Bệnh thƣờng xảy ra ở trẻ em, bệnh khởi phát đột ngột sau thời gian ủ bệnh ngắn khoảng 1 đến 2 ngày kể từ khi virut xâm nhập vào cơ thể. Triệu chứng bệnh biểu hiện nôn và tiêu chảy, phân lỏng kéo dài từ 3 đến 9 ngày. Nôn và tiêu chảy cấp gây tình trạng mất nƣớc có thể dẫn đến tử vong nếu không đƣợc điều trị kịp thời [10]. Hầu hết trẻ em đều bị nhiễm virut rota trong thời gian 3 - 5 tuổi nhƣng tiêu chảy cấp và tình trạng mất nƣớc xuất hiện chủ yếu ở trẻ em từ 3 - 35 tháng tuổi [10]. Bệnh nhân có thể có sốt và thƣờng sốt nhẹ. Mặc dù triệu chứng viêm nhiễm đƣờng hô hấp cũng thƣờng xảy ra trong giai đoạn này nhƣng không có bằng chứng nào chứng tỏ virut rota gây nên những triệu chứng này. Triệu chứng lâm sàng của bệnh có thể thay đổi từ nhẹ đến nặng. Nhiễm trùng còn có thể xảy ra ở trẻ lớn và ngƣời trƣởng thành nhƣng thƣờng là thể ẩn. Bệnh đặc biệt trầm trọng ở những trẻ suy dinh dƣỡng và ngƣời có suy giảm miễn dịch [25].
1.4.2. Các phương pháp chẩn đoán RV
1.4.2.1. Kỹ thuật miễn dịch gắn enzym (ELISA) xác định kháng nguyên virut rota
Phƣơng pháp này dựa trên nguyên tắc sử dụng kháng thể đơn giòng để tìm ra kháng nguyên RV có trong mẫu phân ngƣời [22]. Kỹ thuật miễn dịch enzym là một phƣơng pháp đơn giản, có độ nhạy cao dùng cho việc xác định kháng nguyên virut rota, và rất phù hợp cho việc phân tích một lƣợng mẫu lớn [8, 10].
1.4.2.2. Kỹ thuật RT-PCR xác định týp virut rota
PCR đƣợc sử dụng để xác định kiểu gen của virut rota dựa trên các ARN đƣợc tách chiết từ các mẫu phân có virut rota dƣơng tính, nhằm xác định đặc điểm của các protein capsit lớp ngoài G và P [10].
1.4.2.3. Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang xác định kháng nguyên virut rota
Để xác định hiệu giá của virut nhóm A, có 2 phƣơng pháp xác định đó là phƣơng pháp miễn dịch enzym (EIA) với kết quả là chỉ số OD, chỉ số này không có ý nghĩa quyết định liều gây nhiễm của virut. Phƣơng pháp miễm dịch huỳnh quang là phƣơng pháp tối ƣu xác định hiệu giá virut Rota nhóm A, đơn vị xác định hiệu giá là đơn vị huỳnh quang phát sáng của tế bào gây nhiễm trên ml hỗn dịch virut. Đây là phƣơng pháp đơn giản, dễ thực hiện, cho kết quả nhanh trong vòng 24 giờ và chính xác [10]
1.4.2.4. Nuôi cấy và xác định
Có thể nuôi cấy trên tế bào thận của bào thai ngƣời, tế bào thận khỉ, tế bào thận bò... Sau đó phát hiện virut bằng phản ứng trung hoà giảm đám hoại tử hoặc ELISA, ...Việc nuôi cấy virut rota trên tế bào còn gặp nhiều khó khăn nên chỉ sử dụng trong nghiên cứu vì vậy ngƣời ta phải dùng các phƣơng pháp khác để chẩn đoán [1, 10].
1.4.2.5. Kỹ thuật kính hiển vi điện tử
Đây là phƣơng pháp phát hiện trực tiếp virut trong bệnh phẩm và là kỹ thuật chẩn đoán nhanh, đặc hiệu, tuy nhiên độ nhạy không cao và khá đắt tiền, rất khó thực hiện khi có nhiều bệnh phẩm [ 10, 29].
1.4.2.6. Kỹ thuật ngưng kết hạt Latex
Hạt latex đƣợc gắn với kháng thể kháng virut Rota để chẩn đoán kháng nguyên của virut. Đây là kỹ thuật chẩn đoán nhanh, không cần nhiều trang thiết bị [29].
1.4.2.7. Kỹ thuật điện di
Nguyên lý các mảnh kép phân tử ARN của virut rota có trọng lƣợng phân tử khác nhau nên dễ dàng tách ra khi điện di trên gel polyacrylamid hoặc agarose. Kỹ thuật này có độ nhạy, đặc hiệu cao, dễ áp dụng trên nhiều bệnh phẩm [2].
1.4.2.8. Phản ứng kết hợp bổ thể
Dùng kháng nguyên là Rv ngƣời tinh khiết, phân lập từ phân bệnh nhân để phát hiện kháng thể RV [10].
1.4.2.9. Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu thụ động
Có thể dùng phản ứng này để định lƣợng IgG, phân biệt đƣợc lần nhiễm thứ nhất với lần nhiễm thứ hai. Phản ứng này nhạy hơn phản ứng kết hợp bổ thể [10].
1.4.3. Tình hình mắc bệnh TCC do RV trên thế giới và Việt Nam
1.4.3.1. Tình hình mắc bệnh do RV trên thế giới
RV là nguyên nhân hàng đầu gây bệnh TCC ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ dƣới 5 tuổi trên toàn thế giới. Theo ƣớc tính chiếm khoảng 40% tất cả các trƣờng hợp TCC ở trẻ em [64]. Khoảng 527.000 bệnh nhân tử vong mỗi năm (từ 475.000 đến 580.000 trƣờng hợp tử vong), hẩu hết ở trẻ em dƣới 2 tuổi [65], chủ yếu là miền nam và Đông nam Châu Á, Châu Phi cận Sahara, với gần 100.000 ca tử vong mỗi năm ở Ấn Độ và hơn 200.000 bệnh nhân tử vong ở các nƣớc Châu Phi [58]. Chƣơng trình giám sát dịch tễ thực hiện tại Châu Á gổm 14 quốc gia hợp tác với PATH, WHO, Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh (CDC) tại Atlanta, GA (Mỹ) ƣớc tính có khoảng 73% trẻ em nhập viện do TCC ở Hàn Quốc dƣơng tính với RV, Nhật Bản (58%), Myanma (53%), Trung Quốc (46%), Thái Lan (43%), Hong Kong (30%) [57, 66, 71, 72].
Trƣớc khi vắc xin ra đời, tiêu chảy do RV ƣớc tính tại Mỹ có khoảng hơn 50.000 bệnh nhân phải nhập viện và có từ 20 đến 40 ca tử vong mỗi năm. Tại Châu Á sự ra
đời của vắc xin đã ngăn chặn khoảng 110.000 ngƣời chết mỗi năm, giảm 1.400.000 bệnh nhân phải nhập viện và 7.700.000 bệnh nhân khám ngoại trú [29].
Hình 5. Sự phân bố số bệnh nhân tử vong theo khu vực trên thế giới và số bệnh nhân tử vong tại các quốc gia Châu Á [33]
1.4.3.2. Tình hình mắc bệnh do RV tại Việt Nam
Theo kết quả giám sát tại Việt Nam của một nhóm tác giả khác từ năm 1981 đến 1985 tỷ lệ mẫu nghiên cứu dƣơng tính với RV chiếm 26,5%. Theo kết quả giám sát của
Các nước Châu Á khác Ấn Độ SriLanka Hàn Quốc Thái Lan Việt Nam Philippines Trung Quốc Châu Phi Mỹ và Canada Mỹ LaTinh Châu Âu Châu Á
Trung Tâm Nghiên cứn, sản xuất vắc xin và Sinh Phẩm Y tế trong 11 năm từ 1998 đến 2009 tỷ lệ mẫu dƣơng tính chiếm tới 57,96%, gấp 2 lần so với kết quả nghiên cứu trƣớc đó. Nhƣ vậy, trong những năm gần đây tỷ lệ trẻ nhiễm RV có xu hƣớng tăng mạnh và là nguyên nhân hàng đầu gây TCC tại Việt Nam.
1.4.4. Tình hình sử dụng vắc xin phòng ngừa bệnh TCC do RV
1.4.4.1. Các chủng RV được cân nhắc để phát triển vắc xin
Bệnh viêm dạ dày ruột do RV là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến căn bệnh tiêu chảy ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ trên toàn thế giới. Hiện nay chƣa có biện pháp hiệu quả nào để thanh toán hoàn toàn bệnh do nhiễm RV hay sự lây truyền của nó. Điều đó cho thấy tầm quan trọng của việc phát triển các văcxin ngăn chặn căn bệnh này. Các chủng RV của ngƣời và động vật đƣợc cân nhắc sử dụng nhƣ các nhà tài trợ gen để phát triển văcxin đƣợc đề cập tới ở bảng sau:
Bảng 5. Các chủng RV đƣợc cân nhắc để phát triển vắc xin [10]
Chủng virut Kiểu hình
Virut rotaở bò, WC3 G6P5
Virut rota ở ngƣời:
W179 G1P8
SC2 G2P6
W178 G3P8
WI61 G9P8
Tạo các chủng mới từ việc sắp xếp lại gen của chủng WC3 (Các gen RV ngƣời đã đƣợc thay thế):
W 179- 9 ( 9 từ W179) G1P5 SC2 - 9 ( 9 từ SC2) G2P5 D7A (1,3,5 - 9 từ SC2) G2P5 WC3 (2-5) ( 1,6 - 11 từ W178) G3P5 W178 - 8 ( 8 từ W178) G3P5 W179 - 4 ( 4 từ W 179) G6P8 WI61 - 4( 4 từ WI61) G6P8 W179 (4, 1,9) ( 4,1,9 từ W179) G1P8
Những nghiên cứu nhằm phát triển một văcxin RV an toàn và hiệu quả đã bắt đầu từ giữa những năm 1970 . Bệnh do RV thƣờng liên quan đến nhiễm trùng biểu mô đƣờng ruột, do vậy việc phát triển văcxin bảo vệ là quá trình tìm ra kháng nguyên có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với virut. Ngƣời ta đã hy vọng rằng một văcxin RV sống, giảm độc lực sẽ là văcxin hiệu quả nhất.
1.4.4.2. Các loại văc xin được nghiên cứu và sử dụng a. Các loại vắc xin trên thế giới
Ứng cử viên văcxin RV đầu tiên là các văcxin đơn giá "Monovalent vaccines" sử dụng chủng virut rota WC3 đƣợc phân lập từ vật chủ là bò hoặc từ khỉ Rhesus. Đây là loại văcxin sống giảm độc uống một liều duy nhất. Văcxin này an toàn và có thể ngăn chặn đƣợc bệnh tiêu chảy do RV ở trẻ em [10] .
Văcxin thứ hai là các văcxin đa giá "Multivalent vaccines" đƣợc sản xuất năm 1985 bằng cách sử dụng sự thay thế gen [10]. Một gen trong hệ gen của chủng RV động vật đƣợc thay thế bởi gen của RV ngƣời, gen này mã hoá cho protein VP7.
Rota Shield là vacxin tứ liên "Tetravalent vaccines" đƣợc phát triển bởi chủng virut rota MMU18006, là văcxin sống giảm độc lực uống đƣợc sản xuất từ chủng RV ở khỉ Rherus ( RRV - TV). Vacxin này đƣợc cấp phép tháng 10 năm 1998 tại Mỹ, 600.000 trẻ đƣợc sử dụng vắc xin tƣơng đƣơng với 1,2 triệu liều. Văcxin này bị đình chỉ sử dụng vì có liên quan đến tăng nguy cơ lồng ruột sau 3 tuần sử dụng liều đầu tiên với tỷ lệ ƣớc tính 1/10.000 liều.
Vắc xin giòng sơ sinh [10], bác sĩ Ruth Bishop đã phát triển chủng này trong phòng thí nghiệm của bà. Chủng này là chủng RV ngƣời (G3, P6) đƣợc phân lập từ một trẻ sơ sinh và làm giảm độc lực qua nhiều lần cấy truyền. Vắc xin này có thể tạo ra khả năng phòng bệnh đồng týp chống lại giòng G1.
Vắc xin đƣợc tạo ra trong phòng thí nghiệm nghiên cứu của Merck [51], Văcxin phối hợp dựa trên chủng của ngƣời và bò (WC) tạo ra khả năng phòng chống bệnh rất tốt (70%) và phòng bệnh tiêu chảy cấp nặng (95-100%). Văcxin này là văcxin 5 týp phối hợp chủng của ngƣời (G1, G2, G3, G4 và P1(8) và chủng của bò(WC3).
Vắc xin của hãng Glaxo Smith Kline [51], bác sĩ Georges Thiry đƣa ra những kế hoạch về phát triển văcxin rota của hãng này, ứng cử viên của họ là chủng G1P8. Hiện nay văcxin này đã đƣợc cấp phép sử dụng tại Mexico. Vắc xin này đã đƣợc thử thực địa tại Singapore, sử dụng 2 liều vào tháng tuổi thứ 2 và 3 của trẻ. Với thời gian sử dụng văcxin này tránh tăng nguy cơ lồng ruột của trẻ và những tác dụng phụ khác.
b. Vắc xin rota đã được phê chuẩn sử dụng
Hội nghị về virut rota quốc tế lần thứ 6 đƣợc tổ chức ngày 7, 8 tháng 1 năm 2005 tại Mexico đã thông qua và phê chuẩn 2 vắc xin Rota đó là vắc xin RotaTeq của Meck và vắc xin Rotarix của Smith Line, cả hai vắc xin này đã đƣợc WHO phê chuẩn cho sử dụng tháng 1/2006 [10].
Rota Teq là văcxin sống uống giảm độc lực sử dụng 3 liều đƣợc bắt đầu nghiên cứu từ 1991. Nó là văcxin phối hợp giữa chủng rota của ngƣời và bò, chứa 5 kháng nguyên G1, G2, G3, G4 và P1. Thực địa lâm sàng chỉ ra rằng vacxin này rất an toàn và hiệu lực, nó phòng đƣợc >70% sự xâm nhập của bất kỳ týp RV nào.
Rotarix là văcxin sống giảm độc lực đƣợc sử dụng 2 liều, có nguồn gốc từ 1 chủng RV ngƣời G1P8. Kết quả thử nghiệm cho thấy khoảng 73% phòng đƣợc viêm dạ dày ruột do bất kỳ týp RV nào và > 90% chống lại nhiễm cấp tính do RV và đặc biệt văcxin này có hiệu lực phòng bệnh >83% do RV không phải do týp G1, không có dấu hiệu chỉ ra rằng lồng ruột ở trẻ em liên quan đến việc sử dụng văcxin này.
c. Vắc xin sản xuất tại Việt Nam
Vắc xin Rotavin-M1 sản xuất từ chủng G1P[8] – WS (KH0118) đƣợc phân lập tại Việt Nam đã đƣợc sản xuất và thử nghiệm lâm sàng trên 30 ngƣời lớn khỏe mạnh [1], thời gian từ 8/2009 đến 10/2009, và trên 799 trẻ khỏe mạnh từ 6-12 tuần tuổi (thời gian từ 04/2010 đến 12/2011) [16], kết quả thu đƣợc là đạt yêu cầu về mức độ an toàn trên ngƣời lớn và trẻ từ 6 – 12 tuần tuổi.
2. CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tƣợng nghiên cứu là những trẻ em thỏa mãn các tiêu chí sau: - Độ tuổi từ 0 – 59 tháng tuổi (< 5 tuổi)
- Nhập viện với nguyên nhân TCC: đi ngoài ≥ 3 lần trong ngày (24h), phân lỏng, không máu
- Khởi bệnh ≤ 7 ngày.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
2.2.1.1. Thời gian giám sát
Nghiên cứu đƣợc thực hiện từ tháng 1/2010 đến tháng 12/2010 tại 3 địa điểm trong cả nƣớc
2.2.1.2. Địa điểm giám sát
Nghiên cứu đƣợc thực hiện tại 3 bệnh viện đại diện cho 3 miền trong cả nƣớc, việc thu mẫu đƣợc thực hiện bởi các cán bộ địa phƣơng có kinh nghiệm về giám sát dịch tễ và có khả năng thu thập số liệu bệnh nhân và mẫu bệnh phẩm. Những kết quả giám sát điểm tại các bệnh viện là cơ sở để các nhà dịch tễ học phân tích và đánh giá ảnh hƣởng của RV tới cộng đồng.
Ba bệnh viện đƣợc chọn đại diện cho 3 miền thuộc các khu vực khác nhau tại Việt Nam năm 2010 là:
Miền Bắc: Bệnh viện Nhi Trung Ƣơng
Miền Trung: Bệnh viện Nhi Khánh Hòa
2.2.1.3. Quy trình thực hiện
Các mẫu phân của trẻ bị TCC thỏa mãn đủ các tiêu chí đƣợc lấy mẫu trong vòng 48 giờ sau khi nhập viện và đƣợc bảo quản ở -200C. Hàng tháng, tại mỗi điểm giám sát các cán bộ tập hợp các mẫu và biên bản ghi chép đầy đủ thông tin yêu cầu và gửi về phòng kiểm nghiệm thuộc Trung tâm Nghiên cứu, sản xuất vắc xin và Sinh phẩm Y tế. Tất cả các mẫu này đều đƣợc chẩn đoán RV bằng kit ELISA. Lựa chọn các mẫu dƣơng tính có chỉ số OD cao tiến hành tách chiết ARN và xác định kiểu gen G và P của RV bằng phản ứng RT – PCR. Tổng hợp, phân tích số liệu dịch tễ học và đánh giá đặc tính các chủng RV tại Việt Nam.
Hình 6. Sơ đồ tóm tắt quy trình thực hiện
2.2.2. Phương pháp thực hiện
2.2.2.1. Lấy mẫu bệnh phẩm * Nguyên vật liệu:
Đối tượng nghiên cứu
Lấy mẫu nghiên cứu
Chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA
Mẫu âm tính Mẫu dương tính
Chọn ngẫu nhiên
Tách ARN và chạy RT - PCR
Tất cả các mẫu phân của trẻ từ 0 đến 5 tuổi nhập viện do TCC vào các bệnh viện Nhi Trung Ƣơng, Nhi Khánh Hòa và Nhi Đồng I thành phố Hồ Chí Minh
Các ống nhựa vô trùng 15ml có nút đậy, nhãn, đá khô (ice – box)…
Thiết bị tủ lạnh âm sâu -200C để bảo quản mẫu.
* Các bước tiến hành:
Ngƣời nhà bệnh nhi đƣợc hƣớng dẫn lấy mẫu vào ống nhựa vô trùng, dung tích 15ml có nút đậy, có nhãn ghi đầy đủ thông tin tên, tuổi, ngày lấy mẫu, số bệnh phẩm.
Mẫu đƣợc bảo quản ở -200C sau đó đƣợc vận chuyển tới phòng kiểm nghiệm trong điều kiện đƣợc bảo quản lạnh.
Mỗi bệnh nhi đều có phiểu theo dõi ghi đây đủ các thông tin: tên, tuổi, giới tính, địa chỉ, ngày vào viện, ngày lấy bệnh phẩm, các triệu chứng lâm sàng, số lần tiêu chảy trong ngày, kéo dài bao lâu, tính chất phân, độ mất nƣớc, sốt, nôn…
2.2.2.2. Xác định RV trong mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp ELISA
a. Nguyên lý của phương pháp
Hình 7. Sơ đồ mô tả nguyên lý của phƣơng pháp ELISA
Kháng thể gắn trên các giếng sẽ kết hợp với kháng nguyên có trong mẫu bệnh phẩm. Kháng nguyên này sẽ kết hợp với cộng hợp kháng thể gắn enzym tạo thành phức hợp Kháng thể – Kháng nguyên – Kháng thể gắn enzym. Khi có cơ chất của enzym thì cơ chất sẽ bị đổi màu. Nếu trong mẫu bệnh phẩm không có kháng nguyên thì phức hợp Kháng thể – Kháng nguyên – Kháng thể gắn enzym không đƣợc tạo thành, cơ chất không bị đổi màu.
b. Các bước tiến hành
* Chuẩn bị hóa chất và thiết bị
Bộ kit chẩn đoán virut Rota ProSpecT (Anh) gồm các thành phần:
Thành phần Thành phần chính
Phiến chuẩn độ 96 giếng Phủ kháng thể đa dòng thỏ đặc hiệu RV nhóm A Dung dịch pha loãng Đệm muối tris
Đối chứng dƣơng RV bò bất hoạt
Cộng hợp Kháng thể đa dòng thỏ đặc hiệu RV gắn với horseradish peroxidase
Cơ chất TMB Cơ chất chứa chỉ thị màu: 3,3‟ – 5,5‟-