Nghiên cứu cấu trúc và khảo sát hoạt tính sinh học của fucoidan và alginate từ hai loài rong nâu sargassum henslowianum và sargassum swartzii của việt nam (1)

Hoạt tính sinh học của ionic polysaccharide phụ thuộc nhiều vào trọng lượng phân tử, sự phân bố trọng lượng phân tử, cấu trúc và thành phần hóa học, Ďặc biệt phụ thuộc vào vị trí và hàm

ĐẶT VẤN ĐỀ

Polysaccharide là các polymer sinh học tìm thấy trong tự nhiên trên cả thực vật và Ďộng vật, cả trên cạn và dưới nước, trong Ďó rong biển Ďược xem là một nguồn cung cấp polysaccharide rất phong phú và Ďa dạng Trong phân tử của polysaccharide từ rong biển thường có chứa các nhóm chức như carboxyl, sulfate hoặc amino nên phân tử của chúng mang Ďiện và Ďược gọi là các ionic polysaccharide Nhiều ionic polysaccharide từ rong biển như fucoidan, alginate hay carrageenan có hoạt tính sinh học quí báu như chống ung thư, chống HIV, chống Ďông máu hay có các tính chất lý thú như khả năng tồn tại ở trạng thái gel trong môi trường nước Chính vì vậy mà chúng Ďược sử dụng nhiều trong công nghiệp dược phẩm, hóa mỹ phẩm và thực phẩm [24]

Trên thế giới có khoảng 6.000 loài rong biển Ďã Ďược xác Ďịnh và chia làm

03 ngành rong chính dựa trên sắc tố của chúng là rong lục (Chlorophytes), rong nâu (Pheophytes) và rong Ďỏ (Rhodophytes) Bên cạnh khả năng cung cấp các hợp chất

có hoạt tính sinh học quý báu như các polymer sinh học (fucoidan, laminaran, alginate), rong biển còn cung cấp các chất chuyển hóa thứ cấp như alkaloid, phlorotannin, acetogenin và terpene [19]

Hoạt tính sinh học của ionic polysaccharide phụ thuộc nhiều vào trọng lượng phân tử, sự phân bố trọng lượng phân tử, cấu trúc và thành phần hóa học, Ďặc biệt phụ thuộc vào vị trí và hàm lượng của các nhóm chức trong phân tử của chúng [45] Các ionic polysaccharide có khả năng tạo thành các dạng cấu trúc khác nhau Từ một monosaccharide có thể tạo nên nhiều loại polysaccharide bởi các kiểu liên kết glycoside khác nhau dẫn tới tính chất của các polysaccharide khác nhau và tạo nhiều hoạt tính sinh học, ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau Ví dụ, cellulose và

amylose là 2 loại polysaccharide Ďều tạo thành từ D-glucose, nhưng kiểu liên kết

của chúng khác nhau nên dẫn tới tính chất của chúng khác nhau, cellulose không tan trong nước, nhưng amylose lại tan tốt trong nước Curdlan có cấu trúc không gian là chuỗi xoắn 3, không có hoạt tính sinh học, nhưng khi bị sulfate hóa thành curdlan sulfate lại có hoạt tính chống HIV và cấu trúc không gian của nó là dạng sợi [141] Như vậy, cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian Ďều ảnh hưởng Ďến tính chất và hoạt tính sinh học của polysaccharide [92]

Hoạt tính sinh học của polysaccharide còn phụ thuộc vào nguồn gốc Ďịa lý của rong biển Cùng một loại rong biển nhưng thu thập ở các vị trí Ďịa lý khác nhau sẽ cho các polysaccharide có các tính chất và hoạt tính sinh học khác nhau [113]

So với các nước vùng Đông Nam Á, Việt Nam với tổng chiều dài bờ biển hơn 3.600km làm ranh giới phía tây của biển Đông có diện tích trên 3,5 triệu km2, là một trong những biển quan trọng của thế giới, có nguồn rong biển Ďa dạng và phong

phú, có khả năng cung cấp các ionic polysaccharide với nhiều hoạt tính sinh học Ďáng quan tâm [24]

Trong các năm gần Ďây, các nghiên cứu khoa học công nghệ theo hướng Hoá sinh biển, nhằm quản lý, khai thác một cách hiệu quả tài nguyên biển ở nước ta Ďang là vấn Ďề Ďược nhà nước Ďặc biệt quan tâm và khuyến khích Việc nghiên cứu qui trình chiết tách, xác Ďịnh cấu trúc và hoạt tính của polysaccharide nói chung và các ionic polysaccharide nói riêng từ các loài rong thu thập ở biển Việt Nam có ý nghĩa khoa học và thực tiễn to lớn, từ Ďó Ďịnh hướng và nâng cao hiệu quả khai thác, nuôi trồng rong biển, chủ Ďộng thu hoạch nguồn nguyên liệu, tạo ra sản phẩm

có giá trị cao từ nguồn nguyên liệu rong phong phú ở ven biển nước ta

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về polysaccharide từ rong biển Ďã Ďược một số nhà khoa học tiến hành [17], [21], [23] Các nghiên cứu này tập trung theo hướng khai thác rong, chiết tách các polysaccharide từ các rong thu Ďược, xác Ďịnh thành phần, cấu trúc hóa học và Ďánh giá hoạt tính sinh học của chúng Tuy vậy, các nghiên cứu về cấu trúc bao gồm cả cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của các ionic polysaccharide có hoạt tính sinh học chiết tách từ nguồn rong biển Việt Nam vẫn còn chưa nhiều Nhằm góp phần Ďi sâu vào việc nghiên cứu về thành phần hóa học, cấu trúc và hoạt tính sinh học của các ionic polysaccharide Ďể mở rộng khả năng ứng dụng của nguồn rong biển Việt Nam, chúng tôi chọn Ďề tài luận án là

“N u u tr v s t t t s u v t t hai r u S r ssu s w u v S r ssu sw rtz V t Nam”

Mụ t u u uậ :

1 Chiết tách, xác định cấu trúc bao gồm cả cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của fucoidan và alginate có nguồn gốc từ hai oài rong n u argassum hens owianum và argassum swartzii của i t am

2 Khảo sát hoạt tính sinh học của fucoidan ph n ập được

Với mục tiêu trên, các nội dung nghiên cứu của luận án bao gồm:

- Thu thập hai loài rong nâu Sargassum henslowianum và Sargassum swartzii ở các vùng biển của Việt Nam

- Xây dựng quy trình chiết tách fucoidan và alginate từ các loài rong này

- Xác Ďịnh thành phần hóa học của các fucoidan và alginate

- Xác Ďịnh cấu trúc bao gồm cả cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của fucoidan và alginate

- Khảo sát hoạt tính sinh học của fucoidan phân lập Ďược từ hai loài rong này

Sau năm 1954, cùng với việc Ďẩy mạnh công tác Ďiều tra nghiên cứu biển, Nhà nước Ďã quan tâm Ďến việc Ďiều tra nghiên cứu nguồn lợi từ rong biển Viện nghiên cứu Biển (nay là Viện Hải Dương học) và Viện nuôi trồng Nước lợ (nay là Viện nghiên cứu Hải sản) là những cơ quan Ďầu tiên Ďược Nhà nước giao nhiệm vụ theo hướng này Bên cạnh Ďó có những công trình Ďiều tra về nguồn lợi rong biển

Ďã Ďược công bố [2], [3]

Nguyễn Hữu Dinh [2] Ďã công bố Việt Nam có tổng số 794 loài trong Ďó 488

loài ở miền Nam và 247 loài ở miền Bắc Trong Ďó 309 loài rong Ďỏ Rhodophyta,

124 loài rong nâu Phaeophyta và 152 loài rong lục Chlorophyta

So với các nước vùng Đông Nam Á, nước ta thuộc vào nước có nguồn rong biển Ďa dạng và phong phú [5] Các khảo sát Ďiều tra cho thấy số lượng các loài rong biển tại các vùng biển như sau: Phú Quốc có 108 loài; Trường Sa 66 loài; Vịnh

Hạ Long 99 loài; Cồn Cỏ 48 loài; Bạch Long Vĩ 46 loài Riêng vùng Nha Trang có

210 loài [17] Năm 2003, tác giả Đàm Văn Tiến [23] cho biết riêng vùng ven biển Bắc Bộ Ďã có 259 loài

Với tổng số gần 800 loài rong tìm thấy ở vùng biển Việt Nam, các tác giả Việt Nam Ďều thống nhất quan Ďiểm xếp chúng vào 3 ngành trong hệ thống phân

loại 10 ngành của Gollerbakh năm 1977 [24]: rong Ďỏ (Rhodophyta); rong nâu (Phaeophyta) và rong lục (Chlorophyta)

10 ngành rong theo phân loại của Gollerbakh là:

 Ngành rong Lục (Chlorophyta)

 Ngành rong Trần (Englenophyta)

 Ngành rong Giáp (Pyrophyta)

 Ngành rong Khuê (Bacillareonphyta)

Sargassum swartzii (rong nâu)

Eucheuma denticulatum (rong đỏ) Ulva lactuca (rong xanh)

Hình 1.1 Hình nh c a một số loài rong biển ở Vi t Nam [5]

Sản lượng rong hàng năm còn phụ thuộc vào Ďiều kiện thời tiết, Ďặc biệt là các bãi rong gần cửa biển Nếu thời tiết thay Ďổi, mưa nhiều và mưa sớm, khi rong chưa Ďạt mức tăng trưởng cao nhất, Ďộ mặn vùng biển giảm xuống rong sẽ tàn lụi nhanh chóng Tỷ lệ của các loài rong trong quần thể cũng có sự dịch chuyển trong

sự phân bố các loài một vùng từ năm này sang năm khác [4]

Rong nâu (Phaeophyta) là nhóm sinh vật Ďa bào, tự dưỡng, thuộc lớp Phaeophyceae của phân giới Chromophyta Hiện nay, trên thế giới Ďã tìm thấy

khoảng 1.500 – 2.000 loài rong nâu Chúng chứa sắc tố xanthophyll-fucoxanthin cùng với chlorophyll a và c nên cá thể của rong nâu Ďều thể hiện màu nâu lục Ďặc trưng Sắc tố màu nâu rất quan trọng giúp rong nâu thích nghi với môi trường sống trong các biển sâu và Ďại dương Rong nâu thường sống trong môi trường biển, chỉ một số ít loài sống trong nước ngọt [8]

Rong nâu là nhóm sinh vật phức tạp nhất của giới rong, có cấu tạo nhiều tế bào, dạng màng giả (pseudoparenchyma), dạng phiến, dạng sợi Ďơn giản một hàng

tế bào chia nhánh, dạng ống hoặc phân hóa phức tạp hơn thành dạng cây có gốc, rễ, thân và lá Trong chu kì sống có sự chuyển tiếp giữa giai Ďoạn cây bào tử với cây phối tử khác nhau rõ rệt về hình thái cấu tạo Thành tế bào rong nâu chứa cellulose

và acid alginic Không như rong lục, rong nâu không chứa tinh bột thực sự Trong rong chứa các loại Ďường, các alcol bậc cao và hỗn hợp các polysaccharide Các loài

rong nâu Ďược khai thác thương mại bao gồm các loài thuộc các bộ Laminarales và Fucales Trước Ďây, rong nâu Ďược sử dụng Ďể tách iod và kali Trong thời gian gần

Ďây, rong nâu Ďược khai thác rộng rãi Ďể chiết tách alginate và fucoidan Đa số rong nâu sống ở vùng biển Ďá, chúng không chỉ mọc trên Ďá mà còn trên các chân Ďập, cầu cảng, san hô, Ďộng vật thân mềm và ngay cả trên các loài rong khác [8]

Kết quả Ďiều tra Ďã chỉ ra một số nguồn lợi rong biển Ďáng kể ở Việt Nam

trong Ďó bao gồm rong mơ (Sargassum), rong câu (Gracilaria) và rong sụn (Carrageenophytes) là những nguyên liệu chính cho sản xuất polysaccharide [4]

Các loài rong này phân bố tại các thủy vực khác nhau dọc theo hơn 3.600 km bờ biển và có thể tái tạo lại bằng các phương pháp trồng và phát triển tự nhiên

Trữ lượng rong mơ mọc ở ven biển nước ta tính khoảng 30.000-35.000 tấn Qua Ďiều tra khảo sát các nhà khoa học thấy rằng ở ven biển phía Bắc, khu vực Quảng Ninh có trữ lượng rong mơ lớn nhất (12.200 tấn), còn các vùng từ vĩ tuyến

17 trở vào ven biển miền Trung thì khu vực từ Đà Nẵng tới Bình Thuận có nguồn lợi rong mơ cao hơn cả (khoảng 21.500 tấn) Các vùng có khả năng khai thác lớn nguồn lợi rong mơ ở các tỉnh phía Nam theo thứ tự là: Khánh Hòa, Bình Định, Ninh Thuận, Đà Nẵng, Quảng Ngãi, Quảng Nam và Phú Yên [4]

Trên thế giới, rong Ďỏ Ďược sử dụng với khối lượng lớn Ďể phục vụ cuộc sống con người, một số loài có hàm lượng cao về agar, carageenan, furcellaran Ďược

sử dụng Ďể chế biến keo rong biển

Các loài rong Ďỏ Ďược chia thành hai nhóm chính [8]:

- Nhóm rong cho agar (Agarophit): Bao gồm các loại như Gelidium, Gracilaria và Acanthopeltis Trong Ďó Gelidium và Gracilaria Ďược dùng nhiều

trên thế giới Ďể sản xuất agar

- Nhóm rong cho carrageenan (Carrageenophit): Bao gồm các loại như Gigartina, Eucheuma, Chondrus, Iridaea và Furcellaria

Vào năm 2005, loài Eucheuma denticulatum thuộc họ Solieriaceae có

nguồn gốc từ Philippines Ďã Ďược Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang di nhập vào Việt Nam

Rong lục có nhiều loài khác nhau như: Ulva lactuca, Ulva pertusa, Ulva rigida, U rotundata, U spinulosa, Enteromorpha intestinalis, E compressa [30]

Rong lục Ulva, loài rong phân bố rộng và mọc tự nhiên ven biển, Ďược Ďánh giá là giàu ulvan - một loại sulfate polysaccharide có nhiều hoạt tính như chống Ďông máu, chống oxy hóa, hạ mỡ máu, chống ung thư, kháng nấm…

Ulvan là sulfate polysaccharide hòa tan Ďược trong nước và tạo bởi các thành phần chủ yếu là rhamnose, glucuronic, iduronic acid, xylose và nhóm sulfate Ďể tạo thành mạch polymer sinh học với disaccharide chính là ulvanobiuronic acid 3-sulfate dạng A (-D-GlcA (1 4) -L-Rha 3S 1) và ulvanobiuronic acid 3-sulfate dạng B (-L-IdoA (1 4) -L-Rha 3S 1)Hình 1.2 [80], [83] Cấu trúc hóa học này tương tự như các glycosaminoglycans (GAGs) của Ďộng vật có vú, có hoạt tính chống Ďông máu như heparin

Hình 1.2 C u tr polysaccharide trong rong xanh chi Ulvan

Ở nước ta trong dân gian nhiều loài rong lục thuộc chi Ulva Ďược sử dụng làm rau ăn và chữa bệnh như Ulva lactuca , U fenestrata, U conglobata

Trên thế giới, chi Ulvan từ rong lục Ďã Ďược các nhà khoa học quan tâm

nghiên cứu từ những năm 1950 Thời gian Ďầu, các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc chiết tách và xác Ďịnh thành phần Ďường trong ulvan từ các loài rong lục

khác nhau Percival [97] Ďã xác Ďịnh sulfate, rhamnose, xylose và glucuronic acid là các thành phần hóa học có trong ulvan Tuy nhiên, phải Ďến năm 1997, Quemener

và cộng sự [102], nhờ vào phương pháp cắt mạch hóa học kèm enzyme, mới phát hiện ra iduronic acid (1,1-9,1%) cũng là một Ďơn vị Ďường trong ulvan

Gần Ďây, nhóm nghiên cứu của Anabela Alves [29], [30] Ďã nghiên cứu hoạt

tính chống khối u của ulvan từ Ulva lactuca và Ďã tổng quan về tình hình nghiên

cứu và các khả năng ứng dụng của chúng

1.1.2 Thành phần có trong rong biển và các ứng dụng

Hàm lượng các thành phần trong rong phụ thuộc vào sự biến Ďổi theo các loài khác nhau, nơi thu mẫu và các Ďiều kiện sống khác nhau

Theo kết quả phân tích ở các loài rong Ďã Ďược nghiên cứu, thành phần trong rong ngoài nước (80-90%), protein (khoảng 5 – 20,5% trọng lượng khô), 17 loại amino acid, trong Ďó có mặt tất cả các amino acid thiết yếu, lipid (hàm lượng trong rong tương Ďối, chiếm từ 0,2 - 0,6%), sắc tố: fucoxanthin, các sắc tố xanthophyll khác

là violaxanthin, antheraxanthin, neoxanthin, diainoxanthin và diatoxanthin (làm cho rong có mầu nâu), chất khoáng và các nguyên tố vi lượng trong rong: bao gồm các nguyên tố Ďa lượng (K, Na, Mg, S, P….) và Ďặc biệt là các nguyên tố vi lượng (Sr,

Fe, Cu, Zn, Mn, Mo…) [26] Hàm lượng iod rất cao trong rong nâu (0,05 - 0,34%) là nguồn cung cấp quí báu cho nhu cầu iod của Ďời sống Hàm lượng iod ở các loài rong nâu có thành phần cao hơn so với các loài rong Ďỏ và hàm lượng iod trong rong nâu ở vùng biển phía Bắc thấp hơn phía Nam Việt Nam Hàm lượng iod trong rong về mùa Ďông cao hơn mùa hè từ 2 - 4 lần, cao hơn trong nước biển hàng nghìn lần [1], [2]

Thành phần hóa học quan trọng của rong nâu là các glucid, chúng Ďược chia làm 2 nhóm: monosaccharide và polysaccharide

Nhóm monosaccharide gồm các Ďường Ďơn như: mannitol, fucose, galactose, mannose, xylose…Trong Ďó quan trọng nhất là mannitol, hàm lượng của nó trong một số loại rong mơ nằm trong khoảng 19 - 44% khối lượng rong khô [26]

Mannitol thuộc nhóm Ďường kép của rong nâu, Ďược phát hiện Ďầu tiên vào năm 1884 và nghiên cứu sâu hơn vào năm 1913

Mannitol cũng là một thành phần Ďáng chú ý trong rong mơ Ở trong rong Việt Nam hàm lượng này nằm trong khoảng 3,20 - 17,68% (trọng lượng rong khô)

Trong Ďó rong Sargassum mcclurei có hàm lượng cao nhất (7,66 - 17,68%) Cũng

như các hợp chất khác trong rong, mannitol tích lũy trong rong thay Ďổi theo mùa và nơi sống Các kết quả nghiên cứu cho thấy rong ở vùng biển phía Nam có hàm lượng mannitol cao hơn ở phía Bắc [17] Hàm lượng này thường cao vào các tháng mùa hè và có xu hướng tăng dần theo thời gian sinh trưởng của rong Một số tác giả cũng Ďã nghiên cứu và Ďề xuất quy trình chiết tách mannitol ở quy mô phòng thí nghiệm dựa trên nguyên tắc: làm lạnh dung dịch mannitol sau khi Ďã Ďược chiết bằng cồn nóng Ďể thu các tinh thể mannitol [17]

Mannitol Ďược sử dụng nhiều trong dược phẩm, trong công nghiệp Ďể làm nguyên liệu tổng hợp một số chất hữu cơ, làm thuốc nổ, diêm và trong công nghiệp thực phẩm Ďặc biệt là trong công nghiệp bánh kẹo Ďể sản xuất các loại bánh gato có

Ďộ ngọt cao nhưng Ďảm bảo Ďộ mềm và xốp của bánh

Nhóm polysaccharide gồm có: agar, alginate, fucoidan, laminaran và carrageenan

Agar và alginate Ďược sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm: Ďược

sử dụng làm chất ổn Ďịnh trong bánh kẹo, kem, nước ngọt…hay làm chất làm Ďông Ďặc và tạo gel trong sản xuất thịt Ďông lạnh; trong công nghệ sinh học: môi trường nuôi cấy; trong y học: làm vải băng bó vết thương truyền thống, lấy dấu răng, pha thuốc, pha huyết thanh, trong một số công thức chống chảy máu dạ dày, trong việc cấy ghép tế bào, tác Ďộng vào các tế bào sản xuất insulin Ďể Ďiều trị bệnh tiểu Ďường Typ I, tơ Ďược tạo từ alginate dùng Ďể khâu vết thương Vỏ nang bằng alginate không bị dịch tiêu hóa phân hủy và chỉ tan trong ruột Màng Ďược tạo thành từ alginate và gelatin kết hợp với một số chất như tinh dầu tràm, rau má, nghệ, dầu mù

u có tác dụng trong Ďiều trị vết thương như vết bỏng, làm giảm sự nhiễm khuẩn, viêm làm nhanh lành vết thương; trong công nghiệp giấy: alginate Ďược trộn lẫn với bột giấy rồi xử lý, sẽ cho bề mặt giấy nhẵn, mịn không xù xì; trong công nghiệp dệt

và tơ nhân tạo: alginate cho nhũ tương mịn và bền nên Ďược dùng trong kỹ nghệ sơn, xà phòng, cao su, phim ảnh, vải lợp nhuộm vecni và sơn Ďể tăng Ďộ bền của màu Màu vẽ có alginate dễ tan Ďều trong nước [6], [13]

Laminaran Ďóng vai trò như chất dự trữ trong rong nâu Laminaran không tạo

thành tế bào nhưng nó dự trữ 1 lượng lớn β-glucans Laminaran là chất tạo hệ miễn

dịch ở Ďộng vật có vú, laminaran sunfate hóa Ďã Ďược chứng minh là có Ďặc tính giống heparin

Laminaran Ďược hòa tan, nhưng mức Ďộ hòa tan phụ thuộc vào mức Ďộ phân nhánh, Ďộ phân nhánh càng cao thì mức Ďộ hòa tan càng cao, do Ďó nếu Ďộ phân nhánh nhỏ thì chỉ có thể hòa tan trong nước ấm (60-800C), chúng có hoạt tính kháng Ďông tụ máu và ung thư [84]

Fucoidan là hợp chất Ďược Ďặc biệt quan tâm nghiên cứu nhờ các tính chất sinh học Ďa dạng và Ďặc thù của nó như khả năng tăng cường miễn dịch, kháng Ďông

tụ máu, chống viêm nhiễm, kháng virus, Ďiều trị rối loạn Ďường huyết và hỗ trợ trong Ďiều trị ung thư [16], [25]

Do Ďặc tính tạo gel quý báu, carrageenan Ďược sử dụng ngày càng rộng rãi trong các ngành công nghiệp, phổ biến là công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và hóa mỹ phẩm Chúng có những tính chất quý báu mà không loại keo nào có thể thay thế Ďược Cùng với agar, carrageenan là sản phẩm từ rong biển Ďược sử dụng rộng rãi nhất trên thế giới hiện nay

Trong lĩnh vực thực phẩm, carrageenan Ďược xếp vào danh sách các chất an toàn và Ďược sử dụng rộng rãi Ďể tạo gel, là chất ổn Ďịnh, làm Ďặc và làm tăng Ďộ nhớt của dung dịch… Bên cạnh Ďó, carrageenan còn có ưu Ďiểm là tăng khẩu vị và cảm quan cho thực phẩm Nhờ vào khả năng tạo gel ở nồng Ďộ tương Ďối thấp nên carrageenan Ďược biết Ďến là tác nhân làm Ďông rất có giá trị, Ďặc biệt là khi kết hợp với các sản phẩm từ sữa như socola sữa, thức ăn cho trẻ em, kẹo sữa, kem, bánh…

Các nhà khoa học Ďã khám phá ra rằng carrageenan ở nồng Ďộ vô cùng loãng hoạt Ďộng như một chất chống Ďông máu Trong các loại carrageenan thì -carrageenan là tác nhân chống Ďông máu tốt nhất ở nồng Ďộ thấp [59] Nhiều tác giả

cho thấy khả năng chống các loài virus của carrageenan: iota-carrageenan có hoạt

tính chống virus HSV-1; -carrageenan ức chế hoạt tính enzyme phiên mã ngược

của virus HIV, ức chế Ďối với nhiều loài virus có vỏ bọc; sulfate oligosaccharide từ

-carrageenan thể hiện rõ hoạt tính chống u bướu Ďối với một số dạng ung thư Ở Pháp và Anh, carrageenan Ďược sử dụng Ďể chữa chứng loét dạ dày [123].

Trong lĩnh vực hóa mỹ phẩm, carrageenan là thành phần quan trọng Ďược sử dụng trong kem Ďánh răng, kem dưỡng da, kem dưỡng tóc,… Trong dược phẩm, carrageenan chiết cùng với KCl Ďược dùng làm vỏ bọc của thuốc [122]

Carrageenan còn Ďược sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác Trong công nghiệp dệt: chất tạo hồ làm cứng vải, là vật liệu liên kết, là chất “cắn màu” cho việc nhuộm,

in hoa trên vải Carrageenan còn Ďược dùng làm chất liên kết trong Ďá kháng sinh Ďể bảo quản cá

1.1.3 Tình hình khai thác và sử dụng rong biển

Rong biển Ďã Ďược sử dụng làm thức ăn từ thế kỷ thứ 14 ở Nhật Bản, thế kỷ thứ 16 ở Trung Quốc và gần Ďây nữa là ở Hàn Quốc Trên thế giới hàng năm thu chừng 6,1 triệu tấn rong tươi, trong Ďó 4 triệu tấn phục vụ làm thực phẩm Trung Quốc là nước sản xuất rong biển có thể ăn Ďược lớn nhất thế giới, sản lượng hàng

năm Ďạt cỡ 4,5 triệu tấn rong tươi Laminaria japonica (kombu) Hàn Quốc trồng cỡ 800.000 tấn tươi Undaria pinnatifida (Wakame) Sản lượng của Nhật Bản là cỡ

600.000 tấn tươi (Porphyra, kombu, Wakame) Phillipine: 268.000, Indonexia: 73.000, Chile: 13.000, Nam Phi: 12.000 tấn [24]

Trong các loài rong biển Việt Nam, hiện nay các loài rong mơ và rong câu là hai nhóm rong tự nhiên có ý nghĩa kinh tế lớn nhất, Ďang Ďược khai thác, sử dụng Sản lượng khai thác rong tự nhiên hàng năm khoảng 6.000 - 7.000 tấn tươi, phần lớn là rong câu chỉ vàng (chiếm 90 - 95%) Sản lượng rong câu nuôi trồng hàng năm khoảng 50.000 – 60.000 tấn Hàng năm Ďã bán ra nước ngoài 85 - 90% nguyên liệu rong câu ở dạng chưa tinh chế, chủ yếu qua Nhật Bản Hiện nay, một số loài rong

câu và rong Ďỏ Agarophyta mọc ở bãi triều bỏ phí, hầu như chưa Ďược khai thác như rong câu thừng (Gracilaria lemaneiformis); rong nâu dòn (Gracilaria bursapastoris) hay rong gai (Acanthophora spicifera) [17]

Cho Ďến nay Ďã phát hiện Ďược hơn 60 loài rong mơ phân bổ phổ biến và rộng khắp ven biển và các Ďảo với sản lượng khai thác ước tính Ďạt khoảng 10.000 tấn tươi/năm Mức Ďộ khai thác hàng năm chỉ Ďạt khoảng 2 - 5% trữ lượng tự nhiên,

năm nào khai thác nhiều nhất là 25 - 30% Lượng thu hoạch dùng chủ yếu trong phân bón trong nông nghiệp, một số ít dùng làm thức uống giống như chè [4]

Alginate và fucoidan Ďược sản xuất từ rong nâu Hàng năm trên thế giới thu

hoạch Ďược cỡ 126.500 tấn rong nâu khô Trong Ďó, sản lượng Ascophyllum là cỡ 20.000 tấn khô Ďến từ Ireland, Na Uy, Pháp; sản lượng Durvillaea là 4.500 tấn khô Ďến từ Australia và Chile; Ecklonia là 500 tấn khô Ďến từ Nam Phi; Laminaria là 30.500 tấn khô từ Châu Mỹ; Macrocystis là 35.000 tấn khô Ďến từ USA, Mexico và Chile: Sargassum và Turbinaria là 10.000 tấn khô Ďến từ Ấn Độ, Indonexia,

Philipine và Việt Nam [21]

Alginate Ďược sản xuất chủ yếu bằng cách chiết chúng từ rong nâu khai thác

tự nhiên Trị giá thu Ďược từ alginate hàng năm có giá trị khoảng 213 triệu USD [21] Nguồn cung cấp nguyên liệu alginate cho những ứng dụng công nghiệp hiện nay vẫn là khai thác từ nguồn rong nâu tự nhiên Các loài rong nâu chủ yếu Ďể sản

xuất alginate là: Laminaria hyperborea, Laminaria digitata, Laminaria japonica, Maccrocystis pyrifra, Ascophyllum nosodum, Ecklonia, Lessonia negrescens và các loài thuộc chi rong mơ Sargassum Trung Quốc là quốc gia thành công nhất trong việc trồng rong Laminaria japonica với sản lượng lên Ďến hàng triệu tấn

tươi/năm [21]

Carrageenan Ďược chiết xuất từ các loài rong carrageenophytes Hàng năm

trên thế giới thu hoạch Ďược cỡ 120.000 tấn rong Kappaphycus alvarezii khô chủ

yếu là từ Philipine, Indonesia, Tanzania (Zanzibar) Cũng từ các nước trên, sản

lượng thu hoạch rong Eucheuma denticulatum là 30.000 tấn khô/năm, rong Betaphycus gelatinum khoảng 300 tấn khô/năm Ďược thu hoạch ở Ďảo Hải Nam-

Trung Quốc Carrageenan chủ yếu Ďược sử dụng làm chất ổn Ďịnh, chất tạo nhũ hoặc chất tạo kết cấu cho nhiều ứng dụng trong nông nghiệp và công nghiệp [8]

Việc sản xuất carrageenan ban Ďầu phụ thuộc vào rong tự nhiên Tuy nhiên

kể từ Ďầu những năm 70 của thế kỷ XX, công nghiệp sản xuất carrageenan Ďã mở rộng rất nhanh do có những loài rong chứa carrageenan khác mà Ďã Ďược trồng thành công ở các nước có vùng biển nước ấm với giá nhân công thấp [8]

Trong những năm gần Ďây một số dự án lớn tập trung nghiên cứu khả năng

sử dụng rong biển như một nguồn nhiên liệu gián tiếp Ngoài ra, do khả năng ứng dụng hết sức rộng lớn nhờ Ďặc Ďiểm cấu trúc và tính chất Ďặc thù của chúng, một số nhà khoa học trên thế giới Ďã nghiên cứu tổng hợp thử các polysaccharide giống keo rong biển Tuy nhiên, cho Ďến nay chưa có một sản phẩm nào tổng hợp ra có Ďược tính chất keo cũng như Ďộ nhớt tương tự các keo rong biển tự nhiên

Các loài rong Ďỏ và nâu khác Ďược sử dụng Ďể sản xuất ba loại keo (hydrocolloids): agar, alginate và carrageenan Hydrocolloids là chất không kết tinh với phân tử rất lớn và khi hòa tan trong nước cho ra một dung dịch quánh Ďặc (viscous)

Thực tiễn cho thấy rong biển còn có tiềm năng sử dụng trong xử lý nước thải Một số loài rong biển có khả năng hấp thụ các ion kim loại nặng như: Zn và

Cd từ nước bị ô nhiễm [8] Do khả năng hấp thụ cao mà một số vi lượng có trong rong khá cao nên rong còn Ďược dùng làm thức ăn bổ sung Ďể phòng bệnh thiếu một

số chất như sắt, iod….[24]

Từ rong biển, sản xuất ra rất nhiều loại sản phẩm mà tổng giá trị hàng năm Ďược ước tính Ďạt cỡ 5,5-6,0 tỷ USD [24] Trong Ďó các polysaccharide Ďóng góp phần lớn giá trị của rong Trong số này chỉ khoảng 10% là thu hoạch từ nguồn rong

tự nhiên còn hơn 90% là nhờ canh tác Việc trồng rong Ďã Ďược mở rộng rất nhanh

do nhu cầu Ďã vượt quá khả năng cung cấp từ nguồn lợi tự nhiên Các sản phẩm mỹ phẩm, như kem bôi da, nước hoa (mỹ phẩm lỏng) mà trong nhãn của nó có chứa các cụm từ “marine extract”, “extract of laga”, “seaweed extract” hoặc tương tự, thường

có nghĩa là nó chứa một trong số các hydrocolloids Ďược chiết từ rong biển [62]

1.2 Các Ionic polysaccharide có trong rong biển

1.2.1 Fucoidan

Năm 1913, Kylin tìm ra một loại fucoidan Ďầu tiên, sau Ďó cấu trúc của nhiều loại fucoidan của nhiều loại rong nâu Ďược tìm ra [82], [94]

Theo IUPAC, fucan sulfate hóa là một polysaccharide có nền chính là

L-fucose sulfate hóa với các Ďường Ďơn khác nhỏ hơn 10% Fucan sulfate hóa của

rong nâu thường Ďược gọi là fucoidan [54] Cấu trúc của fucoidan trong rong biển là

vô cùng phức tạp và không giống nhau với những thay Ďổi trong liên kết, sự phân nhánh, vị trí nhóm sulfate và các loại Ďường Ďơn khác nhau trong polysaccharide [73], [99] Cấu trúc của fucoidan còn phụ thuộc vào nguồn gốc của chúng Vì vậy, cho tới nay, việc làm sáng tỏ cấu trúc của chúng vẫn còn là vấn Ďề khó khăn, ngay

cả khi sử dụng các kỹ thuật NMR phân giải cao mới nhất [78], [90]

1.2.1.1 T p ầ v u tr ó

Trong rong nâu, fucoidan chiếm hàm lượng khoảng 0,6 - 4% trọng lượng khô

và cấu trúc của nó thay Ďổi theo loài nhưng thành phần chính vẫn là fucose và sulfate [15]

Fucoidan là một polysarccharide sulfate hóa, có cấu tạo chủ yếu từ fucose sulfate, ngoài ra còn có các tỷ lệ khác nhau của các Ďường Ďơn khác là D- galactose, D-mannose, D-xylose, acid uronic và sulfate Nhóm sulfate tham gia

α-L-trong cấu trúc của fucoidan gắn vào vị trí C-4 (tới 30% trong mắt xích fucose) (Hình 1.3) [48]

Hình 1.3 C u tr ó ột u đượ ết t t Fucus

vesiculosus

Conchie và Percival [48] Ďã chiết fucoidan bằng nước sôi trong 24 giờ, xác

Ďịnh Ďược trong dịch thủy phân từ Fucus vesiculosus, Fucus spiralis, Himanthalia lorea và Laminaria cloustoni ngoài fucose còn có acid uronic, galactose, xylose, với

tổng sulfate 32,4% Lần Ďầu tiên Ďã xác Ďịnh Ďược cấu trúc của một phân Ďoạn fucoidan, Ďó là fucan polysulfate, với liên kết 1→2 glycoside và sulfate ở vị trí C-4 Cấu trúc này Ďược khẳng Ďịnh lại một lần nữa bởi O' Neill [94]

Gần Ďây một số dạng cấu trúc khác của fucoidan Ďã Ďược công bố Năm 2001,

Marais và các cộng sự [87] Ďã tìm ra cấu trúc fucoidan từ rong nâu Ascophyllum nodosum có công thức với mạch fucan có liên kết 1→3, 1→4, nhánh 1→2 và nhóm

sulfate ở vị trí C-2, C-3 Trong khi Ďó vào năm 2007, Roogis Daniel và cộng sự [56] tìm Ďược cấu trúc fucoidan của loài rong này với nhóm sulfate chỉ ở vị trí C-2

Việc phân tích cấu trúc của các polysaccharide nói chung và fucoidan nói riêng là một trong những thách thức lớn trong hóa học các chất hữu cơ có gốc Ďường Các fucoidan có cấu trúc phức tạp bao gồm nhiều vấn Ďề cần làm sáng tỏ như thành phần các Ďường Ďơn, các dạng Ďồng phân của Ďường, mức Ďộ phân nhánh

và polymer hóa của chúng Hiện nay việc sử dụng phương pháp phổ khối ion hóa bụi electron (ESI-MS) Ďang Ďược nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm, ứng dụng trong nghiên cứu cấu trúc fucoidan [31], [34]

Bằng phương pháp sắc ký, phổ IR và NMR Ďã cho các thông tin về thành phần Ďường, kiểu liên kết của các Ďường trong phân tử fucoidan, nhưng các thông tin về trật từ sắp xếp của các Ďường cũng như vị trí của nhóm sulfate trong phân tử vẫn chưa Ďược xác Ďịnh, do Ďó chưa giải thích Ďược các Ďặc tính sinh học khác nhau của các phân Ďoạn fucoidan một cách rõ ràng và thuyết phục [33]

1.2.1.2 H t t s v ụ

Fucoidan có hoạt tính sinh học rất phong phú, nhiều hoạt tính sinh học quí báu như hoạt tính chống khối u, hoạt tính chống oxy hóa, hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, chống Ďông tụ máu và hoạt tính chống lại các virus như HIV [25], [37] Ngoài ra, fucoidan còn Ďược mô tả có nhiều tác dụng sinh học lý thú khác như tác dụng hạ cholesterol, giảm mỡ máu, giảm LDL-cholesterol, triglyceride máu, tăng HDL-cholesterol, ức chế miễn dịch nên có thể sử dụng fucoidan trong các trường hợp ghép phủ tạng … [28], [32], [75], [89]

Thực tế cho thấy, các thành phần của fucoidan rất tốt cho cơ thể Qua nghiên cứu, tiến sĩ Kyosuke OWA, nhà nghiên cứu khoa học Nhật Bản, Ďã so sánh fucoidan giống như sữa mẹ trong vai trò làm tăng sức Ďề kháng Kyosuke OWA giải thích rằng fucoidan kích thích quá trình sản xuất các tế bào miễn dịch, cung cấp cho

cơ thể sức Ďề kháng cao Ďể chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn, virus, nấm, ký sinh trùng và thậm chí là ức chế sự phát triển của tế bào ung thư [85]

Fucoidan khối lượng phân tử thấp thu Ďược từ Ascophyllum nodosum bằng thủy phân acid có cấu trúc là →3)-α-L-Fuc(2SO3)-(1→4)-α-L-Fuc(2,3 di SO3-)-1]n

và toàn bộ khối lượng là 3.090 Da, có hoạt tính chống Ďông tụ máu, Ďiều này chỉ ra rằng cấu trúc nhánh không ảnh hưởng tới hoạt tính chống Ďông tụ máu, mức Ďộ sulfate hóa của fucoidan khối lượng phân tử thấp là 3 sulfate/2 disaccharide, Ďiều này gần giống với thành phần chính của heparin [56]

Một số nghiên cứu cho rằng thành phần Ďường (fucose, galactose, ) có thể liên quan tới hoạt tính chống Ďông tụ máu Tuy nhiên khi Ďi sâu vào nghiên cứu, các nhà khoa học thấy rằng, không phải Ďường mà là nhóm sulfate trên phân tử Ďường

mới tạo ra hoạt tính chống Ďông tụ máu Kết quả nghiên cứu của Pereira và cộng sự

[98] chỉ ra rằng liên kết 3-α-L-galactan, chứ không phải α-L-fucan, có khả năng

kiềm chế thrombin

Acid uronic không cần thiết cho hoạt tính chống Ďông tụ máu, nhưng nó có thể làm tăng khả năng chống Ďông tụ máu thông qua việc cải thiện Ďộ linh hoạt của chuỗi Ďường [49]

* H t t vi s vật ể đị

Năm 1995, các nhà khoa học Rumani [107] Ďã công bố rằng fucoidan có khả

năng ức chế Ďáng kể sự phát triển của các vi khuẩn Gram dương (Gr(+)) và vi khuẩn Gram âm (Gr(-)), trong khi Ďó lại kích thích hệ thống miễn dịch bằng cách tăng cường thực bào Với liều 6,2mg/ml fucoidan từ Laminaria saccharina có thể

ức chế các vi sinh vật kiểm Ďịnh S abony, E faecalis, P aeruginosa và L monocytogenes với mức Ďộ tương ứng là 98,16; 97,07; 93,66 và 93,49% Ngoài ra,

nghiên cứu sâu hơn Ďã phát hiện fucoidan có khả năng ngăn chặn một số loại viêm nguy hiểm xuất hiện trong màng não, một biến chứng nguy hiểm của viêm do virus

và vi khuẩn Phát hiện này cùng những nghiên cứu khác Ďã chỉ ra rằng fucoidan làm Ďược những việc mà ít thuốc nào có thể làm, Ďó là diệt vi khuẩn trong khi Ďó lại tăng cường hệ miễn dịch [88]

* H t t v rus

Những năm gần Ďây, nhiều nghiên cứu Ďã chỉ ra rằng các sulfate

polysaccharides có hoạt tính kháng virus cả in vivo lẫn in vitro [71]

Khả năng của fucoidan chống lại các virus như HIV có lẽ là còn hấp dẫn hơn khả năng kháng khuẩn của nó Các phân mảnh galactofucan (chứa 21-24% sulfate

và 4-7% uronic axit) từ Adenocytis utricularis, Stoechospermum marginatum, Cystoseira indica và Undaria pinnatifida có khả năng chống lại virus HSV-1 và

HSV-2 (IC50 từ 0,28-0,87 và 0,52-1,36 μg/ml tương ứng với HSV-1 và HSV-2) [64], [101]

Fucoidan làm tăng khả năng sản xuất các dạng interleukin và interferon Ďược tiết ra nhờ các tế bào miễn dịch giống tế bào T Nói cách khác, fucoidan tăng cường việc sản xuất interleukins và interferons, kích hoạt các tế bào miễn dịch khác nhau

(T cells, NK cells và macrophage-Ďại thực bào) cần thiết Ďể phòng nhiễm khuẩn và bệnh tật Các nhà khoa học [142] tin rằng fucoidan có thể cung cấp liệu pháp Ďiều trị rất hiệu quả chống lại các virus gây ra viêm gan, mệt mãn tính và ngay cả AIDS

Fucoidan còn thể hiện khả năng liên kết với các virus Ďể cản trở khả năng tấn công vào tế bào chủ của chúng Nếu một virus không thể tấn công vào tế bào chủ, nó sẽ không thể sao chép [96]

Nhóm sulfate là rất cần thiết cho hoạt tính kháng virus Nhóm sulfate tại vị trí C-4 của liên kết (1→3) fucopyranosyl Ďóng vai trò rất quan trọng cho khả năng kháng virus viêm gan của fucoidan [115]

Cho tới nay vẫn chưa nhận thấy có mối tương quan giữa hoạt tính kháng virus và chống Ďông tụ máu Một vài fucoidan có hoạt tính kháng virus nhưng lại không có hoạt tính chống Ďông tụ máu, trong khi Ďó một số loại fucoidan có cả 2 loại hoạt tính này [17]

* Ho t tính chống khố u v đ ều hòa miễn dịch

Rất nhiều fucoidan có hoạt tính chống khối u và Ďiều hòa miễn dịch [116],

[139] Fucoidan chiết xuất từ Laminaria japonica ức chế sự gia tăng tế bào ung thư

và gây ra quá trình giáng hóa tế bào ung thư với IC50 từ 0,013 to 0,047 mg/ml [114]

Fucoidan thúc Ďẩy tăng cường integrinα2β1 biểu hiện trên bề mặt nguyên bào sợi và

do Ďó có thể Ďẩy nhanh quá trình chữa lành vết thương [143]

Fucoidan tìm thấy trong rong nâu làm tăng Ďáng kế việc sản xuất một chất Ďược gọi IT-IGF hoặc HGF [61] Phòng thí nghiệm nghiên cứu Công nghệ sinh học ở Nhật,

Ďã nghiên cứu cấu tạo xơ của một vài loại rong, trong khi tiến hành các nghiên cứu này

họ Ďã phát hiện ra rằng F-fucoidan tìm thấy trong nhiều loài rong nâu có thể làm tăng Ďáng kể việc sản xuất HGF HGF là một cytokine rất Ďặc biệt, nó là một protein làm chậm quá trình lão hóa, không chỉ kích thích việc tái tạo các tế bào gan mà Ďồng thời còn tăng cường việc sản xuất các tế bào da, tế bào cơ tim, sụn Các nghiên cứu cho thấy HGF thực hiện một tổ hợp rộng các chức năng sinh hóa và Ďược coi là quan trọng Ďể tạo thành sẹo và phục hồi các mô cơ thể HGF có thể ngăn chặn viêm gan, Ďiều trị xơ gan, liệt gan, xơ hóa phổi và làm chậm quá trình già hóa

Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy, fucoidan có tác dụng thúc Ďẩy các tế bào ung thư tự chết theo chương trình (apoptosis) và tiêu diệt các khối u Ďại thực bào

Một số fucoidan, Ďặc biệt là fucoidan từ loài rong Fucus vesiculosus có thể ức chế

hình thành mạch máu mới bằng cách gắn các yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu

và yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi cơ bản với các thụ thể tương ứng của nó [61]

* Ho t tính làm s ch gốc tự do và chống oxi hóa

Tất cả các dẫn xuất fucoidan Ďều cho thấy có hoạt tính làm sạch gốc tự do và mạnh hơn fucoidan Nghiên cứu cho thấy phosphate hóa, sulfate hóa glucan cho thấy hoạt tính oxy hóa mạnh hơn, Ďiều này chỉ ra rằng các nhóm mang Ďiện giống như là glucan sulfate hay phosphate có thể làm tăng hoạt tính làm sạch gốc tự do [138] Qua nghiên cứu cho thấy, khả năng làm sạch gốc tự do giảm lần lượt theo thứ tự: fucoidan Ďược acetyl hóa > fucoidan Ďược sulfate hóa toàn phần > fucoidan benzoyl hóa [135]

Rất nhiều nghiên cứu Ďã chỉ ra rằng fucoidan có khả năng chống oxi hóa trên

in vitro [51], [137]

Khả năng chống oxy hóa liên quan Ďến khối lượng phân tử và thành phần

sulfate của fucoidan Fucoidan từ Laminaria japonica có khả năng phân hủy gốc

superoxide và acid hypochloride, ngoại trừ mảnh có lượng sulfate hóa cao [136]

Cả khối lượng phân tử và thành phần sulfate của fucoidan Ďều có vai trò quan trọng trong việc ảnh hưởng tới gốc azo 2-2’-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) làm giảm oxy hóa LDL

Sự liên quan giữa thành phần sulfate và sự phân hủy gốc superoxide có quan

hệ tuyến tính, tỷ lệ sulfate/fucose là một chỉ số chỉ ra mức Ďộ chống oxy hóa Tuy nhiên, mối quan hệ giữa cấu trúc và cơ chế chống oxy hóa cho tới nay vẫn chưa Ďược làm sáng tỏ [137]

* Ho t tính h mỡ máu

Giống acid sialic, fucoidan có thể làm tăng Ďiện tích dương của bề mặt tế bào

Ďể tác Ďộng tới sự tăng cholesterol trong máu, dẫn tới kết quả là giảm lượng

cholesterol trong máu Fuicodan từ Laminaria japonica có tác dụng làm giảm lượng

cholesterol, triglyceride, LDL-cholesterol và làm tăng lượng HDL-cholesterol trong huyết tương của chuột Nó cũng có tác dụng làm giảm cholesterol và triglyceride

trong huyết tương của bệnh nhân có máu nhiễm mỡ mà không gây tác dụng phụ tới gan và thận [114]

Những fucan sulfate có khối lượng phân tử thấp (có khối lượng phân tử trung

bình là Mw=8.000 Da) chiết xuất từ Laminaria japonica có thể làm giảm một cách

rõ rệt lượng lipid trong máu của chuột [74]

* Ho t tính chống viêm

Nghiên cứu cho thấy fucoidan (với liều 4mg/kg) phản ứng với L và P-seletin,

làm giảm thoát bạch cầu trung tính (bạch cầu Ďa nhân PMNs) vào khoang bụng trên chuột thí nghiệm bị viêm phúc mạc cấp tính [104] Đặc biệt fucoidan từ loài

Laminaria saccharina và Fucus evanescens ức chế sự thoát của bạch cầu trung tính

tới hơn 90% [134]

Ở một nghiên cứu khác cũng Ďã chỉ ra rằng, thành phần fucose và sulfate cũng như cấu trúc của fucoidan ảnh hưởng tới khả năng kháng viêm [134]

1.2.2 Alginate

Acid alginic với công thức tổng quát (C6H8O6)n là một polysaccharide làm

nguyên liệu cấu tạo thành tế bào của các loài rong biển thuộc ngành Phaeophyta

Khi Ďược chiết ra khỏi tế bào của rong biển thì polysaccharide này có thể ở dạng acid hoặc dạng muối (alginate) tùy thuộc vào Ďiều kiện chiết tách [21]

Alginate là tên gọi chung họ các muối của acid alginic

Alginate là một polysaccharide mạch thẳng có phân tử lượng lớn từ 105 -

106 Da tùy thuộc vào từng loại rong biển và phương pháp chiết tách Người ta Ďã thu Ďược alginate thương phẩm có khối lượng phân tử lên Ďến 150.000 Da với Ďộ polymer hóa là 750 [124], [127]

Về mặt cấu trúc, alginate là co-polymer của acid β-D- mannuronic (ký hiệu

là M) và acid α-D-guluronic (ký hiệu là G) qua liên kết glycoside 1→4

Cấu tạo của 2 monomer theo công thức cổ Ďiển Haworth Ďược chỉ ra trên Hình 1.5, theo công thức này, 2 monomer chỉ khác nhau ở chỗ nhóm carboxyl nằm

ở trên và dưới mặt phẳng của vòng pyranose [21]

Acid β-D-mannuronic Acid α-L-guluronic

Hình 1.5 Cô t H w rt ố r tr p tử

Theo quan Ďiểm hiện Ďại, hai gốc uronic Ďó có cấu tạo dạng ghế nhưng cấu hình khác nhau, acid manuronic có cấu hình 4C1 , còn acid guluronic có cấu hình 1C4 Như vậy, trong cả hai cấu hình, nhóm carboxyl Ďều gắn vào vòng pyranose ở vị trí xích Ďạo (equatorial)

Hai monomer này gắn với nhau bằng các liên kết 14 glycoside Nhưng sự kết hợp này không phải là ngẫu nhiên mà thành 3 loại chuỗi như sau (Hình 1.6):

Chuỗi homopolymannuronic: gồm các gốc mannuronic MMMMMM

Chuỗi homopolyguluronic: gồm các gốc guluronic GGGGGG

Chuỗi luân phiên: 2 gốc luân phiên nhau MGMGMGM

Hình 1.6 Cô t u t t

Trong Ďó chuỗi polyG có dạng gấp nếp, còn chuỗi polyM có dạng phẳng Chính Ďặc thù này sẽ quy Ďịnh tính chất khác nhau của chúng khi kết hợp với các ion Ďa hóa trị

Chiều dài của các chuỗi, sự phân bố của chúng trong mạch alginate biến Ďổi nhiều theo loài và cũng thay Ďổi phụ thuộc vào giai Ďoạn trưởng thành, vào các bộ phận của cá thể và môi trường sống của rong Điều này làm cho phân tử alginate rất

Ďa dạng và có tính chất khác nhau

Trong phân tử alginate, các gốc acid β-D-mannuronic và acid α-D-guluronic

này có thể kết hợp với nhau tạo thành các block kiểu M-block, G-block và block (Hình 1.7) Thành phần và cấu trúc của các block này ảnh hưởng trực tiếp Ďến tính chất alginate [108]

MG-Hình 1.7 C u tr t a) monomer, b) u tr ô , c) u tr

uỗ

Ở dạng acid hay muối kết hợp với các ion kim loại hóa trị 2 trở lên, polymer này không tan trong nước nhưng có khả năng hút nước rồi trương nở tạo thành thể gel Khi kết hợp với các cation hóa trị một như Na+

, K+, NH4+, alginate tan trong nước tạo thành các dung dịch có Ďộ nhớt cao Các muối alginate tan trong nước Ďược sử dụng như các chất làm tăng Ďộ nhớt, các chất ổn Ďịnh và các tác nhân tạo màng… trong các ngành công nghiệp dược, thực phẩm, dệt và công nghiệp giấy [6], [13]

1.2.2.2 H t t s v ụ

Qua nghiên cứu, các nhà khoa học thấy rằng alginate có ảnh hưởng khác nhau Ďến các hệ sinh học, phụ thuộc rất lớn vào thành phần hóa học và khối lượng phân tử của alginate Hoạt tính sinh học của alginate Ďược thử nghiệm Ďầu tiên trong các cuộc thử nghiệm cấy ghép các tiểu Ďảo Langerhans Ďã Ďược bọc alginate trên các súc vật

Ďể kiểm soát bệnh tiểu Ďường Kết quả cho thấy sự tăng trưởng quá nhanh các thực bào và nguyên bào sợi, tương tự như một phản ứng viêm với dị vật Các thí nghiệm cho thấy mức Ďộ cảm ứng các yếu tố gây ra hoại tử khối u và interleukin 1 phụ thuộc

hàm lượng acid manuronic trong mẫu alginate Kết quả này giải thích các phân Ďoạn giàu mannuronat không tham gia vào việc tạo gel sẽ thoát ra ngoài các viên nang và khởi Ďộng một phần phản ứng miễn dịch này có thể có liên quan một phần với các liên kết (1→4)glycoside, vì các polyuronat homopolymer diequartorial khác như acid

D-glucuronic cũng thể hiện tính chất này Khả năng miễn dịch của các

polymanuronat Ďến nay Ďã Ďược chứng minh trong các thử nghiệm lâm sàng Ďể ngăn ngừa các bệnh nhiễm khuẩn, Ďể làm tăng khả năng miễn dịch không Ďặc hiệu [115]

Một số tài liệu Ďã chứng minh hoạt tính sinh học của alginate, hoạt tính tẩy

xạ Khi cơ thể bị nhiễm chất phóng xạ strontium bằng con Ďường tiêu hóa, có thể dùng natri alginate Ďể Ďưa chất phóng xạ này ra ngoài cơ thể Alginate tạo kết tủa bền với strontium do Ďó ngăn Ďược sự hấp thu strontium vào trong máu và phức hợp này sẽ Ďược thải theo phân ra ngoài Việc dùng alginate làm chất tẩy xạ không ảnh hưởng Ďến quá trình trao Ďổi ion Ca++

và khả năng phát triển bình thường của cơ thể [72] Ngoài ra một số nghiên cứu cho thấy alginate còn có khả năng chống oxy hóa, tác dụng chống Ďông tụ máu, phòng xơ vữa Ďộng mạch ở trẻ em [8]

Alginate có rất nhiều ứng dụng trong cuộc sống Các ứng dụng của alginate Ďều dựa trên ba Ďặc Ďiểm Ďó là khả năng tạo dung dịch có Ďộ nhớt cao; khả năng tạo gel khi thêm muối calci vào dung dịch natri alginate trong nước; khả năng tạo màng natri hay calci alginate và sợi calci alginate [11]

Ngày nay các alginate Ďang Ďược sử dụng rộng rãi trong thực phẩm, các ngành công nghiệp dệt may và các lĩnh vực bao gồm cả giấy mạ, dược phẩm và hàn Ví dụ trong kỹ nghệ thức ăn, người ta dùng rất nhiều alginate Ďể làm kem, socola, bánh, món tráng miệng Trong công nghiệp, alginate Ďược sử dụng rất nhiều trong kỹ nghệ giấy, dệt, vải hồ, kỹ nghệ cao su Nhu cầu alginate dùng trong in vải sợi chiếm khoảng 50% tổng lượng alginate sản xuất Ďược trên toàn thế giới [11]

Trong công nghệ dược phẩm, alginate thường dùng làm chất nhũ hóa và chất gây thấm trong các dạng thuốc có cấu trúc nhũ tương và hỗn dịch, dùng trong tá dược bao của viên nén hay tham gia vào thành phần của vỏ nang Alginate có thể Ďược sử dụng Ďể kết hợp Ďể làm bao màng của viên tan trong ruột, Ďiều này rất có lợi cho việc bào chế các thuốc ảnh hưởng Ďến Ďường tiêu hóa, tương kỵ với dịch

vị Alginate dùng Ďể sản xuất lớp màng chống chất phóng xạ, nó thường dùng Ďể chỉ thị Ďộ ô nhiễm phóng xạ của vùng biển [127]

Màng Ďược tạo thành từ gelatin và alginate mang thuốc có thể Ďược sản xuất công nghiệp ứng dụng trong Ďiều trị tổn thương bỏng Màng này có tác dụng ngăn cản sự xâm nhiễm, giảm viêm Ďẩy mạnh quá trình lành hóa vết thương, Ďặc biệt có hiệu quả ở dạng bỏng khô [21]

1.2.3 Carrageenan

Carrageenan là polysaccharide có khả năng tạo gel và làm Ďặc dung dịch,

chúng tồn tại trong một số rong Ďỏ thuộc họ Rhodophyceae Hiện nay, carrageenan thường Ďược chiết từ một số loài rong như Gigartina, Chondrus, Iridaea, Eucheuma [14]

Carrageenan Ďược tạo thành từ các galactose mạch thẳng với mức Ďộ sulfate hóa khác nhau (dao Ďộng từ 15% - 40%) Các loại carrageenan khác nhau thì khác nhau về thành phần và cấu trúc, vì thế chúng tạo nên một khoảng biến Ďổi rộng các tính chất lưu biến cũng như các tính chất Ďặc biệt khác [123]

Cũng như các polysaccharide tự nhiên khác, carrageenan cũng không có khối lượng phân tử xác Ďịnh Carrageenan thương mại loại thực phẩm có khối lượng trung bình nằm trong khoảng 200.000Da Các tính chất của carrageenan phụ thuộc rất lớn vào khối lượng mol phân tử của chúng và chúng gần như mất Ďi nếu mol phân tử nhỏ hơn 100.000Da [122]

1.2.3.1 T p ầ v u tr ó

Carrageenan là họ các polysaccharide mạch thẳng Ďược sulfate hóa, chúng mang Ďầy Ďủ các tính chất Ďặc trưng của polysaccharide

Carrageenan là ionic polysaccharide Tất cả các carrageenan Ďều có Ďặc

trưng cấu trúc chung là Ďược tạo nên từ các gốc D-galactopyrano và 3,6 - anhydro- D-glactopyrano bằng liên kết 1,3- và 1,4--D, trong Ďó các mắt xích galactose bị

sulfate hóa một phần ở vị trí 2 hoặc/ và 6 hoặc/ và 3,6-anhydride Do carrageenan là polymer Ďược tạo thành từ khoảng 1.000 mắt xích nên khả năng của sự biến Ďổi cấu trúc là rất lớn Cho Ďến nay, ba loại carageenan chính tồn tại trong tự nhiên là

kappa-(-), iota-(i-) và lambda-(-) carrageenan Cấu trúc lý tưởng của một disaccharide Ďược Ďưa ra trong Hình 1.8 [120]

O

O H

O3SO

O O

O H

O

O H

O

O H

O

OSO 3

O

Hình 1.8 C u tr ó ột s r carrageenan tự

Carrageenan tách chiết từ các loài rong khác nhau có thành phần hóa học, Ďặc Ďiểm cấu trúc cũng như khả năng tạo gel rất khác nhau Tính chất và khả năng tạo gel của carrageenan phụ thuộc vào Ďộ lặp lại của các mắt xích, vị trí và số lượng

nhóm sulfate và Ďặc biệt là sự có mặt của vòng 3,6 anhydro D-galactose Cầu 3,6

anhydro Ďược hình thành từ việc loại nhóm sulfate ở C-6 Cấu hình 1C4 của vòng

3,6 anhydro D-galactose cho phép tạo nên cấu trúc xoắn, là Ďiều kiện chủ yếu Ďể tạo

gel của carrageenan [126]

Cấu trúc của carrageenan Ďã Ďược nghiên cứu từ những năm 50 của thế kỷ

XX Tuy nhiên cấu trúc chi tiết cũng như cấu hình không gian của carrageenan vẫn chưa Ďược nghiên cứu Ďầy Ďủ Việc sử dụng phổ MS và NMR trong nghiên cứu cấu trúc của carrageenan còn gặp nhiều khó khăn do sự phức tạp của phổ và còn nhiều vấn Ďề như liên kết hydro nội/ ngoại phân tử hay vai trò của nhiệt Ďộ và dung môi Ďến cấu trúc [121], [125]

Các carrageenan Ďều chứa nhóm thế sulfate trong phân tử và trong Ďó số lượng và vị trí của nhóm este sulfate ảnh hưởng lớn Ďến sự tạo gel của chúng Do mức Ďộ sulfate hóa khác nhau mà - và i-carrageenan có thể tạo gel trong khi -carrageenan không có tính chất này -carrageenan chỉ Ďược sulfate hóa ở C-4 trong

vòng 1,3-galactose, với i-carrageenan có thêm nhóm sulfate ở C-2 của vòng

3,6-anhydro galactose Cấu trúc này cho phép hình thành chuỗi xoắn kép Ďể tạo nên cấu

trúc gel ở Ďiều kiện thích hợp Khác với các carrageenan vừa nêu, -carrageenan có

mức Ďộ sulfate hóa cao hơn, thêm vào Ďó trong phân tử -carrageenan không có

vòng 3,6-anhydro galactose mà thay vào Ďó là vòng D-galactose 2,6 disulfate Các

nghiên cứu trước Ďây Ďã chỉ ra rằng hàm lượng anhydro galactose tỷ lệ thuận với

khả năng tạo gel Chính vì vậy, -carrageenan trong tự nhiên gần như không có khả

năng tạo gel [125]

1.2.3.2 H t t s v ụ

* H t t v rus

Khả năng kháng virus của carrageenan Ďã Ďược nhiều tác giả nghiên cứu

Gonzalez và cộng sự cho thấy i-carrageenan có hoạt tính chống virus HSV-1 bằng

cách ức chế một giai Ďoạn của quá trình sao chép virus Nakashima và cộng sự Ďã xác nhận hiệu ứng ức chế của -carrageenan Ďối với hoạt tính enzyme phiên mã

ngược của virus HIV cũng như ức chế giai Ďoạn sao chép in vitro của virus (IC50

1,5-1,6μg/ml) Qua nghiên cứu De Clerq và cộng sự [37] Ďã cho thấy khả năng Ďề

kháng của các dạng carrageenan Ďối với nhiều loài virus có vỏ bọc như herpes virus, pox virus, toga virus, paramyxo virus và Ďặc biệt là rota virus gây bệnh tiêu

chảy, trong Ďó -carrageenan thể hiện khả năng ức chế rota virus mạnh nhất

* H t t ố u bướu

Nhiều kết quả nghiên cứu Ďã chỉ ra rằng các sulfate oligosaccharide từ carrageenan thể hiện rõ hoạt tính chống u bướu Ďối với một số dạng ung thư Các tác giả [39], [126] giải thích rằng các oligosaccharide carrageenan Ďó cản trở quá trình tương tác giữa thành phần glucosaminoglican của proteoglican với các protein

-ngoài tế bào của cơ chất, vì vậy nó ngăn cản Ďược sự kết dính của các tế bào ung thư với cơ chất, nghĩa là ức chế di căn.

Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu lâm sàng cũng cho thấy các carrageenan trọng lượng phân tử lớn lại có vai trò như một tác nhân gây nhiễm, Ďồng thời còn có thể thúc Ďẩy khối u phát triển, ức chế chức năng Ďại thực bào và làm giảm tác dụng chống khối u của thuốc Điều Ďó nói lên rằng hoạt tính sinh học của các sulfate carrageenan phụ thuộc vào trọng lượng phân tử, cấu trúc cacbohydrat cũng như hàm lượng và vị trí liên kết của các nhóm sulfate Mou Haijin và cộng sự [91] Ďã nghiên cứu hoạt tính kháng u Ďối với ung thư tuyến vú, Meth-A và cổ trướng của các

oligosaccharide Ďã Ďược khử trùng hợp và sulfate hóa của kappa-carrageenan Kết

quả cho thấy carrageenan trọng lượng phân tử thấp là một tác nhân hữu hiệu ức chế khối u phát triển, cho phép nghĩ rằng vai trò quan trọng ở Ďây là trọng lượng phân tử của oligosaccharide Đáng chú ý là hoạt tính chống u bướu của oligosaccharide Ďược sulfate hóa nhiều lại thấp hơn Ďáng kể so với trường hợp không sulfate hóa hoặc sulfate hóa ít [91] Các tác giả cũng Ďã khảo sát mối quan hệ giữa hoạt tính kháng u và hoạt tính chống ôxy hóa của các oligosaccharide carrageenan và nhận Ďịnh rằng gốc ôxy tự do, một sản phẩm của quá trình chuyển hóa bình thường của

cơ thể là nguyên nhân gây ra sự phá hủy mô, lão hóa, ung thư và bệnh tật, tác Ďộng trực tiếp lên DNA phá hủy nhiễm sắc thể Các chức năng sinh học của protein, lipid

và một số các Ďại phân tử khác cũng có thể bị ảnh hưởng bởi gốc tự do (ôxy hoạt tính), Ďồng thời enzym superoxy dismutase (SOD) là một trong những enzym chống ôxy hóa, có nhiệm vụ bảo vệ cơ thể khỏi sự lan rộng của các tổn thương do gốc tự

do gây ra Sự phá hủy các tế bào miễn dịch bởi ôxy hoạt tính cũng Ďược xem là một trong những cơ chế gây ung thư Kết quả thực nghiệm thu Ďược cho thấy hoạt tính của enzym SOD Ďã giảm xuống Ďáng kể sau khi các tế bào ung thư Ďược cấy vào chuột thí nghiệm Kết quả Ďó Ďã xác nhận mối quan hệ giữa hoạt tính chống u bướu

và hoạt tính chống ôxy hóa của carrageenan

1.2.4 Laminaran

Laminaran là một polysaccharide tạo thành từ glucose, có tên thường gọi là

laminarin, tên gọi theo danh pháp quốc tế là: 1,3 -β- D - glucan [84] Laminaran là

một polysaccaride dự trữ của rong nâu, hàm lượng từ 1 – 15% trọng lượng rong khô tùy thuộc vào từng loại rong, vị trí Ďịa lý và môi trường sinh sống của từng loại rong Thường vào mùa hè hàm lượng laminaran giảm vì phải tiêu hao cho quá trình sinh trưởng và phát triển của cây rong [84]

Cấu trúc và thành phần của laminaran biển Ďổi theo loài rong, bao gồm các chuỗi mạch không phân nhánh bắt Ďầu bằng gốc mannitol hoặc glucose của các gốc

glucose liên kết β-(1→3) với các nhánh β-(1→6) không liên lục Laminaran Ďược hình thành từ các gốc D-glucan kết hợp với nhau bằng các liên kết β-(1→3) và một ít liên kết β-(1→6), gốc Ďường cuối mạch của một số phân tử có thể có các gốc manitol

(M-series) hay vẫn là glucose (G-series) Các gốc laminaran từ các loài rong khác

nhau thì khác nhau rõ rệt về tỉ lệ của các liên kết β-(1→ 3) và β-(1→6) cũng như cách

thức nối của các liên kết này trong chuỗi glucan [96].Tính không Ďồng nhất của chúng phụ thuộc vào sự chênh lệch khối lượng phân tử, hàm lượng và vị trí của các gốc glucose có liên kết (1→6) Khối lượng phân tử của laminaran khoảng 50.000Da, phụ thuộc vào Ďộ trùng hợp, Ďộ tan phụ thuộc vào Ďộ phân nhánh [93]

H O

H O

O H O O

O O

O H

O H

O O

Hình 1.9 C u trúc c a laminaran

1.3 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới liên quan đến nội dung nghiên cứu của luận án

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Việt Nam với tổng chiều dài bờ biển hơn 3.600km làm ranh giới phía tây của biển Đông có diện tích trên 3,5 triệu km2, Ďứng hàng thứ tư trong 61 biển quan trọng của thế giới Theo kết quả Ďiều tra cho thấy, nguồn tài nguyên rong biển của nước ta rất phong phú và Ďa dạng bao gồm khoảng 1.000 loài rong biển thuộc 3 ngành rong biển chính là rong Ďỏ, rong nâu và rong lục [24] Rong nâu ở nước ta

chủ yếu thuộc bộ Fucales là nguồn lợi rong biển tự nhiên lớn nhất với trữ lượng ước tính lên tới 10.000 tấn khô/năm chủ yếu thuộc 04 chi: Sargassum, Turbinaria, Padina, Dictyota [24]

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về polysaccharide từ rong biển Ďã Ďược một số nhà khoa học tiến hành Tuy nhiên các nghiên cứu hầu hết mới chỉ tập trung vào việc phân loại, Ďánh giá trữ lượng, Ďiều kiện sinh thái, khai thác rong, quy trình chiết tách các polysaccharide từ các rong thu Ďược Trong khi các nghiên cứu sâu về thành phần, cấu trúc hóa học, hoạt tính, của các chất có hoạt tính sinh học từ rong biển nói chung không nhiều

Nhóm nghiên cứu về vật liệu biển ở Nha Trang (Viện nghiên cứu khoa học & ứng dụng Công nghệ Nha Trang) với lợi thế Ďịa lý gần vùng biển, tập trung nhiều loại rong biển Ďã có một số kết quả nghiên cứu về rong biển Các nhà khoa học ở Ďây Ďã thu thập, phân loại rong biển, chiết tách và xác Ďịnh cấu trúc nhiều loại polysaccharide có ứng dụng thực tế cao như agar, carrageenan, alginate hay fucoidan [7], [18], [113]

Tác giả Nguyễn Duy Nhứt [17] với luận án tiến sĩ ― ghi n c u thành ph n hóa học và hoạt tính sinh học của po ysaccharide từ m t số oài rong n u t nh Khánh H a‖ Ďã thành công trong việc xác Ďịnh cấu trúc của 2 phân Ďoạn fucoidan có

và không có hoạt tính kháng ung thư chiết tách từ rong nâu Sargassum swartzii và Sargassum polycystum, bước Ďầu Ďã Ďề xuất mối quan hệ cấu trúc – hoạt tính kháng

ung thư của fucoidan

Bằng phương pháp phổ khối nhiều lần kết hợp với phần mềm Pascal, lần Ďầu

tiên cấu trúc hóa học của phân Ďoạn F-20 chiết tách từ rong nâu Sargassum swartzii

có tác dụng gây Ďộc tế bào ung thư Ďã Ďược xác Ďịnh Fucoidan F-20 có thứ tự cấu trúc thẳng gồm Ďường hexose-disulfate, fucose-sulfate, fucose- hexose-hexose, mạch nhánh gồm fucose-sulfate fucose và diglucuronic acid-hexose [15], [18]

Fuc

[hex-fuc2(SO3H)-fuc(SO3H)-hex-hex-hex-fuc2(SO3H)-fuc2(SO3H)-fuc(SO3hex ] n≥1 uro-uro

H)-hex-Khi nghiên cứu cấu trúc của fucoidan tách chiết từ rong nâu Sargassum polycystum, tác giả Bùi Minh Lý và cộng sự [12] cho thấy fucoidan thu Ďược

chứa chủ yếu 4 loại Ďường là fucose, rhamnose, mannose và galactose với tỷ lệ mol là Fuc:Rha:Man:Gal = 4:1:1:1 Cấu trúc bộ khung chính của fucoidan ở Ďây

có dạng α-L-fucose liên kết với nhau thông qua cầu nối (1-3) và nhóm thế sulfate

nằm chủ yếu ở vị trí C-2 và một phần ở vị trí C-4

Tác giả Bùi Minh Lý và cộng sự [46] cũng Ďã tiến hành nghiên cứu cấu

trúc của fucoidan tách chiết từ rong nâu Sargassum mcclurei ở Việt Nam cũng

như khảo sát hoạt tính kháng ung thư của fucoidan thu Ďược Fucoidan thu Ďược

có cấu trúc phân nhánh với thành phần chính là fucose, galactose, mannose, xylose và glucose Kết quả thử hoạt tính cho thấy fucoidan không có Ďộc tính Ďáng kể sau khi Ďiều trị trong vòng 24 và 48 giờ với liều 1 Ďến 200 μg/mL

Fucoidan từ Sargassum mcclurei ở Việt Nam cả ba phân Ďoạn thử nghiệm Ďều có

hoạt tính kháng tế bào ung thư Ďại tràng DLD-1

Khi khảo sát Ďặc Ďiểm cấu trúc của 5 loài rong nâu phổ biến ở Miền

Trung, nhóm tác giả Nguyễn Duy Nhứt và cộng sự [16] cho thấy: hàm lượng galactose chiếm tỷ lệ gần bằng của L-fucose trong bốn loài Sargassum polycystum, Sargassum swartzii, Sargassum oligocystum và Sargassum denticarpum trừ mẫu fucoidan từ rong Sargassum mcclurei Các Ďường D-xylose

và glucose chiếm tỷ lệ nhỏ hơn (2-9%) so với Ďường rhamnose và manose với khoảng 9-17% Hàm lượng D-xylose lớn nhất ở loài Sargassum denticarpum (9,24%) nhỏ nhất ở loài Sargassum mcclurei (2,53%) Đường D- rhamnose lớn nhất ở loài Sargassum mcclurei (25,25%) nhỏ nhất ở loài Sargassum polycystum (9,71%) Hàm lượng Ďường D-glucose dao Ďộng không nhiều, lớn nhất ở Sargassum denticarpum (9,83%) nhỏ nhất ở Sargassum mcclurei (4,04%) Hàm lượng sulfate dao Ďộng trong khoảng 20-33% (w/w) so với tổng lượng mẫu phân tích, lớn nhất ở Sargassum mcclurei (33%), nhỏ nhất ở Sargassum swartzii (20,4%) Ở rong nâu Sargassum swartzii hai phân Ďoạn Ďược

D-tách (F20 và F25) 90% fucoidan thu Ďược có trọng lượng phân tử trên 100 kDa,

hai phân Ďoạn này cho hoạt tính trên tế bào ung thư vú tương Ďối tốt, IC50 của F20

và F25 trên tế bào ung thư vú lần lượt là 13,4 μg/ml và 13,8 μg/ml

Tác giả Trần Thị Thanh Vân và cộng sự [12], [22] Ďã có nhiều nghiên cứu về thành phần, cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của các polysaccharide như agar, carrageenan và fucoidan từ rong Ďỏ và rong nâu

Tác giả Thành Thị Thu Thủy và cộng sự [119] Ďã nghiên cứu cấu trúc của

fucoidan từ rong nâu Turbinaria ornate thu thập ở Nha Trang – Việt Nam bằng

phương pháp ion hóa phun mù Ďiện tử (ESI-MS) và kỹ thuật tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) Ion hóa phun mù Ďiện tử Ďược sử dụng Ďể xác Ďịnh cấu trúc hóa học còn

kỹ thuật tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) sử dụng Ďể xác Ďịnh cấu trúc không gian ở kích thước phân tử Đây là cách tiếp cận mới trong việc nghiên cứu cấu trúc polysaccharide nói chung, fucoidan nói riêng Kết quả cho thấy fucoidan có hàm lượng sulfate là 25,6% và thành phần chủ yếu là fucose và galactoza (Fuc:Gal ≈ 3:1) Phân tích bằng ion hóa phun mù Ďiện tử cho thấy fucoidan ở Ďây có mạch

chính là 3-α-L-Fucp với mạch nhánh →4)-Galp(1→ tại C-4 của vòng fucan

Nhóm sulfate gắn tập trung chủ yếu tại C-2 và một phần ở C-4 của cả fucose và galactose Kết hợp cấu trúc hóa học, kết quả Ďo tán xạ tia X góc nhỏ và xây dựng

mô hình cấu trúc phân tử cho thấy fucoidan phân lập từ rong nâu Turbinaria ornate thu thập ở Nha Trang – Việt Nam có cấu trúc phân tử dạng hình que và có

mức Ďộ phân nhánh lớn

Khi nghiên cứu cấu trúc của fucoidan có hàm lượng sulfate cao Ďược phân

lập từ rong nâu Sargassum polycystum bằng sắc ký trao Ďổi ion, tác giả Bilan,

Thành Thị Thu Thủy và cộng sự [40] nhận thấy có 2 phân Ďoạn (F3 và F4) có thành phần có cấu trúc hóa học khác với các cấu trúc thường gặp Nghiên cứu cho thấy, sự phân bố các mảnh galactose dọc theo mạch chính dường như khá phức tạp Mảnh F4 (là galcatofucan sulfate lần Ďầu tiên Ďược phân lập từ rong nâu) có mạch chính là

3-α-L-fucopyranose 4-sulfate, giống như các fucoidan khác, nhưng mạch ngắn hơn

và xen kẽ có các mảnh Ďơn 2-α-D-galactopyranose, cũng bị sulfate hóa tại C-4

Việc có các mảnh Ďơn này sẽ ảnh hưởng rất lớn Ďến cấu trúc không gian và sẽ ảnh hưởng tới hoạt tính sinh học của polysaccharide

Trần Thị Luyến và Ngô Đăng Nghĩa [11] Trường Đại học Thủy sản Nha Trang và Lâm Ngọc Trâm [26] Viện Hải dương học Ďã có một số báo cáo về nghiên cứu công nghệ sản xuất natri alginate Ďể phục vụ cho công nghiệp dệt và thực phẩm Đây là những nghiên cứu áp dụng công nghệ của Nhật Bản từ Ďầu thập niên 80 của thế kỷ XX và trước Ďó vào Ďối tượng rong mơ Việt Nam Cho Ďến nay vẫn chưa có một patent nào về công nghệ sản xuất alginate của các tác giả Việt Nam Ďược công bố và hiện không còn một cơ sở nào sản xuất alginate tại Việt Nam

Tác giả Trần Vĩnh Thiện [21] với luận án tiến sĩ ―Điều chế, khảo sát cấu trúc

và tính chất của a ginate và o igosaccharide tách từ rong mơ khu vực Bắc Hải n

và ng dụng của chúng‖ Ďã thành công trong việc khảo sát chi tiết ảnh hưởng của

các yếu tố Ďến tỷ lệ tách alginate và khối lượng phân tử trung bình của sản phẩm trong quá trình Ďiều chế alginate từ rong mơ khu vực Bắc Hải Vân theo quy trình acid cũng như cấu trúc của các alginate thu Ďược

Tác giả Trần Thị Văn Thi [20] Ďã Ďưa ra các thông số chất lượng của

fucoidan và một số sản phẩm khác Ďược phân lập từ rong mơ (Sargassum) thu

thập ở Thừa Thiên-Huế Kết quả cho thấy hàm lượng alginate dao Ďộng trong khoảng 16,84-41,63% so với nguyên liệu khô, trong Ďó cao nhất là loài

Sargassum polycystum C.Ag (41,63%), hàm lượng fucoidan trong các mẫu rong

dao Ďộng trong khoảng 5,36-8,43%, hàm lượng laminaran tương Ďối thấp, dao

Ďộng từ 3,72-4,42% Fucoidan thu Ďược có hàm lượng L-fucose: 32%, hàm

lượng carbohydrate: 48,65-59,26%, hàm lượng sulfate: 32,85 – 38,43%, hàm lượng protein: 1,86%

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Các nhà khoa học trên thế giới Ďã chiết tách và xác Ďịnh cấu trúc của các ionic polysaccharide như fucoidan, laminaran, alginate, carrageenan từ nhiều loại rong biển [39], [42], [81] Các nhà khoa học Nga [38], [41] Ďã có các công bố về

xác Ďịnh cấu trúc của fucoidan từ nhiều loại rong nâu như Fucus evanescens C.Ag, Chorda filum hay Fucus distichus L chủ yếu bằng phổ NMR, các kết quả Ďã chỉ ra

tính Ďa dạng cấu trúc của fucoidan

Năm 1999, Lionel Chevolot và các cộng sự [54] Ďã phát hiện hoạt tính kháng Ďông tụ máu của fucoidan phụ thuộc vào yếu tố rất quan trọng, Ďó là nhóm ester sulfate trong phân tử fucoidan Nếu nhóm này nằm tại vị trí C-2 thì hoạt tính thể hiện rất mạnh, ngược lại sẽ không có hoạt tính

Tuy nhiên, khả năng chống Ďông tụ máu và chống kết tập tiểu cầu bị giảm dần với sự tăng thành phần sulfate của fucan [98]

Vị trí của nhóm sulfate cũng có ảnh hưởng tới hoạt tính chống Ďông tụ máu của fucoidan Hoạt tính liên quan tới vị trí ở C-2 sulfate và disulfate C-2,3 Hơn nữa cấu trúc C-2,3 disulfate là cấu trúc phổ biến ở các fucoidan có khả năng chống Ďông tụ máu Shiroma và cộng sự [111] Ďã báo cáo rằng hoạt tính chống Ďông tụ máu của fucoidan Ďược quyết Ďịnh bởi nhóm sulfate fucose, Ďặc biệt là các Ďơn vị disulfate

Silva và cộng sự [112] Ďã chứng minh rằng 3-O-sulfate tại C-3 của fucose Ďóng vai trò cho hoạt tính chống Ďông tụ máu của fucoidan từ Padina gymnospora

4-α-L-Các nghiên cứu cho thấy, fucoidan cần có một chiều dài Ďủ và cấu trúc thích hợp Ďể có thể trói buộc Ďược thrombin Trong Ďó yếu tố khối lượng phân tử Ďủ lớn

là cần thiết Ďể có hoạt tính chống Ďông tụ máu [77] Fucoidan thiên nhiên từ

Lessonia vadosa (có khối lượng khoảng 320.000 Da) có hoạt tính chống Ďông tụ

máu tốt, nhưng ngược lại những gốc chia nhỏ có khối lượng khoảng 32.000 Da thì lại có hoạt tính yếu hay thậm chí là không có hoạt tính [49]

Khi giảm kích thước của phân tử fucoidan sẽ giảm mạnh khả năng ảnh hưởng của nó tới bất hoạt thrombin Sulfate fucan với 45 Ďơn vị tetrasaccharide thì không thể trói Ďược thrombin, chỉ những phân tử có số Ďơn vị lớn hơn 100 thì mới

có hoạt tính [98]

Vào năm 2000, nhóm tác giả Catherine Boisson-Vidal và các cộng sự [45]

Ďã khử gốc sulfate của fucoidan Ďể khảo sát hoạt tính kháng Ďông huyết khối, họ

Ďã Ďi Ďến kết luận hoạt tính kháng Ďông huyết khối của fucoidan giảm Ďi khi mất dần gốc sulfate

Năm 2003, nhóm tác giả Nora M.A Ponce và các cộng sự [100] khi chiết

xuất fucoidan từ Adenocystis utricularis bằng cách xử lý rong nâu với cồn 80%,

bã sau Ďó Ďược chiết với 3 dung môi khác nhau là nước cất, dung dịch CaCl2 2%

và dung dịch HCl loãng (pH  2) Các dung dịch chiết ở nhiệt Ďộ phòng cho ra

sản phẩm fucoidan giàu L-fucose, D-galactose và ester sulfate Ďược Ďặt tên là

“galactofucan”, thể hiện hoạt tính ức chế HSV 1 và 2 nhưng không gây Ďộc tế bào Dạng uronofucoidan (có chứa acid uronic và các thành phần khác) thì lại không có hoạt tính kháng virus Nghiên cứu cấu trúc của phân Ďoạn galactofucan Ďược thực hiện bởi phân tích methyl hóa, khử sulfate và phổ NMR Kết quả chỉ

ra rằng thành phần fucan là chủ yếu bao gồm liên kết 3α-L-fucopyranosyl,

sulfate chủ yếu tại C-4 trong khi Ďó mạch nhánh tại C-2 của fucopyranosyl và fucopyranosyl không bị sulfate hóa

Awad N.E và cộng sự ở Nhật [36] Ďã nghiên cứu chiết tách, phân Ďoạn, xác Ďịnh thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của laminaran và alginate từ 2

loại rong nâu Padina pavonia (L.) Gaill và Hydroclathrus clathratus (C.A)

Howe Các nghiên cứu Ďã Ďưa ra phương pháp chiết tách Ďể thu Ďược từng loại ionic polysaccharide trên cùng một loại rong Polysaccharide với thành phần chính là fucose có thể thu Ďược từ chiết nóng hay chiết lạnh, acid glucuronic là

sản phẩm thủy phân chính từ Padina pavonia kể cả chiết lạnh hay chiết nóng

trong khi Ďó acid glucuronic và galacturonic là sản phẩm thủy phân chính khi

chiết lạnh của Hydroclathrus clathratus, fucose là thành phần thủy phân chính

khi chiết nóng Dịch chiết nóng của cả 2 loại rong này Ďều có hoạt tính ức chế

dòng tế bào HepG2 in vitro

Năm 2010, Makarenkova và cộng sự [86] qua nghiên cứu cho thấy fucoidan

phân lập từ Laminaria japonica còn có khả năng chống lại virus H5N1 Nghiên cứu cho thấy, bên cạnh việc fucoidan không Ďộc ra thì khi dùng fucoidan phân lập từ

Laminaria japonica với liều 50-500 μg/ml nó sẽ bảo vệ tế bào không bị tấn công

bởi virus H5N1, thậm chí là nó còn có thể diệt những virus mà cơ thể vừa mắc phải trong vòng 24 giờ

Những nỗ lực Ďầu tiên nhằm Ďưa ra một phương pháp hệ thống Ďể chiết fucoidan Ďã Ďược thực hiện bởi Conchie và cộng sự [48] Nhóm nghiên cứu Ďã

phân lập fucoidan từ rong nâu Fucus vesiculosus và Fucus spiralis, bằng cách

chiết với nước sôi trong 24 giờ, loại bỏ alginate và protein bằng Pb-acetate và kết tủa fucoidan như một phức hydroxide bằng cách thêm Ba(OH)2 Thủy phân phức thu Ďược với H2SO4 loãng và fucoidan Ďược phân lập sau quá trình thẩm tách kéo dài kèm theo một số bước xử lý với màng lọc Tiếp Ďó, tác giả Ďã phát triển phương pháp chiết tuần tự, bắt Ďầu bằng xử lý với formaldehyde, tiếp theo bằng chiết với cồn ở nồng Ďộ 80% Ďể loại bỏ mannitol, muối và các sản phẩm khối lượng phân tử thấp, sau Ďó rong Ďược khuấy trộn với dung dịch CaCl2 2% (ở nhiệt Ďộ phòng và tại 700C) Ďể chiết laminaran và fucoidan (alginate Ďược cố Ďịnh ở dạng muối Ca không tan) Fucoidan Ďược chiết tiếp với dung dịch HCl (pH = 2) Đến Ďây bã Ďược chiết tiếp với Na2CO3 Ďể thu nhận lại alginate hòa tan Tiếp tục bổ xung dung môi nhằm chiết ra thêm các phân Ďoạn fucoidan Quy trình chiết tuần tự này hầu như không Ďược sử dụng về sau, nhưng Ďã trở thành

cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo

Năm 1952, Black [44] Ďã khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt Ďộ, thời gian chiết và tỷ lệ dung môi chiết với rong lên hiệu suất thu hồi fucoidan Kết quả cho thấy Ďiều kiện tối ưu Ďể chiết fucoidan bao gồm khuấy huyền phù rong với dung dịch HCl ở pH 2,0-2,5 (tỷ lệ 1:10) tại 70oC trong 1 giờ Bằng cách xử lý này chỉ một lần chiết có thể rút ra Ďược khoảng 50% fucoidan, và với 3 lần chiết có thể rút ra Ďược hơn 80% fucoidan

Fucoidan còn có thể Ďược chiết bằng Ďun nóng một phần rong khô với 10 phần H2O tại 1000C trong 3-7,5 giờ và lấy ra Ďược 55-60% fucoidan Tuy nhiên, nếu chiết bằng nước sẽ rất khó cho việc tách bã rong khỏi dung dịch nước [17]

Tùy theo mục Ďích nghiên cứu, một số tác giả công bố có thể Ďiều chế fucoidan với hàm lượng fucose lớn hơn 40% từ sản phẩm thô bằng cách xử lý với formaldehyde và tách hợp chất không tan tạo thành [76]

Hagiwara và cộng sự [67], Chen và cộng sự [52] Ďã sử dụng phương pháp chiết nhờ sóng siêu âm Phương pháp này rút ngắn Ďược thời gian chiết xuất và

Ďây là kỹ thuật thân thiện với môi trường Thời gian chiết, áp suất, tỷ lệ nước/rong ảnh hưởng Ďến hiệu suất chiết fucoidan và fucoidan thu Ďược ở Ďây có thành phần chủ yếu là fucose, xylose và galactose

Mới gần Ďây các nhà khoa học liên bang Nga [43] Ďã Ďưa ra một quy trình công nghệ chiết tách fucoidan có Ďộ sạch > 90%, sử dụng màng siêu lọc Quy trình bao gồm xử lý bột rong với dung dịch acid thực phẩm nồng Ďộ 0,5-1,0% trong 4-5 giờ và dịch chiết acid Ďược lọc thẩm tách bằng màng siêu lọc trên màng 100-300 kDa, tiếp theo sấy phun Ďể thu nhận sản phẩm cuối cùng dưới dạng bột

Năm 2002, Bilan và cộng sự [41] Ďã Ďưa ra quy trình chiết tách fucoidan nhằm thuận lợi cho việc nghiên cứu cấu trúc

Mẫu rong khô Ďược xử lý ở nhiệt Ďộ phòng với hỗn hợp MeOH-CHCl3

-H2O = 4:2:1(v/v) Ďể loại bỏ các chất màu, lọc, rửa với acetone, sấy khô thu Ďược mẫu rong Ďã khử chất béo Mẫu rong Ďã khử chất béo Ďược khuấy trộn với dung dịch CaCl2 2% (3 lần) tại 850C trong 5giờ, thu lấy phần dịch chiết và thêm vào dịch chiết này dung dịch hexadecyltrimethyl-ammoniumbromide nồng Ďộ 10% Tủa tạo thành Ďược li tâm, rửa với nước, khuấy với dung dịch NaI nồng Ďộ 20% trong cồn (5 lần) trong vòng 2-3 ngày ở nhiệt Ďộ phòng, rửa với cồn và hòa tan lại trong nước Dung dịch Ďược thẩm tách và Ďông khô thu Ďược fucoidan thô dạng muối natri Quy trình Ďược tổng quát trên Sơ Ďồ 1.1

Sơ đồ 1.1 Sơ đồ ết t v t ế u

Trong thời gian gần Ďây, các nước phát triển trên thế giới hướng Ďến việc

nghiên cứu về mối quan hệ cấu trúc - hoạt tính của các ionic polysaccharide [45],

[54], [99] Các nghiên cứu tập trung giải quyết mối quan hệ giữa các yếu tố cấu trúc

1 Ly tâm

2 H2O Cắn chứa fucoidan

Rong khô

CH3OH:CHCl3:H2O = 4:2:1 Nhiệt Ďộ phòng

Bã lọc Dịch lọc chứa các chất màu

Làm khô chân không Rong Ďã loại chất béo

CaCl2 2% (x 3) Khuấy ở 85 °C (8 giờ) Dịch chiết tổng

CH3(CH2)15N(Br)(CH3)3 (10%)

1 C2H5OH

2 H2O Tủa

Fucoidan thô

ethanol NaI 20% (x 5) 2–3 ngày, nhiệt Ďộ phòng

Dịch

1 Thẩm tách

2 Đông khô

Na fucoidan

trong Ďó quan tâm Ďến các nhóm chức trên mạch polymer (hàm lượng, vị trí của chúng) và tính chất của polymer

Một số nhà khoa học Ďã tách fucoidan thành 12 phân Ďoạn có khối lượng phân tử khác nhau và khảo sát hoạt tính ức chế bổ thể (bổ thể là một nhóm protein huyết thanh, gồm 9 thành phần, không bền nhiệt bị phá hủy ở nhiệt Ďộ trên 56o

C) Kết quả cho thấy hoạt tính này lớn nhất khi khối lượng phân tử 13.500Da Ďến 40.000Da [130]

Năm 2002, Jang-Su Park, Andre Kim và các cộng sự [95] Ďã khảo sát sự biến Ďổi hoạt tính kháng ung thư của fucoidan khử sulfate, fucoidan tự nhiên (23,5% sulfate) và fucoidan sulfate hóa (53,3% sulfate) Kết quả cho thấy fucoidan sulfate hóa có khả năng kháng ung thư mạnh hơn fucoidan tự nhiên rất nhiều

Alginate có ở thành tế bào của rong nâu dưới dạng các muối calci, magie và natri Các muối calci và magie không tan trong nước Một số tác giả cho rằng, một

số alginate có tác dụng chống Ďông tụ máu Tuy nhiên, cơ chế chống Ďông tụ máu chưa rõ ràng Theo Fan và cộng sự [58], sự khác biệt trong khả năng chống Ďông tụ máu của alginate có thể liên quan Ďến hàm lượng sulfate và trọng lượng phân tử Hơn nữa, nhóm anion trong alginate sẽ có hiệu ứng chống Ďông tụ máu Trọng lượng phân tử khác nhau và thành phần Ďường trung lập cũng sẽ Ďóng vai trò trong quá trình chống Ďông tụ máu

Nguyên tắc chung của quy trình phân lập là alginate ở trong rong nâu phần lớn dưới dạng muối của ion hóa trị hai không hòa tan như Ca++, Mg++ Cần phải xử

lý acid Ďể chuyển hóa alginate sang dạng acid alginic Sau Ďó lọc sạch cặn bã rong không tan, Ďun với natri carbonat Ďể chuyển hóa acid alginic về natri alginate ta sẽ thu Ďược phần dịch chứa natri alginate Có hai con Ďường thu hồi alginate khác nhau bởi quá trình tách nước: một quy trình tách alginate ở dạng muối và Ďược tách ra khỏi nước, một quy trình tách alginate ở dạng gel acid alginic kết tủa Như vậy cả hai quy trình chỉ khác nhau căn bản có một khâu calci hóa Sở dĩ khâu calci hóa Ďược dùng thêm là vì calci alginate dễ ép tách nước hơn là acid alginic [119]

Con Ďường thứ nhất là thêm acid Ďể tạo thành gel acid alginic không tan trong nước và tách nó ra khỏi nước Acid alginic Ďược tách ra dưới dạng gel mềm và một

phần lượng nước cần phải Ďược loại khỏi chúng Sau công Ďoạn này cồn Ďược Ďưa vào acid alginic, tiếp theo là natri carbonat Ďể chuyển hóa acid alginic về natri alginate Natri alginate không hòa tan trong hỗn hợp cồn-nước nên có thể tách chúng

ra khỏi hỗn hợp, làm khô, nghiền Ďến kích thước hạt thích hợp phụ thuộc vào từng ứng dụng riêng của nó

Con Ďường thứ 2 thu hồi natri alginate là thêm vào dung dịch chiết ban Ďầu một muối calci Nó tác dụng tạo thành gel calci alginate có kết cấu dạng sợi, không hòa tan trong nước và có thể tách ra khỏi chúng Calci alginate tách ra nằm lơ lửng trong nước và acid Ďược thêm vào Ďể chuyển hóa thành acid alginic Acid alginic dạng sợi này Ďược tách ra rất dễ và Ďặt vào trong một máy trộn hình cầu với cồn và natri carbonat Ďược Ďưa từ từ vào bột nhão cho Ďến khi tất cả acid alginic Ďược chuyển hóa về natri alginate, bột natri alginate Ďôi khi còn Ďược ép thành những viên nhỏ sau Ďó sấy và nghiền mịn

Để chiết rút alginate, rong biển Ďược cắt nhỏ và khuấy với một dung dịch kiềm nóng (thường là natri carbonat) tại nhiệt Ďộ 60-70oC trong khoảng 2-2,5 giờ thu Ďược một huyền phù Ďặc Các cặn không tan Ďược loại bỏ khỏi dung dịch bằng cách lọc Vì dung dịch quá Ďặc, có Ďộ nhớt rất cao nên Ďể có thể lọc Ďược cần phải pha loãng nó với một lượng lớn nước Sau khi pha loãng với nước, dung dịch Ďược

ép qua một lớp vải lọc trong một máy ép lọc Trước khi bắt Ďầu lọc cần phải Ďưa bột trợ lọc diatomite vào, bột trợ lọc này sẽ giữ lại hầu hết các hạt mịn khỏi bề mặt của vải lọc và làm thuận tiện cho việc lọc [66]

Tuy nhiên, trong công nghệ chiết rút alginate từ rong biển ngày nay cũng Ďã

có một số cải tiến Chẳng hạn người ta Ďã phát hiện ra rằng các loài rong

Alginophytes ngoài alginate, fucoidan và laminaran chúng còn có chứa một lượng

lớn acid mannuronic có hoạt tính kích thích hệ miễn dịch, vì vậy Ďã xuất hiện công nghệ chiết rút alginate kết hợp với việc thu hồi một lượng Ďáng kể mannuronic, bằng cách thay Ďổi pH phù hợp với quá trình xử lý trước khi chiết [133]

Năm 2005, các nhà khoa học Thái Lan [55] Ďã Ďưa ra một quy trình công nghệ phức hợp chiết rong nâu cho phép thu nhận Ďồng thời các chế phẩm riêng biệt,

Ďó là các acid (alginic, polymannuronic), các polysaccharide trung tính (fucoidan,