Thiết kế nghiên cứu

2.2.1.1. Thời gian giám sát

Nghiên cứu đƣợc thực hiện từ tháng 1/2010 đến tháng 12/2010 tại 3 địa điểm trong cả nƣớc

2.2.1.2. Địa điểm giám sát

Nghiên cứu đƣợc thực hiện tại 3 bệnh viện đại diện cho 3 miền trong cả nƣớc, việc thu mẫu đƣợc thực hiện bởi các cán bộ địa phƣơng có kinh nghiệm về giám sát dịch tễ và có khả năng thu thập số liệu bệnh nhân và mẫu bệnh phẩm. Những kết quả giám sát điểm tại các bệnh viện là cơ sở để các nhà dịch tễ học phân tích và đánh giá ảnh hƣởng của RV tới cộng đồng.

Ba bệnh viện đƣợc chọn đại diện cho 3 miền thuộc các khu vực khác nhau tại Việt Nam năm 2010 là:

 Miền Bắc: Bệnh viện Nhi Trung Ƣơng

 Miền Trung: Bệnh viện Nhi Khánh Hòa

2.2.1.3. Quy trình thực hiện

Các mẫu phân của trẻ bị TCC thỏa mãn đủ các tiêu chí đƣợc lấy mẫu trong vòng 48 giờ sau khi nhập viện và đƣợc bảo quản ở -200C. Hàng tháng, tại mỗi điểm giám sát các cán bộ tập hợp các mẫu và biên bản ghi chép đầy đủ thông tin yêu cầu và gửi về phòng kiểm nghiệm thuộc Trung tâm Nghiên cứu, sản xuất vắc xin và Sinh phẩm Y tế. Tất cả các mẫu này đều đƣợc chẩn đoán RV bằng kit ELISA. Lựa chọn các mẫu dƣơng tính có chỉ số OD cao tiến hành tách chiết ARN và xác định kiểu gen G và P của RV bằng phản ứng RT – PCR. Tổng hợp, phân tích số liệu dịch tễ học và đánh giá đặc tính các chủng RV tại Việt Nam.

Hình 6. Sơ đồ tóm tắt quy trình thực hiện

2.2.2. Phương pháp thực hiện

2.2.2.1. Lấy mẫu bệnh phẩm * Nguyên vật liệu:

Đối tượng nghiên cứu

Lấy mẫu nghiên cứu

Chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA

Mẫu âm tính Mẫu dương tính

Chọn ngẫu nhiên

Tách ARN và chạy RT - PCR

 Tất cả các mẫu phân của trẻ từ 0 đến 5 tuổi nhập viện do TCC vào các bệnh viện Nhi Trung Ƣơng, Nhi Khánh Hòa và Nhi Đồng I thành phố Hồ Chí Minh

 Các ống nhựa vô trùng 15ml có nút đậy, nhãn, đá khô (ice – box)…

 Thiết bị tủ lạnh âm sâu -200C để bảo quản mẫu.

* Các bước tiến hành:

Ngƣời nhà bệnh nhi đƣợc hƣớng dẫn lấy mẫu vào ống nhựa vô trùng, dung tích 15ml có nút đậy, có nhãn ghi đầy đủ thông tin tên, tuổi, ngày lấy mẫu, số bệnh phẩm.

Mẫu đƣợc bảo quản ở -200C sau đó đƣợc vận chuyển tới phòng kiểm nghiệm trong điều kiện đƣợc bảo quản lạnh.

Mỗi bệnh nhi đều có phiểu theo dõi ghi đây đủ các thông tin: tên, tuổi, giới tính, địa chỉ, ngày vào viện, ngày lấy bệnh phẩm, các triệu chứng lâm sàng, số lần tiêu chảy trong ngày, kéo dài bao lâu, tính chất phân, độ mất nƣớc, sốt, nôn…

2.2.2.2. Xác định RV trong mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp ELISA

a. Nguyên lý của phương pháp

Hình 7. Sơ đồ mô tả nguyên lý của phƣơng pháp ELISA

Kháng thể gắn trên các giếng sẽ kết hợp với kháng nguyên có trong mẫu bệnh phẩm. Kháng nguyên này sẽ kết hợp với cộng hợp kháng thể gắn enzym tạo thành phức hợp Kháng thể – Kháng nguyên – Kháng thể gắn enzym. Khi có cơ chất của enzym thì cơ chất sẽ bị đổi màu. Nếu trong mẫu bệnh phẩm không có kháng nguyên thì phức hợp Kháng thể – Kháng nguyên – Kháng thể gắn enzym không đƣợc tạo thành, cơ chất không bị đổi màu.

b. Các bước tiến hành

* Chuẩn bị hóa chất và thiết bị

Bộ kit chẩn đoán virut Rota ProSpecT (Anh) gồm các thành phần:

Thành phần Thành phần chính

Phiến chuẩn độ 96 giếng Phủ kháng thể đa dòng thỏ đặc hiệu RV nhóm A Dung dịch pha loãng Đệm muối tris

Đối chứng dƣơng RV bò bất hoạt

Cộng hợp Kháng thể đa dòng thỏ đặc hiệu RV gắn với horseradish peroxidase

Cơ chất TMB Cơ chất chứa chỉ thị màu: 3,3‟ – 5,5‟- tetramethylbenzidine

Dung dịch dừng phản ứng H2SO4 0,46 mol/lit Đệm rửa 10X Dung dịch đệm phosphat

 Dụng cụ và nguyên vật liệu khác: chai đựng nƣớc, đệm, cồn, đồng hồ, giấy thấm…

 Thiết bị: máy đọc đĩa 96 giếng (Microwell plate reader), hãng themrmo Labsystems (Nhật) có thể đọc đƣợc bƣớc sóng 450nm

* Các bước tiến hành:

 Pha loãng mẫu 10% (100l mẫu + 900l dung dịch pha loãng)

 Nhỏ 2 giọt (100l) mẫu đối chứng dƣơng vào giếng đã đánh dấu đối chứng dƣơng

 Nhỏ 2 giọt (100l) mẫu đối chứng âm vào giếng đã đánh dấu đối chứng âm

 Nhỏ 2 giọt (100l) các mẫu đã pha loãng vào các giếng đã đánh dấu

 Nhỏ 2 giọt (100l) cộng hợp enzym vào tất cả các giếng, vỗ nhẹ trên thành giếng để hỗn hợp trên đƣợc trộn lẫn, đậy nắp và phủ giấy bạc

 Ủ ở nhiệt độ Phòng trong 60 ±5 phút

 Đổ dịch trong giếng, úp ngƣợc và đập nhẹ phiến lên giấy thấm loại bỏ hết dịch, rửa 5 lần bằng đệm rửa

 Nhỏ 2 giọt (100l) dung dịch dừng phản ứng vào từng giếng, lắc nhẹ phiến

 Quan sát bằng mắt thƣờng và đọc kết quả ở bƣớc sóng 450nm.

c. Đọc kết quả và kết luận

 Đọc kết quả bằng mắt thƣờng: so sánh màu của mẫu với màu của chứng dƣơng và chứng âm.

 Khi chưa nhỏ dung dịch dừng phản ứng:

Dương tính: có màu xanh Âm tính: không màu

Hình 8. Kết quả ELISA khi chƣa cho chất dừng phản ứng

 Sau khi đã nhỏ dung dịch dừng phản ứng:

Dương tính: có màu vàng Âm tính: không màu

 Đọc kết quả trên máy ELISA: tại bƣớc sóng 450nm, giá trị hấp phụ hiển thị trên máy tính  Tính kết quả ngƣỡng dƣơng tính: X = 0,1 + giá trị OD của chứng âm  Kết luận:

 Mẫu dƣơng tính: Khi có đơn vị hấp phụ lớn hơn hoặc bằng X

 Mẫu âm tính: Khi có đơn vị hấp phụ nhỏ hơn X

Hình 10. Đọc kết quả mẫu bệnh phẩm trên máy ELISA

2.2.2.3. Phương pháp tách chiết ARN từ mẫu phân

a. Nguyên tắc

Mẫu đƣợc ly giải trong điều kiện biến tính cao để bất hoạt RNase và bảo vệ ARN nguyên vẹn. Sau đó sử dụng đệm tạo điều kiện thích hợp để ARN liên kết với màng QIAamp và các mẫu đƣợc gắn vào cột QIAamp mini

ARN liên kết với màng và các tạp chất đƣợc loại đi bằng cách sử dụng 2 loại đệm rửa khác nhau. ARN tinh sạch sẽ đƣợc hòa tan trong đệm đặc biệt không chứa RNase.

b. Nguyên vật liệu và thiết bị

 Kit tách chiết ARN: QIAamp Viral RNA mini Kit, hãng Qiagen, Mỹ Thành phần bộ kit gồm:

Tên hóa chất Thành phần chính Vai trò

Cột QIAamp mini

- Màng silicagel - Liên kết với ARN mẫu - Bền và không giữ lại Muối Đệm AVL - Guanidine

- Thiocyanate

- Ly giải, phá vỡ cấu trúc bậc 3 của protein, ADN/ARN và biến tính Đệm AW1 Đệm AW2 - Guanidine - hydrocloride - Loại bỏ tạp chất mà không ảnh hƣởng đến liên kết của ARN

Đệm AVE - Natri azid 0,04% - Hòa tan ARN bám trên màng - Tránh nhiễm khuẩn và RNase

- Tăng cƣờng liên kết acid nucleic của virut với màng QIAamp mini

Carier ARN - polyA - Bảo vệ ARN của virut khỏi RNase, tăng độ bền của ARN

 Dụng cụ và thiết bị khác:

o Pipet man và đầu côn tƣơng ứng, ống eppendorf, giá để ống

o Máy lắc vontex

o Máy ly tâm

o Bể ổn nhiệt

o Dung dịch Vertrel

c. Quy trình tách chiết

 Hút 100l mẫu phân vào 900l PBS tạo dung dịch 10%

 Hút 200l dịch mẫu phân 10% vào týp và thêm 200l vertrel/mẫu

 Vontex trong 1 phút, sau đó ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút

 Hút 140l dịch chiết trên vào 1 týp khác và thêm 560l/mẫu AVL (AVE–ARN carrier)

 Lắc, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút

 Tra 630l lên cột QIAamp mini lần 1 vào ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút

 Thêm tiếp 630l lên cột QIAamp mini lần 2 và ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút. Thay ống thu mẫu bằng ống mới

 Cho 500l dung dịch rửa AW1 (có Ethanol) vào cột và ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút. Thay ống thu mẫu bằng ống mới

 Cho 500l dung dịch rửa AW2 (có Ethanol) vào cột và ly tâm 14000 vòng/phút trong 3 phút. Thay ống thu mẫu bằng eppendorf 1,7ml mới

 Thêm 50l AVE và ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút

 Ly tâm 8000 vòng/phút để thu đƣợc ARN mẫu.

2.2.2.4. Phương pháp xác định týp RV bằng RT – PCR

a. Nguyên lý của phương pháp

Phƣơng pháp nested RT – PCR đƣợc sử dụng để xác định kiểu gen RV lƣu hành, Phản ứng RT – PCR gồm 2 bƣớc:

Trong lần PCR thứ nhất (PCR1), ARN kép của RV tách chiết từ mẫu phân đƣợc dùng làm khuôn cho quá trình phiên mã ngƣợc, đồng thời xảy ra phản ứng khuếch đại nhờ sử dụng enzym Taq polymerase. Sản phẩm của PCR1 đƣợc dùng làm khuôn để tổng hợp các đoạn ADN đặc trƣng cho từng kiểu gen G và P.

Phản ứng PCR2 sử dụng hỗn hợp các mồi (primer) đặc hiệu cho các týp, các mồi nằm ở các vùng biến đổi của gen nhƣng mỗi týp huyết thanh vùng này lại không thay đổi. Sản phẩm của PCR2 thu đƣợc sẽ tiến hành chạy điện di giúp xác định kiểu gen của RV.

Bảng 5. Các primer đƣợc sử dụng để định týp G và týp P

Giai

đoạn Tên primer Trình tự (5’ – 3’)

Vị trí trên đoạn gen Primer đặc hiệu c ho k iểu gen G PCR1

VP7 - E ATG TAT GGT ATT GAA TAT ACC AC 51-71 VP7 – R AAC TTG CCA CCA TTT TTT CC 914-932

PCR2

VP7 - R AAC TTG CCA CCA TTT TTT CC 914-932 aBT1 (G1) CAA GTA CTC AAA TCA ATG ATG G 314-335 aCT2 (G2) CAA TGA TAT TAA CAC ATT TTC TGT

G 411-435

mG3 (G3) ACG AAC TCA ACA CGA GAG G 250-269 aDT4 (G4) CGT TTC TGG TGA GGA GTT G 480-498 aDT8 (G8) GTC ACA CCA TTT GTA AAT TCG 178-198 mG9 (G9) CTT GAT GTG ACT AYA AAT AC 757-776 mG10 (G10) ATG TCA GAC TAC ARA TAC TGG 666-687

Primer đặc

hiệu c

ho k

iểu gen P

PCR1

VP4 – F TAT GCT CCA GTN AAT TGG 132-149 VP4 - R ATT GCA TTT CTT TCC ATA ATG 775-795

PCR2

VP4 - F TAT GCT CCA GTN AAT TGG 132-149 2T–1 (P[4]) CTA TTG TTA GAG GTT AGA GTC 474-494 3T–1(P[6]) TGT TGA TTA GTT GGA TTC AA 259-278 1T–1D (P[8]) TCT ACT GGT TTR CAN TGC 339-356 4T–1 (P[9]) TGA GAC ATG CAA TTG GAC 385-402 5T–1 (P[10]) ATC ATA GTT AGT AGT CGG 575-594 Mp[11] GTA AAC ATC CAG AAT GTG 305-323

Vị trí của các primer trong phản ứng PCR và sự hình các đoạn gen khác nhau của gen G và P đƣợc thể hiện ở hình sau:

Hình 11. Vị trí các Primer và bản sao ADN thu đƣợc để xác định kiểu gen G

Hình 12. Vị trí các Primer và bản sao ADN thu đƣợc để xác định kiểu gen P

Bản phiên mã đầu tiên Gen P[6] Gen P[11] Gen P[8] Gen P[9] Gen P[4] Gen P[10]

b. Nguyên vật liệu và thiết bị

* Thiết bị:

 Máy PCR Model: Gene Amp PCR System 9700, Applied Biosystems, Mỹ

 Máy trộn IKA, Anh

 Máy ly tâm Hettich, Đức

 Máy làm đá Fiocchetti, Mỹ

* Nguyên vật liệu chung:

 PCR đệm 10X

 25mM MgCl2

 RT

 Taq ADN polymerase

 100mM dNTPs  Nusieve GTG agarose  Seaplaque agarose  TBE 10X  Loading dye 6X  GeneRuller 100 bp ADN

 Khay đựng, pipet aid, đầu côn, eppendorf…

c. Các bước tiến hành

* Các bước tiến hành chạy RT – PCR định týp G

 Chuẩn bị Master Mix cho PCR1:

Thành phần Thể tích (l)/mẫu RNA 5 Đệm 10X (chứa Mg2+) 10 dNTPs (5 mM) 4 DMSO 7 VP7E (100 ng) 1 VP7R (100 ng) 1 H2O (DEPC, deionized) 70,7 Tổng 98,7

 Thực hiện PCR1:

o Tính số mẫu cần xác định týp G, lấy đủ ống và ghi tên mẫu hay kí hiệu

o Lấy 5l ARN đã tách chiết của từng mẫu cho vào mỗi ống

o Bổ sung Master Mix vào các ống phản ứng với tổng thể tích là 98,7l

o Đặt các ống vào máy PCR và biến tính ở 970

C/5 phút

o Lấy mẫu ra nhanh và đặt trong đá 3 phút

o Cho tiếp 1 l RT/ mẫu và 0,3 l Taq/ mẫu

o Đặt mẫu vào máy PCR và cài đặt chạy chƣơng trình nhiệt để tổng hợp cDNA ở 420C/60 phút, tiếp tục chạy PCR1 với chƣơng trình 940C/1 phút, 420C/2 phút; 680C/1 phút trong 30 chu kỳ

o Kết thúc chƣơng trình lấy mẫu ra vào bảo quản ở 40

C.

 Chuẩn bị Master Mix cho PCR2:

Thành phần Thành phần (l)/mẫu cDNA 1 Đệm 10X (Chứa Mg2+) 10 dNTPs (5 mM) 4 DMSO 7 VP7E (100 ng) 1 Gmix (100 ng) 4 H2O (DEPC, deionized) 72.7 Taq 0.3 Tổng số 100  Thực hiện PCR2:

o Lấy đủ số ống và ghi rõ kí hiệu

o Bổ sung 99l Master Mix vào mỗi ống và thêm 1l sản phẩm PCR1

o Chạy PCR theo chƣơng trình: 940

C/1 phút; 420C /2 phút; 680C /1 phút trong 30 chu kỳ

* Các bước tiến hành chạy RT – PCR định týp P

 Chuẩn bị Master Mix cho PCR1:

Thành phần Thể tích(l)/mẫu RNA 5 Đệm 10X (Chứa Mg2+) 10 dNTPs (5 mM) 4 DMSO 7 VP4F (100 ng) 1 VP4R (100 ng) 1 H2O (DEPC, deionized) 70.7 Tổng 98.7

 Chuẩn bị Master Mix cho PCR2:

Thành phần Thể tích(l)/mẫu cDNA 5 Đệm 10X (Chứa Mg2+ ) 10 dNTPs (5 mM) 4 VP4F (100 ng) 1 Pmix (100 ng) 6 H2O (DEPC, deionized) 73.7 Taq 0.3 Tổng 100

 Thực hiện các bƣớc tƣơng tự xác định kiểu gen G với chƣơng trình chạy PCR cài đặt nhƣ sau:

o Chƣơng trình nhiệt để tổng hợp cDNA ở 420C/60 phút, tiếp tục chạy PCR1 với chƣơng trình: 940

C/1 phút; 500C /2 phút; 720C/1 phút trong 30 chu kỳ.

o Chƣơng trình PCR2: 940C/1 phút; 500C/2 phút; 720C/1 phút trong 40 chu kỳ.

2.2.2.5. Chạy điện di và đọc kết quả

a. Nguyên lý

b. Nguyên vật liệu và thiết bị

 Thạch Agarose 2%

 Dung dịch ethidium bromide (0,5mg/ml)

 Dung dịch đệm chạy điện di TBE 1X

 Thang chuẩn 100 Bp Ruller

 Thuốc nhuộm Gel loading Dye 6X

 Giấy parafin

 Bộ điện di gồm: khay đổ thạch và lƣợc, bể điện di, nguồn cung cấp dòng điện 1 chiều

 Máy chụp ảnh gel có đèn tím nối với máy vi tính.

c. Các bước tiến hành

 Pha thạch Agarose 2% trong đệm TBE 1X

 Đổ thạch, mỗi bản gel cần khoảng 70 – 80 ml, đặt bản gel vào bể điện di sao cho ngập bản gel.

 Chuẩn bị mẫu và nạp mẫu lên bản gel

 Hút 5 ml sản phẩm PCR2 trộn đều với 3 ml loading Dye 6X trên giấy parafin và nạp toàn bộ hỗn dịch này lên các giếng trên bản gel. Sắp xếp các mẫu theo sơ đồ và ghi lại (trong đó 01 giếng chính giữa nạp thang chuẩn)

 Tiến hành chạy điện di ở hiệu điện thế 150V, 60 mA khi mẫu chạy đƣợc 3/4 chiều dài bản gel là đƣợc

 Nhuộm bản gel sau điện di trong Dung dịch ethidium bromide 0,5mg/ml trong 30 – 45 phút

Hình 13. ảnh minh họa vị trí mẫu trên bản gel

d. Đọc kết quả và kết luận

 So sánh với thang chuẩn để xác định kích thƣớc các ADN thu đƣợc sau PCR2:

Bảng 6. Bảng tra kích thƣớc các kiểu gen G, P sau khi điện di Kích thƣớc ADN  kiểu gen G Kích thƣớc ADN  kiểu gen P

179bp  G9 146bp  P[6] 266bp  G10 191bp  P[11] 452bp  G4 224bp  P[8] 521bp  G2 270bp  P[9] 618bp  G1 362bp  P[4] 682bp  G3 462bp  P[10] 754bp  G8  Kết luận:

o Các mẫu hiện “băng” sẽ có vị trí tƣơng ứng với kích thƣớc bao nhiêu trên thang chuẩn 100 Bp Ruller

o Các mẫu không hiện “băng”  chƣa xác định đƣợc kiểu gen G hoặc P