Bệnh Lao (Mycobacterium Tuberculosis MTB) – Tác nhân gây bệnh nhiễm trùng chiếm tỉ lệ tử vong hàng đầu tại các Quốc gia đang phát triển trong khoảng 15 năm trở lại đây. Cùng với sự bùng phát của đại dịch HIV trên toàn cầu, môi trường sống ngày càng suy thoái, người nhập cư từ các quốc gia kém phát triển, bệnh nhân mắc lao bỏ điều trị … ảnh hưởng trực tiếp tới khả năng miễn dịch của con người và sức khỏe cộng đồng, và quan trọng nhất sự quay trở lại của bệnh lao – lao kháng thuốc đã đặt nhân loại một lần nữa đối diện với đại dịch lao tưởng như đã được thanh toán ở thế kỷ trước.Còn tại các nước phát triển, nơi bệnh lao về cơ bản được khống chế thì bệnh lao không điển hình (Nontubercolusis Mycobacterium – NTM) lại là tác nhân gây nhiễm trùng âm thầm và nguy hại đối với các bệnh nhân mắc bệnh liên quan đến tình trạng miễn dịch.
SỞ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HÀ NỘI TRƯỜNG THPT CHUYÊN HÀ NỘI-AMSTERDAM QUẬN CẦU GIẤY ************** ĐỀ TÀI DỰ THI KHOA HỌC, KỸ THUẬT DÀNH CHO HỌC SINH TRUNG HỌC CẤP THÀNH PHỐ LẦN THỨ TƯ (NĂM HỌC 2014 - 2015) Tên đề tài: NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ SINH PHẨM CHẨN ĐỐN VI KHUẨN LAO KHƠNG ĐIỂN HÌNH (NONTUBERCULOSIS MYCOBACTERIA - NTM) TRÊN BỆNH NHÂN NGHI MẮC BỆNH LAO TẠI VIỆT NAM Lĩnh vực: Y- Sinh NGƯỜI HƯỚNG DẪN TÁC GIẢ: - Th.S Phan Minh Tuấn Nguyễn Cơng Minh - Phịng Phát triển Cơng nghệ Y-Sinh, Trung tâm phát triển công nghệ cao, Viện Hàn lâm Khoa học kĩ thuật Việt Nam Nguyễn Trọng Hiếu Lớp: 12 Sinh - Trường THPT Chuyên Hà Nội Amsterdam Lớp: 12 Sinh - Trường THPT Chuyên Hà Nội Amsterdam Hà Nội, tháng 12 năm 2014 LỜI CẢM ƠN Nhóm nghiên cứu xin chân thành cảm ơn công ty Intel tổ chức Hội thi Khoa học trẻ Intel ISEF toàn giới, cảm ơn Bộ Giáo dục Đào tạo Việt Nam, Sở Giáo dục Đào tạo Hà Nội chi nhánh công ty ISEF Việt Nam phối hợp tổ chức nên hội thi Việt Nam, tạo hội cho nhóm tiếp cận gần với hoạt động khoa học trẻ toàn giới Đây hội tốt cho nhóm nghiên cứu nói riêng học sinh Hà Nội học sinh Việt Nam nói chúng có dịp đào sâu kiến thức, đưa ý tưởng khoa học thực hóa, làm quen kỹ mềm khác, giao lưu học hỏi với bạn bè nước quốc tế Trong trình thực đề tài, nhóm nhận quan tâm đạo, góp ý chân thành Ban Giám hiệu Nhóm Khoa học tạo điều kiện thầy cô giáo trường THPT Hà Nội Amsterdam Đồng thời, hỗ trợ phịng phát triến cơng nghệ Y Sinh, Trung tâm phát triển công nghệ cao thuộc viện hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam mặt địa điểm, sở vật chất, trang thiết bị, dụng cụ thí nghiệm vơ q giá với nhóm nghiên cứu suốt thời gian nghiên cứu Nhóm thực đề tài nhận hỗ trợ vơ nhiệt tình giáo viên hướng dẫn: ThS Trần Thị Thu Hương, cô Nguyễn Thị Hưởng chuyên gia ThS Phan Minh Tuấn, ThS Nguyễn Chi Mai KS Lê Thành Long hỗ trợ hết lịng mặt lí thuyết kĩ năng, nhờ mà nhóm nghiên cứu hồn thành đề tài Một lần nữa, nhóm xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cá nhân, tập thể tổ chức đóng góp quý báu ủng hộ nhiệt tình suốt thời gian thực đề tài Nhóm nghiên cứu Mục lục Mục lục Mục lục bảng Mục lục hình ảnh TÓM TẮT I.GIỚI THIỆU 10 1.LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 10 2.MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 11 3.TÍNH MỚI VÀ SÁNG TẠO CỦA ĐỀ TÀI 12 II.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 12 1.KHÁI NIỆM CHUNG 12 Hình 1: MAC mơi trường Lowenstein – Jensen sau tuần nuôi cấy 13 2.TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 13 Hình Tỉ lệ ca bệnh vi khuẩn nhóm NTM gây khu vực châu Á 14 3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ CÁC KỸ THUẬT SỬ DỤNG 15 Bảng Thành phần phản ứng PCR 16 Bảng Chu kỳ nhiệt thông thường cho phản ứng PCR 16 4.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ DỰ KIẾN 17 III.QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU 17 1.THU THẬP, VẬN CHUYỂN, BẢO QUẢN MẪU BỆNH PHẨM VÀ CHỦNG VI KHUẨN 17 Bảng Danh sách mẫu 17 2.XỬ LÝ VÀ KHỬ TẠP MẪU BỆNH PHẨM 18 3.TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ TỪ MAC 19 4.KIỂM TRA KẾT QUẢ SẢN PHẨM PCR 20 Hình 3: Ảnh minh họa liệu tìm kiếm thơng tin qua từ khóa “mycobacterium” cổng thông tin NCBI 21 Hình 4: Ảnh minh họa liệu tìm kiếm nucleotide thơng qua từ khóa “mycobacterium 16S” cổng thông tin NCBI 22 Hình 5: Ảnh minh họa liệu tìm kiếm nucleotide thơng qua từ khóa “mycobacterium rpoB” cổng thơng tin NCBI 22 Hình 6: Ảnh minh họa liệu tìm kiếm nucleotide thơng qua từ khóa “mycobacterium hsp65” cổng thơng tin NCBI 23 Bảng Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại DNA tổng số thu từ mẫu 24 5.GIẢI TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GENE TRÊN PHẦN MỀM CHUYÊN DỤNG 24 Bảng Thành phần phản ứng PCR đọc trình tự 25 Hình 7: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR đọc trình tự 25 Hình 8: Kết trình tự so sánh với mẫu đối chứng .27 Hình 9: Kết trình tự so sánh với ngân hàng genethế giới (Genbank) để tìm tương đồng 28 IV.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 1.KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ 28 Hình 10: Ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số tách từ mẫu NTM1 theo quy trình tách chiết 28 2.KẾT QUẢ NHÂN GENE (PCR) 28 Hình 11: Kết điện thí nghiệm tìm nhiệt độ bắt cặp nồng độ DNA tổng số phù hợp 29 Hình 12: Kết điện di sản phẩm PCR 30 3.KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE 31 THỜI GIAN HOÀN THÀNH MỘT LẦN XÉT NGHIỆM 31 V.KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 1.KẾT LUẬN 32 PHỤ LỤC 34 Mục lục bảng Mục lục Mục lục bảng Mục lục hình ảnh TÓM TẮT I.GIỚI THIỆU 10 1.LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 10 2.MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 11 3.TÍNH MỚI VÀ SÁNG TẠO CỦA ĐỀ TÀI 12 II.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 12 1.KHÁI NIỆM CHUNG 12 Hình 1: MAC mơi trường Lowenstein – Jensen sau tuần nuôi cấy 13 2.TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 13 Hình Tỉ lệ ca bệnh vi khuẩn nhóm NTM gây khu vực châu Á 14 3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ CÁC KỸ THUẬT SỬ DỤNG 15 Bảng Thành phần phản ứng PCR 16 Bảng Chu kỳ nhiệt thông thường cho phản ứng PCR 16 4.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ DỰ KIẾN 17 III.QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU 17 1.THU THẬP, VẬN CHUYỂN, BẢO QUẢN MẪU BỆNH PHẨM VÀ CHỦNG VI KHUẨN 17 Bảng Danh sách mẫu 17 2.XỬ LÝ VÀ KHỬ TẠP MẪU BỆNH PHẨM 18 3.TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ TỪ MAC 19 4.KIỂM TRA KẾT QUẢ SẢN PHẨM PCR 20 Hình 3: Ảnh minh họa liệu tìm kiếm thơng tin qua từ khóa “mycobacterium” cổng thơng tin NCBI 21 Hình 4: Ảnh minh họa liệu tìm kiếm nucleotide thơng qua từ khóa “mycobacterium 16S” cổng thông tin NCBI 22 Hình 5: Ảnh minh họa liệu tìm kiếm nucleotide thơng qua từ khóa “mycobacterium rpoB” cổng thơng tin NCBI 22 Hình 6: Ảnh minh họa liệu tìm kiếm nucleotide thơng qua từ khóa “mycobacterium hsp65” cổng thông tin NCBI 23 Bảng Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại DNA tổng số thu từ mẫu 24 5.GIẢI TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GENE TRÊN PHẦN MỀM CHUYÊN DỤNG 24 Bảng Thành phần phản ứng PCR đọc trình tự 25 Hình 7: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR đọc trình tự 25 Hình 8: Kết trình tự so sánh với mẫu đối chứng .27 Hình 9: Kết trình tự so sánh với ngân hàng genethế giới (Genbank) để tìm tương đồng 28 IV.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 1.KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ 28 Hình 10: Ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số tách từ mẫu NTM1 theo quy trình tách chiết 28 2.KẾT QUẢ NHÂN GENE (PCR) 28 Hình 11: Kết điện thí nghiệm tìm nhiệt độ bắt cặp nồng độ DNA tổng số phù hợp 29 Hình 12: Kết điện di sản phẩm PCR 30 3.KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE 31 THỜI GIAN HOÀN THÀNH MỘT LẦN XÉT NGHIỆM 31 V.KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 1.KẾT LUẬN 32 PHỤ LỤC 34 Mục lục hình ảnh Mục lục Mục lục bảng Mục lục hình ảnh TÓM TẮT I.GIỚI THIỆU 10 1.LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 10 2.MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 11 3.TÍNH MỚI VÀ SÁNG TẠO CỦA ĐỀ TÀI 12 II.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 12 1.KHÁI NIỆM CHUNG 12 Hình 1: MAC môi trường Lowenstein – Jensen sau tuần nuôi cấy 13 2.TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƯỚC 13 Hình Tỉ lệ ca bệnh vi khuẩn nhóm NTM gây khu vực châu Á 14 3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ CÁC KỸ THUẬT SỬ DỤNG 15 Bảng Thành phần phản ứng PCR 16 Bảng Chu kỳ nhiệt thông thường cho phản ứng PCR 16 4.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ DỰ KIẾN 17 III.QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU 17 1.THU THẬP, VẬN CHUYỂN, BẢO QUẢN MẪU BỆNH PHẨM VÀ CHỦNG VI KHUẨN 17 Bảng Danh sách mẫu 17 2.XỬ LÝ VÀ KHỬ TẠP MẪU BỆNH PHẨM 18 3.TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ TỪ MAC 19 4.KIỂM TRA KẾT QUẢ SẢN PHẨM PCR 20 Hình 3: Ảnh minh họa liệu tìm kiếm thơng tin qua từ khóa “mycobacterium” cổng thơng tin NCBI 21 Hình 4: Ảnh minh họa liệu tìm kiếm nucleotide thơng qua từ khóa “mycobacterium 16S” cổng thơng tin NCBI 22 Hình 5: Ảnh minh họa liệu tìm kiếm nucleotide thơng qua từ khóa “mycobacterium rpoB” cổng thông tin NCBI 22 Hình 6: Ảnh minh họa liệu tìm kiếm nucleotide thơng qua từ khóa “mycobacterium hsp65” cổng thông tin NCBI 23 Bảng Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại DNA tổng số thu từ mẫu 24 5.GIẢI TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GENE TRÊN PHẦN MỀM CHUYÊN DỤNG 24 Bảng Thành phần phản ứng PCR đọc trình tự 25 Hình 7: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR đọc trình tự 25 Hình 8: Kết trình tự so sánh với mẫu đối chứng .27 Hình 9: Kết trình tự so sánh với ngân hàng genethế giới (Genbank) để tìm tương đồng 28 IV.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 1.KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ 28 Hình 10: Ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số tách từ mẫu NTM1 theo quy trình tách chiết 28 2.KẾT QUẢ NHÂN GENE (PCR) 28 Hình 11: Kết điện thí nghiệm tìm nhiệt độ bắt cặp nồng độ DNA tổng số phù hợp 29 Hình 12: Kết điện di sản phẩm PCR 30 3.KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE 31 THỜI GIAN HOÀN THÀNH MỘT LẦN XÉT NGHIỆM 31 V.KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 1.KẾT LUẬN 32 PHỤ LỤC 34 TÓM TẮT Cho đến thời điểm tại, vào kỷ thứ 21, vi khuẩn lao gây vấn đề trầm trọng cho y tế sức khỏe cộng đồng Mặc dù đầu tư cho y tế tốt nhiều với phương tiện trang thiết bị máy móc đại, phương pháp chẩn đoán hiệu làm giảm thiểu ca lây truyền nhiễm lao mới, tượng mắc lao khơng điển hình (Nontuberculosis mycobacteria - NTM) lại gia tăng đối tượng bệnh nhân có tình trạng suy giảm miễn dịch, có tiền sử bệnh lý mãn tính phổi hay có bất thường kiểu genecủa bệnh xơ hóa kén, α-antitrypsin, interferon-gamma (IFN-γ), interleukin-12 Tại Việt Nam, việc chẩn đoán NTM bệnh viện sở y tế từ trước đến sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh truyền thống cho kết chậm (15 – 20 ngày) thường xuyên bị tạp nhiễm, nên khả đặc hiệu chẩn đoán thấp Ở lĩnh vực chẩn đốn phân tử gần chưa có nghiên cứu vấn đề triển khai ghi nhận Cũng phải nói việc chẩn đoán cận lâm sàng NTM sở y tế Việt Nam chưa đầu tư nghiên cứu cách có bản, điều góp phần đưa bệnh lao khơng điển hình NTM âm thầm bùng phát gây tác hại lớn đến sức khỏe kinh tế người bệnh Do vậy, Nhóm nghiên cứu đề xuất nghiên cứu sử dụng kỹ thuật chẩn đoán phân tử đại việc chẩn đốn phát sớm có mặt vi khuẩn lao khơng điển hình (NTM) mẫu bệnh phẩm bệnh nhân nghi mắc lao không đáp ứng với công thức điều trị lao thông thường, mục tiêu nghiên cứu tập trungtối ưu khâu trình thực khâu xử lý mẫu, tách chiết DNA vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm khâu xác định kết theo hướng đơn giản, dễ thao tác, hạn chế tối đa khả nhiễm chéo mẫu xét nghiệm, an toàn cho người sử dụng thân thiện với mơi trường Từ khóa: Mycobacterium tuberculosis (MTB), Non Tubercolusis Mycobacterium (NTM), Mycobacterium avium complex (MAC), PCR, lao điển hình, lao khơng điển hình, lao mơi trường I GIỚI THIỆU LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Bệnh Lao (Mycobacterium Tuberculosis - MTB) – Tác nhân gây bệnh nhiễm trùng chiếm tỉ lệ tử vong hàng đầu Quốc gia phát triển khoảng 15 năm trở lại Cùng với bùng phát đại dịch HIV tồn cầu, mơi trường sống ngày suy thoái, người nhập cư từ quốc gia phát triển, bệnh nhân mắc lao bỏ điều trị … ảnh hưởng trực tiếp tới khả miễn dịch người sức khỏe cộng đồng, quan trọng quay trở lại bệnh lao – lao kháng thuốc đặt nhân loại lần đối diện với đại dịch lao tưởng tốn kỷ trước Cịn nước phát triển, nơi bệnh lao khống chế bệnh 10 Bước Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ Biến tính 94 phút Biến tính 94 30 giây 30 Gắn mồi 57 30 giây Kéo dài chuỗi 72 1phút Hoàn tất kéo dài 72 10 phút Kết thúc phản ứng ∞ Bảng Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại DNA tổng số thu từ mẫu Đoạn mồi thiết kế thử nghiệm với mẫu NTM đến NTM 10 Ngoài ra, nhóm nghiên cứu cịn thử nghiệm với mẫu bênh phẩm bệnh nhân xác định mắc lao điển hình 4.4Điện di SafeView™-Classic * Chuẩn bị điện di - Đun sôi 100ml dung dịch agarose 1%, - Nhỏ µl dung dịch SafeView™-Classic vào dung dịch agarose Lắc dung dịch cho khơng cịn bọt khí làm nguội xuống nhiệt độ ~50oC Đổ vào khuôn tạo giếng để load mẫu * Chuẩn bị mẫu: - Mẫu trộn với dung dịch loading dye 6x, Load mẫu vào giếng điện di * Điện di: - Tiến hành điện di với µl dung dịch SafeView™/100ml buffer - Sau 30 phút, dừng điện di quan sát điện di tia cực tím GIẢI TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GENE TRÊN PHẦN MỀM CHUYÊN DỤNG 5.1 Kiểm nghiệm tính đắn độ tin cậy sản phẩm Sản phẩm PCR thu nhận chuyên đề đem xác định trình tự nucleotid để kiểm chứng tính đắn quy trình Trình tự gene xác định máy xác định tự động ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer theo kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle 24 Sequencing Trình tự xác định hai sợi khuôn đối nghĩa với việc sử dụng hai mồi xi ngược Tuy nhiên, có mồi tham gia phản ứng, mồi đơn bám vào vùng bổ sung thiết kế vector STT Thành phần Thể tích (µl) Dung dịch đệm (5X) Mồi 1,275 DNA mẫu (~ 200ng) 7,725 BigDye Tổng 15 Bảng Thành phần phản ứng PCR đọc trình tự 25 chu kỳ 96oC 96oC phút 10 giây 55oC giây 60oC phút 72oC phút 4oC 30 phút Hình 7: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR đọc trình tự Sản phẩm PCR tinh cách bổ sung µl EDTA 125mM, 60 µl cồn 100% ủ nhiệt độ phịng 15 phút Tiếp đó, ly tâm 12000 v/p 15 phút để tủa đoạn DNA, sau loại bỏ cồn Bổ sung 60 µl cồn 70% ly tâm 25 10000 v/p 10 phút Làm khơ kết tủa DNA, bổ sung 10 µl Hi-DiTM Formamide biến tính 95oC phút Các mẫu tra vào giếng khay đựng mẫu, sau điện di ống mao quản 80 cm x 50 µl với polymer POP-4™ Kết xử lý phần mềm DNA star BioEdit Xử lý trình tự: Hiện nay, có nhiều phần mềm chuyên dụng xử lý trình tự PC GENE, Clustal, DNA star, BioEdit, Chromas… Trong phần mềm kể BioEdit hệ thống phần mềm tiện dụng 26 Hình 8: Kết trình tự so sánh với mẫu đối chứng Kết trình tự genethu được đưa lên ngân hàng genethế giới (Genbank: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi? PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome ) để so sánh tính tương đồng kết 27 Hình 9: Kết trình tự so sánh với ngân hàng genethế giới (Genbank) để tìm tương đồng IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ Ba quy trình tách chiết DNA nhóm nghiên cứu thực tối ưu hóa, sử dụng vật liệu ban đầu mẫu bệnh phẩm NTM1 khử tạp DNA tổng số NTM1 kiểm tra kỹ thuật điện di agarose 0,8% với 3µl mẫu/giếng (hình 1) Giếng 1: Quy trình (BOOM kit); Giếng 2: Quy trình (phương pháp Haemophilus influenzae); Giếng 3: Quy trình (sử dụng đệm chiết); Hình 10: Ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số tách từ mẫu NTM1 theo quy trình tách chiết Kết điện di hình cho thấy sử dụng quy trình (BOOM kit) quy trình (sử dụng đệm chiết) nhóm nghiên cứu thu băng DNA tổng số rõ nét phía (giếng 1, giếng 3), thể chất lượng hàm lượng DNA tổng số tốt Ngược lại, DNA tổng số tách theo quy trình (tách DNA theo phương pháp Haemophilus influenzae) có hàm lượng ít, không quan sát băng vạch DNA rõ nét (giếng 2) So sánh quy trình quy trình cho thấy băng vạch DNA tách theo quy trình rõ nét DNA gẫy hơn, chứng tỏ quy trình tách chiết DNA sử dụng đệm chiết phương pháp hiệu để tách chiết DNA với mẫu bệnh phẩm chứa vi khuẩn lao không điển hình NTM KẾT QUẢ NHÂN GENE (PCR) Cặp mồi sử dụng phản ứng nhân gen: 28 -16S For: 5’-ACCTCAAGACGCATTCTTC – 3’ -16S Rev: 5’-CGACAGCTCCCTCCAAAAG – 3’ Đoạn trình tự 16S nhân lên cặp mồi có kích thước dự đốn là: 1282 bp Cặp mồi thiết kế đặc trưng cho chủng M.avium complex Tối ưu hóa phản ứng PCR Để tối ưu hóa phản ứng PCR, nhóm nghiên cứu khảo sát vùng nhiệt độ bắt cặp mồi từ 54 - 60ᵒC lượng DNA tổng số đưa vào từ 1-4 µl có nồng độ 100 ng/µl DNA tổng số sử dụng làm khuôn phản ứng PCR sản phẩm tách từ chủng M.avium chuẩn ATCC 25291 Kết PCR thể hình 4 Giếng 1: Đối chứng âm, khuôn H2O Giếng 2: Nhiệt độ bắt cặp mồi 57ᵒC – µl DNA tổng số Giếng 3: Nhiệt độ bắt cặp mồi 57ᵒC – µl DNA tổng số Giếng 4: Nhiệt độ bắt cặp mồi 57ᵒC – µl DNA tổng số Giếng 5: Nhiệt độ bắt cặp mồi 54ᵒC – µl DNA tổng số Giếng 6: Nhiệt độ bắt cặp mồi 54ᵒC – µl DNA tổng số Giếng 7: Nhiệt độ bắt cặp mồi 54ᵒC – µl DNA tổng số Giếng 8: Nhiệt độ bắt cặp mồi 60ᵒC – µl DNA tổng số Giếng 9: Nhiệt độ bắt cặp mồi 60ᵒC – µl DNA tổng số 10 Hình 11: Kết điện thí nghiệm tìm nhiệt độ bắt cặp nồng độ DNA tổng số phù hợp Kết điện di cho thấy, giếng không xuất băng DNA, chứng tỏ phản ứng PCR không nhiễm DNA ngoại lai Các giếng - xuất băng DNA với kích thước dự kiến (khoảng 1280bp) Như vậy, cặp mồi đặc hiệu thiết kế, nhóm nghiên cứu khuếch đại đoạn genemong muốn từ chủng chuẩn M.avium ATCC 25291 Ở nhiệt độ bắt cặp mồi 57ᵒC, băng DNA xuất rõ nét, lượng µl DNA tổng số nồng độ 100 ng/µl, băng lên rõ nét mảnh 29 Ở nhiệt độ bắt cặp mồi 54ᵒC, xuất hiện tượng không đặc hiệu, có xuất băng sát nhau; nhiệt độ bắt cặp mồi 60ᵒC, không xuất đoạn DNA lượng DNA khuôn khác Từ kết thu nhóm nghiên cứu tối ưu nhiệt độ bắt cặp mồi 57ᵒC lượng DNA khuôn cho vào phản ứng µl DNA tổng số có nồng độ 100 ng/µl tổng thể tích phản ứng 25 µl Kết PCR Giếng 1: Thang DNA chuẩn 1kb Giếng 2: Mẫu DNA tổngsốAviumchạyvớicặpmồi 16S nồngđộ 1µ / phảnứng Giếng 3: Mẫu DNA tổngsốcủa TB chạyvớicặpmồi 16S nồngđộ1µ / phảnứng 1000 bp Giếng 4: Mẫu DNA tổngsốAviumchạyvớicặpmồi 16S nồngđộ 5µ / phảnứng Giếng 5: Mẫu DNA tổngsốcủa TB chạyvớicặpmồi 16S nồngđộ 5µ / phảnứng Hình 12: Kết điện di sản phẩm PCR Kết lên điện di cho thấy: đoạn mồi có khả nhân lên đoạn gene có kích thước khoảng 1282 bp, giống với kích thước đoạn gene đặc hiệu mà nhóm nghiên cứu xác định chủng NTM gốc Ngồi ra, cho phản ứng PCR với mẫu bệnh phẩm bệnh nhân lao điển hình, nhóm khơng quan sát băng DNA điện di, chứng tỏ đoạn mồi khơng tương thích với trình tự gene vi khuẩn MTB Dựa theo kết ta thấy + Thành công việc nhân đoạn gene16s Avium từ mẫu bệnh phẩm, kích thước khoảng 1200bp phù hợp với tính tốn lý thuyết mồi thiết kế + Các mẫu mẫu bệnh phẩm lao chạy cặp mồi 16s Avium không 30 nhân lên nồng độ khác nhau, chứng tỏ cặp mồi thiết kế đặc hiệu KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE Qua hình ảnh trình tự nucleotid phần III.5 thu nhận cho thấy: - Hình 8: Kết trình tự so sánh với trình tự chủng chuẩn M.Avium (ATCC-25291), trình tự chuẩn vi khuẩn lao để đánh giá khác biệt Kết cho thấy trình tự BN001 thu có tính tương đồng cao với trình tự ATCC-25291 vùng geneđịnh danh 16S Và có khác biệt 19 vị trí so với trình tự vi khuẩn lao đối chứng - Hình 9: Kết trình tự thu đem so sánh với ngân hàng genethế giới để tìm tương đồng kết quả, Hình ảnh cho thấy trình tự thu có độ tương đồng đến 99% so với chủng M.Avium ghi nhận Genbank, trình tự genethu hồn tồn khơng lẫn với chủng khác họ Mycobacterium đặc biệt Micobacterium Tubercolusis THỜI GIAN HOÀN THÀNH MỘT LẦN XÉT NGHIỆM - Tổng thời gian tồn q trình thí nghiệm mẫu bệnh phẩm từ 24 đến 48 Trong thời gian trung bình cơng đoạn sau: Khử tạp mẫu Dịch 10phút Đờm 15phút Màng sinh tiết 12giờ Tách chiết DNA 4giờ PCR 2giờ Điện di 30phút Như so với phương pháp xét nghiệm truyền thống, thời gian chờ đợi kết giảm xuống đáng kể, thay từ 10-20 ngày 24-48 Đây ưu điểm vượt trội việc chẩn đoán phương pháp PCR 31 V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1.1 Thời gian phát vi khuẩn qua mẫu bệnh phẩm theo phương pháp PCR rút ngắn, 24h-48h so với 15 – 40 ngày theo phương pháp truyền thống 1.2 Nhóm nghiên cứu thành cơng bước đầu việc thiết kế, chứng sở khoa học hoàn thiện sản phẩm sinh phẩm chẩn đoán nhanh bệnh NTM (MAC) Bộ sinh phẩm thỏa mãn điều kiện đặt đề tài là: Chất lượng, nhanh chóng, đơn giản, an tồn thân thiện Bộ sinh phẩm kiểm chứng với mẫu chuẩn mẫu bệnh phẩm cho kết đạt độ nhạy độ đặc hiệu 100% tương đương kỹ thuật nuôi cấy định danh vi khuẩn truyền thống quy mơ phịng thí nghiệm 1.3 1.4 KIẾN NGHỊ 2.1 Trong khn khổ đề tài, nhóm nghiên cứu nỗ lực làm việc đạt kết khả quan ban đầu 2.2 Trong tương lai, tiếp tục thực hiện, nhóm muốn hồn thiện triển khai sản phẩm với phổ chẩn đoán rộng từ – chủng NTM gây bệnh phổ biến lần xét nghiệm thay 2.3 Nâng cấp kỹ thuật chẩn đoán PCR định lượng thay định tính 2.4 Đưa thêm vào sinh phẩm tiêu chuẩn kiểm chuẩn kiểm chứng dương âm tính giả nhằm nâng cao hiệu suất độ xác chẩn đoán 2.5 Đăng ký thử nghiệm sản phẩm sở y tế nhằm xác định xác độ nhạy độ đặc hiệu sản phẩm TÀI LIỆU THAM KHẢO Libanore, M., Bicocchi, R., Ghinelli, F., 1992 Mixed bronchial infection due to Mycobacterium tuberculosis 32 and Mycobacterium avium- intracellulare in an AIDS patient Infection 20, 298– 299 Huang CC, Chen JH, Hu ST, Chiou CS, Huang WC, Hsu JY, Lu JJ, and Shen GH, 2012 Combined rpoB duplex PCR and hsp65 PCR restriction fragment length polymorphism with capillary electrophoresis as an effective algorithm for identification of Mycobacterial species from clinical isolates BMC Microbiology 12,137 Falkinham JO III, 2011 Nontuberculous mycobacteria from household plumbing of patients with nontuberculous mycobacteria disease Emerg Infect Dis 17:419–24 Saini V, Raghuvanshi S, Talwar GP, Ahmed N, Khurana JP, Hasnain SE, Tyagi AK, Tyagi AK (2009) Polyphasic taxonomic analysis establishes Mycobacterium indicus pranii as a distinct species PLoS One 16;4(7) Kim BJ, Hong SK, Lee KH, Yun YJ, Kim EC, Park YG, Bai GH, Kook YH (2004) Differential identification of Mycobacterium tuberculosis complex and nontuberculous mycobacteria by duplex PCR assay using the RNA polymerase gene (rpoB) J Clin Microbiol 42(3):1308-12 September S M.,V S Broăzel, and S N Venter (2004) Diversity of Nontuberculoid Mycobacterium Species in Biofilms of Urban and Semiurban Drinking Water Distribution Systems Applied and environmental microbiology, 7571–7573 Vol 70, No 12 Lopez-Alvarez R; Claudia Badillo-Lopez; Jorge F Cerna-Cortes; Ivan Castillo-Ramirez; Sandra Rivera-Gutierrez; Addy C Helguera- Repetto; Diana Aguilar; Rogelio Hernandez-Pando; Sofia Samper; Jorge A Gonzalez-y-Merchand (2010) First insights into the genetic diversity of Mycobacterium tuberculosis isolates from HIV-infected Mexican patients and mutations causing multidrug resistance BMC Microbiology, 10:82 Thomson R, Carter R, Tolson C, Coulter C, Huygens F and Hargreaves M (2013) Factors associated with 33 the isolation of Nontuberculous mycobacteria (NTM) from a large municipal water system in Brisbane, Australia BMC Microbiology, 13:89 Turenne TC Y.,V J Cook,T V Burdz,1 R J Pauls,3 L Thibert, J N Wolfe1 and A Kabani (2004) Mycobacterium parascrofulaceum sp nov., novel slowly growing, scotochromogenic clinical isolates related to Mycobacterium simiae International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54, 1543–1551 10.Turenne TC, Tschetter L, Wolfe J, Kabani A (2001) Necessity of quality controlled 16S rRNA gene sequence databases identifying nontuberculous mycobacterium species J Clin Microbiol, 39: 3637–3648 11 Chimara E1, Ferrazoli L, Ueky SY, Martins MC, Durham AM, Arbeit RD, Leão SC (2008) Reliable identification of mycobacterial species by PCR-restriction enzyme analysis (PRA)-hsp65 in a reference laboratory and elaboration of a sequence-based extended algorithm of PRA-hsp65 patterns BMC Microbiol 20;8:48 12.Biosafety laboratory manual 3rd edition – WHO – GENEVA 2004 13.Polly E Parsons MD, John E Heffner MD; Pulmonary/respiration thepary 3rd editon; Copyright © 2006 by Elsevier Inc All rights reserved PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: DANH MỤC CÁC TÊN VIẾT TẮT ĐƯỢC SỬ DỤNG VÀ CÁC THUẬT NGỮ -MTB: Mycobacterium tuberculosis -NTM: Non-tuberculosis mycobacterium -MAC: Mycobacterium avium complex -PCR: Polymerase Chain Reaction-Phản ứng khuếch đại chuỗi -DNA: Deoxyribonucleic acid -For: Mồi xuôi 34 -Rev: Mồi ngược - IFN-γ: Interferon-gamma -Real time PCR: PCR định lượng -Multiplex PCR: PCR đa mồi -Sequencing: giải trình tự nucleotide -ATSH: An toàn sinh học -NCBI: National Center for Biotechnology Information (Trung tâm thông tin Công nghệ sinh học quốc gia-Hoa Kì) PHỤ LỤC 2: MỘT SỐ HÌNH ẢNH VỀ QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU 35 (a) (b) Chủng gốc trạng thái khô, lạnh nhập trước (b) sau (a) lấy khỏi bao bì Ống thạch nghiêng Lowenstein 36 Cấy vạch đĩa peptri Chủng gốc Avium ATCC® 25291TM (đốm trắng) ni cấy mơi trường Jansen phù hợp 37 Nhóm nghiên cứu làm việc box thí nghiệm 38 ... thống kê nêu trên, nhóm nghi? ?n cứu định tiến hành đề tài ? ?Nghi? ?n cứu phát triển sinh phẩm chẩn đoán vi khuẩn lao khơng điển hình bệnh nhân nghi mắc bệnh lao Vi? ??t Nam? ?? nhằm thiết kế sinh phẩm đơn... trình tự vi khuẩn lao (M tuberculosis); 61847 trình tự vi khuẩn lao khơng điển hình M avium (hình 1) Từ số liệu cho thấy hệ genecủa vi khuẩn lao vi khuẩn lao khơng điển hình nghi? ?n cứu sâu phổ... đại vi? ??c chẩn đoán phát sớm có mặt vi khuẩn lao khơng điển hình (NTM) mẫu bệnh phẩm bệnh nhân nghi mắc lao không đáp ứng với công thức điều trị lao thông thường, mục tiêu nghi? ?n cứu tập trungtối