t bo vo trong bo tng ca t bo [10] Mt gi thuyt khỏc cho rng, nhng ht virut ó c hot hoỏ bng trypsin dớnh vo mng... nghim giỏm sỏt trờn th gii cng nh ti Vit Nam ó chng minh c sa m cú mc hiu giỏ cao v trung bỡnh cú kh nng trung hũa virut trong vc xin th nghim [14] 1.1.6 Quỏ trỡnh nhõn lờn ca virut Rota Cỏc im c trng nht ca quỏ trỡnh RV nhõn lờn trong t bo nh sau [10]: Quỏ trỡnh sao chộp xy ra hon ton trong t bo cht T bo khụng cha cỏc enzym dựng cho sao chộp si kộp ARN, vỡ th virut phi t cung cp cỏc enzym cn thit ... mc dự sa m khụng phi l phũng c nhim virut rota nhng cú th phũng c bnh tiờu chy nng [10, 14] Ngoi gõy viờm d dy rut cp, virut rota cũn cú th gõy viờm rut hoi t, lng rut, tc mt ngoi gan, xut huyt ng niu, nhim trựng huyt Tuy nhiờn, hin nay cha cú bng chng in hỡnh cú tớnh thuyt phc v vn ny 1.1.7.2 Kh nng gõy bnh ngi ln Nhim trựng do RV cng khỏ ph bin ngi ln, thng do virut nhúm B gõy ra, tuy nhiờn ngi... ca virut s c hon chnh nh s ny chi qua mng li ni cht ca t bo Trong quỏ trỡnh ny, cỏc ht virut cn cỏc protein capsớt lp ngoi ca chỳng S phõn gii t bo s gii phúng cỏc ht virut khi cỏc t bo nhim 16 Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Thu Thủy Cỏc giai on chớnh ca quỏ trỡnh sao chộp RV bao gm: giai on hp ph, xõm nhp v ci ỏo; quỏ trỡnh tng hp v sao chộp; giai on lp rỏp v gii phúng virut ra khi t bo vt ch Nhõn Ht Virut. .. nh liu gõy nhim ca virut Phng phỏp mim dch hunh quang l phng phỏp ti u xỏc nh hiu giỏ virut Rota nhúm A, n v xỏc nh hiu giỏ l n v hunh quang phỏt sỏng ca t bo gõy nhim trờn ml hn dch virut õy l phng phỏp n gin, d thc hin, cho kt qu nhanh trong vũng 24 gi v chớnh xỏc [10] 1.4.2.4 Nuụi cy v xỏc nh Cú th nuụi cy trờn t bo thn ca bo thai ngi, t bo thn kh, t bo thn bũ Sau ú phỏt hin virut bng phn ng trung... bnh phm [ 10, 29] 25 Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Thu Thủy 1.4.2.6 K thut ngng kt ht Latex Ht latex c gn vi khỏng th khỏng virut Rota chn oỏn khỏng nguyờn ca virut õy l k thut chn oỏn nhanh, khụng cn nhiu trang thit b [29] 1.4.2.7 K thut in di Nguyờn lý cỏc mnh kộp phõn t ARN ca virut rota cú trng lng phõn t khỏc nhau nờn d dng tỏch ra khi in di trờn gel polyacrylamid hoc agarose K thut ny cú nhy, c hiu... vcxin ngn chn cn bnh ny Cỏc chng RV ca ngi v ng vt c cõn nhc s dng nh cỏc nh ti tr gen phỏt trin vcxin c cp ti bng sau: Bng 5 Cỏc chng RV c cõn nhc phỏt trin vc xin [10] Chng virut Virut rota bũ, WC3 Kiu hỡnh G6P5 Virut rota ngi: W179 SC2 W178 WI61 G1P8 G2P6 G3P8 G9P8 To cỏc chng mi t vic sp xp li gen ca chng WC3 (Cỏc gen RV ngi ó c thay th): W 179- 9 ( 9 t W179) G1P5 SC2 - 9 ( 9 t SC2) D7A (1,3,5... vcxin rota ca hóng ny, ng c viờn ca h l chng G1P8 Hin nay vcxin ny ó c cp phộp s dng ti Mexico Vc xin ny ó c th thc a ti Singapore, s dng 2 liu vo thỏng tui th 2 v 3 ca tr Vi thi gian s dng vcxin ny trỏnh tng nguy c lng rut ca tr v nhng tỏc dng ph khỏc b Vc xin rota ó c phờ chun s dng Hi ngh v virut rota quc t ln th 6 c t chc ngy 7, 8 thỏng 1 nm 2005 ti Mexico ó thụng qua v phờ chun 2 vc xin Rota ú . tài nghiên cứu: “ Xác định đặc tính virut Rota gây bệnh năm 2010 tại Việt Nam nhằm mục tiêu sau: - Nghiên cứu, đánh giá tỷ lệ tiêu chảy cấp do virut Rota tại Việt Nam năm 2010 và mối liên. nƣớc năm 2010 47 Bảng 8. Tỷ lệ TCC do RV hàng năm tại Việt Nam 48 Bảng 9. Phân bố theo tháng tỷ lệ trẻ mắc bệnh TCC do RV tại Việt Nam năm 2010 49 Bảng 10. Tỷ lệ mắc RV theo nhóm tuổi tại Việt. Hà Nội – Năm 2011 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phạm Thị Thu Thủy XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH VIRUT ROTA GÂY BỆNH NĂM 2010 TẠI VIỆT NAM