Nghiên cứu trích ly phlorotannin từ rong Nâu Sargassum Serratum và ứng dụng tạo sản phẩm đồ uống giàu phlorotannin

Đề tài: Nghiên cứu trích ly phlorotannin từ rong Nâu Sargassum Serratum và ứng dụng tạo sản phẩm đồ uống giàu phlorotanninMỤC LỤCMỤC LỤC .ILỜI MỞ ĐẦU . 1CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN . 31.1. TỔNG QUAN VỀ RONG BIỂN [1]. 31.1.1 Đặc điểm, sự phân bố rong biển. . 31.1.2 Nguồn lợi rong biển –Bảo vệ và phát triển nguồn lợi rong biển Việt Nam . 41.1.3 Phân loại rong biển . 71.1.4 Thành phần sinh hóa của rong biển 81.1.5 Giá trị dinh dưỡng và ứng dụng của rong biển. . 81.1.6 Đặc điểm sinh trưởng, phát triển và thời kỳ thu hoạch rong biển hợp lý cho công nghệ chế biến. . 101.1.7 Tình hình sử dụng, chế biếnrong biển ở Việt Nam 121.2 Quá trình vận chuyển và các biện pháp bảo quản rong khô. 121.3 Giới thiệu về rong Nâu và rong Mơ (Sargassum). . 131.3.1 Đặc điểm. 131.3.2 Sự phân bố [1] . 161.3.3 Thành phần hóa học của rong Nâu. . 181.4 Một số quy trình công nghệ sản xuất các chất từ rong Nâu . 241.4.1 Công nghệ chế biếnMannitol từ rong Nâu [1] . 241.4.2 Chiết rút Iod từ rong Nâu [1] . 251.5 Tổng quan về hợp chất Phlorotannin (polyphenol). . 261.5.1 Đặc điểm. 261.5.2 Cơ chế oxi hóa của polyphenol 271.5.3 Hoạt tính sinh học của phlorotannin. . 281.5.4 Ứng dụng. . 291.6 Giới thiệu về quá trình trích ly. . 301.6.1 Bản chất. . 301.6.2 Phạm vi sử dụng của quá trình. . 301.6.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết. . 31 ii1.6.4 Tổng quan về dung môi chiết. . 321.6.5 Tìm hiểu dung môi chiết trong đề tài. 34CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNGVÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 372.1 Đối tượng nghiên cứu. 372.2 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm. . 372.3 Phương pháp nghiên cứu 372.4 Quy trình trích ly và thu nhận phlorotannin . 412.4.1 Sơ đồquy trình . 412.4.2 Thuyết minh quy trình . 422.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly Phlorotannin. 432.5.1 Tiến hành khảo sát điều kiện môi trường (pH) trích ly . 432.5.2 Tiến hành khảo sát tỷ lệ dung môi trích ly. 442.5.3 Tiến hành khảo sát nhiệt độ trích ly. 452.5.4 Tiến hành khảo sát thời gian trích ly 462.5.5 Tiến hành xác định hiệu suất trích ly . 472.5.6 Thí nghiệm xác định nhiệt độ cô đặc. 482.5.7 Thí nghiệm xác định thời gian ly tâm 492.6 Ứng dụng cao chiết phlorotannin vào quá trình tạo sản phẩm: nước uống rong biển đóng chai. 50CHƯƠNG 3: KẾT QUẢNGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 523.1 Kết quả xác định một số thành phần của rong nguyên liệu. . 523.2 Kết quả khử mùi của rong biển. 533.3 Kết quả xác định thông số thích hợp của quá trình chiết phlorotannin. 533.3.1 Kết quả xác định ảnh hưởng của môi trường (pH) đến khả năng chiết. 543.3.2 Kết quả xác định ảnh hưởng của tỷ lệ NL/DM (khối lượng/thể tích) đến khả năng chiết. . 553.3.3 Kết quả xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết. . 583.3.4 Kết quả xác định ảnh hưởng của thời gian đến khả năng chiết. 593.3.5 Xác định hiệu suất trích ly. 613.3.6 Kết quả xác định thông số thích hợp của quá trình cô đặc 63 iii3.3.7 Kết quả xác định thông số thích hợp của quá trình ly tâm. . 663.3.8 Đề xuất quy trình chiết phlorotannin từ rong Sargassum Serratum. . 673.3.9 Ứng dụng cao Phlorotannin vào quá trình tạo sản phẩm. . 69KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 74ivDANH MỤC BẢNGBảng 1.1: Nguồn lợi, sản lượng thu hoạch và tiềm năng sản xuất rong biển [1]. 5Bảng 1.2: Diện tích các vùng có thể qui hoạch nuôi trồng rong biển ở một số tỉnh duyên hải Việt Nam [1]. 6Bảng 1.3: Các giống loài rong Nâu tìm thấy và phân bố. . 16Bảng 1.4: Trữ lượng rong Mơ theo vùng biển các tỉnh . 17Bảng 1.5: Hàm lượng Mannitol 2 loài rong S.mcclureivà S.kjellmanianumtại Hòn Chồng Nha Trang 1979 (% so với trọnglượng khô tuyệt đối) 18Bảng 1.6:Hàm lượng axit Alginic trong các loài rong Nâu . 20Bảng 1.7: Hàm lượng axit amin ở một số loạirong Nâu vung biển Jeddah, Saudi Arabia (mg %). 22Bảng 1.8: Hàm lượng Iod trong các loại rong Nâu (% trọng lượng khô) Nha Trang –Khánh Hòa. . 23Bảng 2.1:Các mức chất lượng 39Bảng 2.2: Hệ số trọng lượng của sản phẩm 40Bảng 3.1Thành phần hóa học chính của rong nguyên liệu 52Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch H2O2đến khả năng khử mùi 53Bảng 3.13: Ảnh hưởng của nhiệt độđến hàm lượng Phlorotannin và Carbohydrate trong quá trình cô đặc. . 64Bảng 3.14: Hàm lượng các thành phần (%) sau khi cô đặc . 65Bảng 3.15Kết quả đánh giá cảm quan dịch chiết. . 66Bảng 3.16:Chỉ tiêu hóa lý và độ nhớt của một số sản phẩm nước ngọt 69Bảng 3.17: Kết quả đánh giá cảm quan dịch chiết theo tỷ lệ dịch cao bổ sung. 69Bảng 3.18: Bảng đánh giá cảm quan dịch chiết theo tỷ lệ đường phối chế . 70Bảng 3.19:Kết quả chỉ tiêu vi sinh theo thời gian thanh trùng. 71Bảng 3.20: Bảng mô tả sản phẩm nước rong biển đóng chai có bổ sung cao phlorotannin. . 71Bảng 3.21: Bảng phân tích các thành phần của sản phẩm sau khi bổ sung cao phlorotannin. . 72Bảng 3.22:Kết quả kiểm tra chỉ tiêu vi sinh vật trong sản phẩm 72 vDANH MỤC HÌNHHình 1.1:Sơ đồ hình chiết Mannitol bằng phương pháp hòa tan trong Alcol 25Hình 1.2: Sơ đồ quy trình tổng quát chiết rút Iod từ rong Nâu . 26Hình 1.3: Phloroglucinol (i) và phlorotannin [tetrafucol A (ii), fucodiphloroethol B (iii), fucodiphlorethol A (iv), tetrafuhalol A (v), tetraisofuhalol (vi), phlorofucofuroeckol (vii)] và hoạt tính của chúng. 27Hình 2.1: Rong Mơ(Sargassum serratum) .37Hình 2.2: Sơ đồ quy trình thu nhận phlorotannin từ rong Sargassum Serratum. 41Hình 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của pH 44Hình 2.4:sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến khả năng trích ly. 45Hình 2.5:Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ 46Hình 2.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng 47Hình 2.8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ cô đặc. 48Hình 2.9: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian ly tâm 49Hình 2.10:Sơ đồ quy trình tạo sản phẩm nước uống rong biển đóng chai .50Hình 3.1a: Biểu đồbiểu diễn ảnh hưởng của pHtrích ly đến hàm lượngphlorotannin trong quá trình chiết 44Hình 3.1b: Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của pH trích ly đến hàm lượng carbohydrate trong quá trình chiết. .55Hình 3.2a: Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng củatỷ lệ NL/DM đến hàm lượng phlorotannin trong quá trình chiết. 56Hình 3.2b: Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ NL/DM đến hàm lượng carbohydrate trong quá trình chiết. .56Hình 3.3a: Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng phlorotannin trong quá trình chiết. 58Hình 3.3b: Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng carbohydrate trong quá trình chiết. .58 viHình 3.4a: Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng phlorotannin trong quá trình chiết. 60Hình 3.4b: Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng carbohydrate trong quá trình chiết. .60Hình 3.5a:Đồ thị biểu diễn hàm lượng phlorotannin trong các lần trích ly 61Hình 3.5b: Đồ thị biểu diễn hàm lượng carbohydrate trong các lần trích ly .62Hình 3.6a: Đồ thị biểu diễn hiệu suất trích ly phlorotannin trong các lần trích ly 62Hình 3.6b: Đồ thị biểu diễn hiệu suất trích ly carbohydrate trong các lần trích ly .63Hình 3.7: Sơ đồ quy trình chiết rút phlorotannin từ rong Sargassum Serratum –Khánh Hòa. 67 1LỜI MỞ ĐẦUXã hội ngày càng phát triển, đời sống con người ngày càng được nâng cao. Con người không chỉ quan tâm đến những vấn đề ăn, mặc, ở đơn giản như trước đây mà còn có những yêu cầu cao hơn. Khi đời sống được nâng cao, con người ngày càng quan tâm hơn đến sức khỏe của mình. Do đó, những thực phẩm, vật dụng có thể gây hạicho sức khỏe dần bị loại bỏ và được thay thế bằng các sản phẩm được sản xuất từ các thành phần chiết xuất từ thiên nhiên. Nhu cầu của con người là một trong những yếu tố quan trọng thúc đẩy xã hội phát triển và cũng là động lực thúc đẩy các nhà khoa học, nhà sản xuất tìm tòi, sáng tạo ra nhiều sản phẩm mới. Với sự phát triển của khoa học, con người đã biết cách chiết xuất ra nhiều hợp chất có nguồn gốc tự nhiên có lợi cho sức khỏe con người và ứng dụng chúng vào trong đời sống thông qua nhiều ngành công nghiệp như: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp xây dựng, dệt may Trong đó, việc ứng dụng các thành tựu khoa học vào ngành công nghiệp thực phẩm đóng vai trò quan trọng vì nó ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe con người. Hiện nay, có rất nhiều hợp chất được chiết xuất từ thiên nhiên đã được ứng dụng rộng rãi vào đời sống.Thật vậy, sản phẩm đồ uống không còn đơn thuần là giải khát mà còn phải tốt cho sức khỏe. Vì thế việc nghiên cứu sản xuất các chiết xuất từ thiên nhiên để bổ sung vào đồ uống luôn được quan tâm, và những chất được trích ly đó chính là hợp chất polyphenol (phlorotannin). Thành phần này được sử dụng trong thực phẩm như một loại thực phẩm chức năng nhằm mục đích phòng ngừa bệnh do có tính chất kháng oxi hóa mạnh. Việt Nam có hệ động vật, thực vậtvô cùng phong phú, có nhiều gen quý hiếm đặc trưng cho khí hậu nhiệt đới nóng ẩm. Một trong những điều kiện tạo nên sự phong phú và giàu có ấy chính là vùng biển nhiệt đới rộng với bờ dài hơn 3200 km bao bọc hết phía đông và nam đất nước. Một trong những nguồn tài nguyên phong phú và có giá trị mà vùng biển bantặng cho chúng ta là rong biển. Rong biển là loại thực vật biển quý giá được dùng làm nguyên liệu chế biến thành các sản phẩm có giá trị trong công nghiệp và thực phẩm. Từ lâu, rong biển đã được coi là đối tượng nghiên cứu của nhiều nước trên thế giới. Ở nước ta trữ lượng rong biển 2rất lớn, là nguồn tài nguyên biển vô cùng phong phú, rong biển chiếm vị trí quan trọng trong lĩnh vực kinh tế biển Việt Nam. Ngành rong biển có nhiều loài, một trong những loài có nhiều tính năng ưu việt được nhiều nhà nghiên cứu ở nước ta quan tâm tới là ngành rong Nâu mà điển hình là rong Mơ.Gần đây, ngành nuôi trồng và chế biến rong biển nổi lên như một ngành công nghiệp mới mang lại một số thành tựu nhất định. Nhiều công trình nghiên cứu về giá trị dinh dưỡng cũng như dược học từ rong biển đã được công bố và ứng dụng rộng rãi trên toàn cầu. Người ta đã phát hiện ra nhiều thành phần quý có trong rong biển như: Iod, Alginate, Fuccoidin, hợp chất chống oxi hóa (phlorotannin), các axit béo, . rất có giá trị trong y học, thực phẩm, dược phẩm giúp cho mỗi quốc gia giải quyết được vấn đề nhập khẩu dược liệu. Ngày nay, nhiều công dụng khác của rong biển còn đang được các nhà nghiên cứu tiếp tục khám phá.Xuất phát từ nhu cầu của xã hội hiện đại, đồng thời tận dụng được nguồn nguyên liệu dồi dào, các nhà khoa học của nước ta đã và đang tăng cường nghiên cứu, chuyển nguồn rong biển và phế thải từ rong biển thành các sản phẩm có giá trị, bằng cách sản xuất ra các loại thực phẩm khác nhau, tách chiết ra các thành phần khác nhau có hoạt tính sinh học hoặc hỗn hợp các thành phần có hoạt tính sinh học để gia tăng giá trị rong biển Việt Nam.Để góp phần vào xu thế đó, tôi thực hiệnđề tài “Nghiên cứu trích ly phlorotannin từ rong Nâu Sargassum Seratum và ứng dụng tạo sản phẩm đồ uống giàu phlorotannin”. Đề tài gồm các nội dung:1. Tìm hiểu một số thành phần hóa học chủ yếu của nguyên liệu rong Nâu.2. Khảo sát quá trình trích ly phlorotannin.3. Thử nghiệm tạo sản phẩm đồ uống giàu phlorotannin.Bước đầu tiếp cận với nghiên cứu khoa học, trong điều kiện kiến thức còn hạn chế, điều kiện cơ sở vật chất, kinh phí nghiên cứu còn thiếu thốn, ngoài việc nỗ lực của bản thân, sự giúp đỡ của giáo viên hướng dẫn cùng các anh chị phụ trách phòng thí nghiệm của Viện Nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang, tôi đã hoàn thành đề tài được giao. Tuy nhiên đề tài không tránh khỏi những thiếu sót, tôi rất mong được sự góp ý chân thành của các thầy cô, các bạn độc giả để đề tài được hoàn thiện hơn.Tôi xin chân thành cảm ơn! 3CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ RONG BIỂN[1].1.1.1 Đặc điểm, sự phân bố rong biển. Rong biển hay tảo biển có tên khoa học là marine –algae, marine plant hay seaweed. Rong biển là thực vật thủy sinh có đời sống gắn liền với nước. Chúng có thể là đơn bào, đa bào sống thành quần thể. Chúng có kích thước hiển vi hoặc có khi dài hàng chục mét. Hình dạng của chúng có thể là hình cầu, hình sợi, hình phiến lá hay hình thù rất đặc biệt. Sản lượng hàng năm các Đaị dương cung cấp cho trái đất hàng 200 tỷ tấn rong. Nhiều nhà khoa học cho rằng trên 90% carbon tổng hợp hàng năm nhờ quang hợp trong môi trường lỏng, trong đó có 20% do rong biển tổng hợp nên.Rong biển thường phân bố ở các vùng nước mặn, nước lợ, cửa sông, vùng triền sâu, Rong Đỏ và rong Nâu là hai đối tượng được nghiên cứu với sản lượng lớn và được ứng dụng nhiều trong các ngành công nghiệp và đời sống. Đối với rong Lục thì loại tảo Chlorella được xếp vào loại tảo kì diệu, có tốc độ sinh khối cực nhanh, đang được nghiên cứu phục vụ cho conngười.Rong biển sống ở biển, hấp thụ một lượng thức ăn phong phú chảy trôi dạt từ lục địa ra, rong có nhiều tính chất không giống thực vật trên cạn. Một số yếu tố sinh thái đối với động vật sống trên cạn là rất quan trọng, song đối với rong biển lại không quan trọng như độ ẩm của không khí, lượng mưa. Nhưng các yếu tố sinh thái biển có ảnh hưởng đến đời sống rong biển như: địa bàn sinh trưởng, nhiệt độ, ánh sang, độ muối, độ PH, muối dinh dưỡng, khí hòa tan, mức triều, song, gió, hải lưu.Nhiều hợp chất hữu cơ trong rong biển có tác dụng điều hòa, kích thích sinh trưởng đối với cây trồng như auxin, giberelin, cytokinin, mannitol và các oligosacaride khác. Ngày nay rong biển còn được sản xuất thành phân bón hữu cơ (phân bón lá và phân bón gốc). 41.1.2 Nguồn lợi rong biển –Bảo vệ và phát triển nguồn lợi rong biển Việt Nam.a. Nguồn lợi rong biển thế giới.Nguồn lợi rong biển trên thế giới rất lớn, song sản lượng rong được khai thácvà sử dụng hàng năm không đều(theo tài liệu của FAO về sản lượng rong biển hàng nămtrên thế giới). Châu Á là khu vực cung cấp rong Đỏ. Trong đó, Philippines kể từ năm 1970 sau khi áp dụng thành công phương pháp phát triển rong Eucheumabằng bao tử đã chuyển lên hàng đầu thế giới vế rong biển nguyên liệu, 85% lượng nguyên liệu sản xuất Carrageenan và Furcellaran hằng năm do Philippins cung cấp. Nam Triều Tiên là nước cung cấp nguyên liệu sản xuất Agar với khối lượng lớn nhất trên thế giới, chiếm 52%.Nguồn lợi rong Nâu chủ yếu tập trung ở các nước Châu Âu và Bắc Mỹ. Canada tập trung hơn 75% khốilượng rong nguyên liệu sản xuấtAlginate , trong khi đó khối lượng rong Nâu Châu Á chỉ khoảng 5%. Theo FAO ước tính mỗi năm trên thế giới rong Nâuđược khai thác dọc bờ Đại Tây Dương kể cả biển Đen và Địa Trung Hải [1].Trên thế giới Alginate đượcsản xuất từ rong Nâucó sản lượng lớn hơn Agar, Carrageenan, Furcellanan được sản xuất từ rong Đỏ.Về sản lượng rong Nâu thì khu vực Bắc Mỹ có sản lượng lớn nhất, tiếp đến là Châu Âu, Mỹ La Tinh vàChâu Á.Đối với rong Đỏ thì sản lượngchủ yếu tập trung lớn tại Châu Á, đến Châu Mỹ La Tinh, rồi đếnChâu Âu. Việc chọn loại rong nào làm nguyên liệu chính để sản xuất các loại keo rong phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau. Một trong các yếu tố quan trọng nhất là tính chất ổn định và nguồn nguyên liệu, hay nói một cách khác là phụ thuộc vào khả năng phát triển của loài rong đó trong điều kiện tự nhiên của mỗi nước cũng như chất lượng keo rong được chiết rút từ loài rong đó.TÀI LIỆUTHAM KHẢO1. Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Ngô Đăng Nghĩa (2004), Chế biến rong biển, NXB Nông Nghiệp TP Hồ Chí Minh.2. Nguyễn Hữu Đại (1997), Rong Mơ Việt Nam nguồn lợi và sử dụng, NXB Nông Nghiệp TP Hồ Chí Minh.3. Đỗ Minh Phụng, Đặng Văn Hợp (1997), Phân tích kiểm nghiệm sản phẩm thủy sản, Trường Đại Học Thủy Sản Nha Trang.4. Khoa hóa thực phẩm và công nghệ sinh học, Các quá trình công nghệ cơ bản trong sản xuất thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội.5. Nguyễn Hải Hà (2004), Nghiên cứu trích ly polyphenol từ trà Camellia sinensis (L), Luận văn Thạc sĩ, Đại học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh.6. Đặng Xuân Cường (2009), Nghiên cứu thu nhận dịch chiết có hoạt tính kháng khuẩn từ rong Nâu Dictyota Dichotoma Việt Nam, Luận văn Thạc sỹ, Đại học Nha Trang.

LỜI CẢM ƠN Trải qua thời gian học tập trường tháng làm đồ án tốt nghiệp Viện nghiên cứu ứng dụng Nha Trang, hồn thành đồ án: “Nghiên cứu trích ly phlorotannin từ rong Nâu Sargassum Serratum ứng dụng tạo sản phẩm đồ uống giàu phlorotannin” Để đạt kết đó, trước hết tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Bùi Minh Lý – người tận tình giúp đỡ tơi suốt thời gian tơi tiến hành thực đề tài Tôi chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô Khoa Công nghệ Thực Phẩm – trường Đại học Nha Trang tận tình dạy dỗ, bảo suốt thời gian học trường Xin gửi lời cảm ơn đến TS Trần Thị Thanh Vân, Th.S Võ Mai Như Hiếu, Ks Trần Nguyễn Hà Vy anh chị cơng tác phịng thí nghiệm hóa phân tích triển khai cơng nghệ Viện tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình thực đồ án Tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè chỗ dựa vững chắc, hết lòng động viên giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực đề tài Một lần xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, tháng năm 2012 Sinh viên thực Hoàng Thị Thúy An i MỤC LỤC MỤC LỤC .I LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ RONG BIỂN [1] 1.1.1 Đặc điểm, phân bố rong biển 1.1.2 Nguồn lợi rong biển – Bảo vệ phát triển nguồn lợi rong biển Việt Nam .4 1.1.3 Phân loại rong biển 1.1.4 Thành phần sinh hóa rong biển 1.1.5 Giá trị dinh dưỡng ứng dụng rong biển 1.1.6 Đặc điểm sinh trưởng, phát triển thời kỳ thu hoạch rong biển hợp lý cho công nghệ chế biến 10 1.1.7 Tình hình sử dụng, chế biến rong biển Việt Nam 12 1.2 Quá trình vận chuyển biện pháp bảo quản rong khô 12 1.3 Giới thiệu rong Nâu rong Mơ (Sargassum) 13 1.3.1 Đặc điểm 13 1.3.2 Sự phân bố [1] 16 1.3.3 Thành phần hóa học rong Nâu 18 1.4 Một số quy trình cơng nghệ sản xuất chất từ rong Nâu 24 1.4.1 Công nghệ chế biến Mannitol từ rong Nâu [1] 24 1.4.2 1.5 Chiết rút Iod từ rong Nâu [1] 25 Tổng quan hợp chất Phlorotannin (polyphenol) 26 1.5.1 Đặc điểm 26 1.5.2 Cơ chế oxi hóa polyphenol 27 1.5.3 Hoạt tính sinh học phlorotannin 28 1.5.4 Ứng dụng 29 1.6 Giới thiệu q trình trích ly 30 1.6.1 Bản chất 30 1.6.2 Phạm vi sử dụng trình 30 1.6.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết 31 ii 1.6.4 Tổng quan dung môi chiết 32 1.6.5 Tìm hiểu dung mơi chiết đề tài 34 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.1 Đối tượng nghiên cứu 37 2.2 Hóa chất dụng cụ thí nghiệm 37 2.3 Phương pháp nghiên cứu 37 2.4 Quy trình trích ly thu nhận phlorotannin 41 2.4.1 Sơ đồ quy trình 41 2.4.2 Thuyết minh quy trình 42 2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình trích ly Phlorotannin 43 2.5.1 Tiến hành khảo sát điều kiện mơi trường (pH) trích ly 43 2.5.2 Tiến hành khảo sát tỷ lệ dung mơi trích ly 44 2.5.3 Tiến hành khảo sát nhiệt độ trích ly 45 2.5.4 Tiến hành khảo sát thời gian trích ly 46 2.5.5 Tiến hành xác định hiệu suất trích ly 47 2.5.6 Thí nghiệm xác định nhiệt độ đặc 48 2.5.7 Thí nghiệm xác định thời gian ly tâm 49 2.6 Ứng dụng cao chiết phlorotannin vào q trình tạo sản phẩm: nước uống rong biển đóng chai 50 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 52 3.1 Kết xác định số thành phần rong nguyên liệu 52 3.2 Kết khử mùi rong biển 53 3.3 Kết xác định thông số thích hợp q trình chiết phlorotannin 53 3.3.1 Kết xác định ảnh hưởng môi trường (pH) đến khả chiết 54 3.3.2 Kết xác định ảnh hưởng tỷ lệ NL/DM (khối lượng/thể tích) đến khả chiết 55 3.3.3 Kết xác định ảnh hưởng nhiệt độ đến khả chiết 58 3.3.4 Kết xác định ảnh hưởng thời gian đến khả chiết 59 3.3.5 Xác định hiệu suất trích ly 61 3.3.6 Kết xác định thơng số thích hợp q trình đặc 63 iii 3.3.7 Kết xác định thơng số thích hợp q trình ly tâm 66 3.3.8 Đề xuất quy trình chiết phlorotannin từ rong Sargassum Serratum 67 3.3.9 Ứng dụng cao Phlorotannin vào trình tạo sản phẩm 69 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO 77 PHỤ LỤC iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Nguồn lợi, sản lượng thu hoạch tiềm sản xuất rong biển [1] Bảng 1.2: Diện tích vùng qui hoạch ni trồng rong biển số tỉnh duyên hải Việt Nam [1] Bảng 1.3: Các giống lồi rong Nâu tìm thấy phân bố 16 Bảng 1.4: Trữ lượng rong Mơ theo vùng biển tỉnh 17 Bảng 1.5: Hàm lượng Mannitol loài rong S.mcclurei S.kjellmanianum Hòn Chồng Nha Trang 1979 (% so với trọng lượng khô tuyệt đối) 18 Bảng 1.6: Hàm lượng axit Alginic loài rong Nâu 20 Bảng 1.7: Hàm lượng axit amin số loại rong Nâu vung biển Jeddah, Saudi Arabia (mg %) 22 Bảng 1.8: Hàm lượng Iod loại rong Nâu (% trọng lượng khơ) Nha Trang – Khánh Hịa 23 Bảng 2.1: Các mức chất lượng 39 Bảng 2.2: Hệ số trọng lượng sản phẩm 40 Bảng 3.1 Thành phần hóa học rong ngun liệu 52 Bảng 3.2 Ảnh hưởng nồng độ dung dịch H2O2 đến khả khử mùi 53 Bảng 3.13: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng Phlorotannin Carbohydrate q trình đặc 64 Bảng 3.14: Hàm lượng thành phần (%) sau cô đặc 65 Bảng 3.15 Kết đánh giá cảm quan dịch chiết 66 Bảng 3.16: Chỉ tiêu hóa lý độ nhớt số sản phẩm nước 69 Bảng 3.17: Kết đánh giá cảm quan dịch chiết theo tỷ lệ dịch cao bổ sung 69 Bảng 3.18: Bảng đánh giá cảm quan dịch chiết theo tỷ lệ đường phối chế 70 Bảng 3.19: Kết tiêu vi sinh theo thời gian trùng 71 Bảng 3.20: Bảng mơ tả sản phẩm nước rong biển đóng chai có bổ sung cao phlorotannin 71 Bảng 3.21: Bảng phân tích thành phần sản phẩm sau bổ sung cao phlorotannin 72 Bảng 3.22: Kết kiểm tra tiêu vi sinh vật sản phẩm 72 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Sơ đồ hình chiết Mannitol phương pháp hòa tan Alcol 25 Hình 1.2: Sơ đồ quy trình tổng quát chiết rút Iod từ rong Nâu 26 Hình 1.3: Phloroglucinol (i) phlorotannin [tetrafucol A (ii), fucodiphloroethol B (iii), fucodiphlorethol A (iv), tetrafuhalol A (v), tetraisofuhalol (vi), phlorofucofuroeckol (vii)] hoạt tính chúng 27 Hình 2.1: Rong Mơ (Sargassum serratum) .37 Hình 2.2: Sơ đồ quy trình thu nhận phlorotannin từ rong Sargassum Serratum 41 Hình 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng pH 44 Hình 2.4: sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng tỷ lệ dung môi đến khả trích ly 45 Hình 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng nhiệt độ 46 Hình 2.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng 47 Hình 2.8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ đặc 48 Hình 2.9: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian ly tâm 49 Hình 2.10: Sơ đồ quy trình tạo sản phẩm nước uống rong biển đóng chai .50 Hình 3.1a: Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng pH trích ly đến hàm lượng phlorotannin trình chiết 44 Hình 3.1b: Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng pH trích ly đến hàm lượng carbohydrate trình chiết .55 Hình 3.2a: Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng tỷ lệ NL/DM đến hàm lượng phlorotannin trình chiết 56 Hình 3.2b: Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng tỷ lệ NL/DM đến hàm lượng carbohydrate trình chiết .56 Hình 3.3a: Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến hàm lượng phlorotannin trình chiết 58 Hình 3.3b: Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến hàm lượng carbohydrate trình chiết .58 vi Hình 3.4a: Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng thời gian chiết đến hàm lượng phlorotannin trình chiết 60 Hình 3.4b: Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng thời gian chiết đến hàm lượng carbohydrate trình chiết .60 Hình 3.5a: Đồ thị biểu diễn hàm lượng phlorotannin lần trích ly 61 Hình 3.5b: Đồ thị biểu diễn hàm lượng carbohydrate lần trích ly 62 Hình 3.6a: Đồ thị biểu diễn hiệu suất trích ly phlorotannin lần trích ly 62 Hình 3.6b: Đồ thị biểu diễn hiệu suất trích ly carbohydrate lần trích ly 63 Hình 3.7: Sơ đồ quy trình chiết rút phlorotannin từ rong Sargassum Serratum – Khánh Hòa 67 LỜI MỞ ĐẦU  Xã hội ngày phát triển, đời sống người ngày nâng cao Con người không quan tâm đến vấn đề ăn, mặc, đơn giản trước mà cịn có u cầu cao Khi đời sống nâng cao, người ngày quan tâm đến sức khỏe Do đó, thực phẩm, vật dụng gây hại cho sức khỏe dần bị loại bỏ thay sản phẩm sản xuất từ thành phần chiết xuất từ thiên nhiên Nhu cầu người yếu tố quan trọng thúc đẩy xã hội phát triển động lực thúc đẩy nhà khoa học, nhà sản xuất tìm tịi, sáng tạo nhiều sản phẩm Với phát triển khoa học, người biết cách chiết xuất nhiều hợp chất có nguồn gốc tự nhiên có lợi cho sức khỏe người ứng dụng chúng vào đời sống thông qua nhiều ngành công nghiệp như: công nghiệp thực phẩm, cơng nghiệp xây dựng, dệt may…Trong đó, việc ứng dụng thành tựu khoa học vào ngành công nghiệp thực phẩm đóng vai trị quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe người Hiện nay, có nhiều hợp chất chiết xuất từ thiên nhiên ứng dụng rộng rãi vào đời sống Thật vậy, sản phẩm đồ uống khơng cịn đơn giải khát mà cịn phải tốt cho sức khỏe Vì việc nghiên cứu sản xuất chiết xuất từ thiên nhiên để bổ sung vào đồ uống quan tâm, chất trích ly hợp chất polyphenol (phlorotannin) Thành phần sử dụng thực phẩm loại thực phẩm chức nhằm mục đích phịng ngừa bệnh có tính chất kháng oxi hóa mạnh Việt Nam có hệ động vật, thực vật vơ phong phú, có nhiều gen q đặc trưng cho khí hậu nhiệt đới nóng ẩm Một điều kiện tạo nên phong phú giàu có vùng biển nhiệt đới rộng với bờ dài 3200 km bao bọc hết phía đơng nam đất nước Một nguồn tài nguyên phong phú có giá trị mà vùng biển ban tặng cho rong biển Rong biển loại thực vật biển quý giá dùng làm nguyên liệu chế biến thành sản phẩm có giá trị cơng nghiệp thực phẩm Từ lâu, rong biển coi đối tượng nghiên cứu nhiều nước giới Ở nước ta trữ lượng rong biển lớn, nguồn tài nguyên biển vô phong phú, rong biển chiếm vị trí quan trọng lĩnh vực kinh tế biển Việt Nam Ngành rong biển có nhiều lồi, lồi có nhiều tính ưu việt nhiều nhà nghiên cứu nước ta quan tâm tới ngành rong Nâu mà điển hình rong Mơ Gần đây, ngành nuôi trồng chế biến rong biển lên ngành công nghiệp mang lại số thành tựu định Nhiều cơng trình nghiên cứu giá trị dinh dưỡng dược học từ rong biển công bố ứng dụng rộng rãi toàn cầu Người ta phát nhiều thành phần quý có rong biển như: Iod, Alginate, Fuccoidin, hợp chất chống oxi hóa (phlorotannin), axit béo, có giá trị y học, thực phẩm, dược phẩm…giúp cho quốc gia giải vấn đề nhập dược liệu Ngày nay, nhiều công dụng khác rong biển nhà nghiên cứu tiếp tục khám phá Xuất phát từ nhu cầu xã hội đại, đồng thời tận dụng nguồn nguyên liệu dồi dào, nhà khoa học nước ta tăng cường nghiên cứu, chuyển nguồn rong biển phế thải từ rong biển thành sản phẩm có giá trị, cách sản xuất loại thực phẩm khác nhau, tách chiết thành phần khác có hoạt tính sinh học hỗn hợp thành phần có hoạt tính sinh học để gia tăng giá trị rong biển Việt Nam Để góp phần vào xu đó, tơi thực đề tài “Nghiên cứu trích ly phlorotannin từ rong Nâu Sargassum Seratum ứng dụng tạo sản phẩm đồ uống giàu phlorotannin” Đề tài gồm nội dung: Tìm hiểu số thành phần hóa học chủ yếu ngun liệu rong Nâu Khảo sát q trình trích ly phlorotannin Thử nghiệm tạo sản phẩm đồ uống giàu phlorotannin Bước đầu tiếp cận với nghiên cứu khoa học, điều kiện kiến thức hạn chế, điều kiện sở vật chất, kinh phí nghiên cứu cịn thiếu thốn, việc nỗ lực thân, giúp đỡ giáo viên hướng dẫn anh chị phụ trách phịng thí nghiệm Viện Nghiên cứu ứng dụng cơng nghệ Nha Trang, tơi hồn thành đề tài giao Tuy nhiên đề tài không tránh khỏi thiếu sót, tơi mong góp ý chân thành thầy cơ, bạn độc giả để đề tài hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ RONG BIỂN [1] 1.1.1 Đặc điểm, phân bố rong biển Rong biển hay tảo biển có tên khoa học marine – algae, marine plant hay seaweed Rong biển thực vật thủy sinh có đời sống gắn liền với nước Chúng đơn bào, đa bào sống thành quần thể Chúng có kích thước hiển vi có dài hàng chục mét Hình dạng chúng hình cầu, hình sợi, hình phiến hay hình thù đặc biệt Sản lượng hàng năm Đaị dương cung cấp cho trái đất hàng 200 tỷ rong Nhiều nhà khoa học cho 90% carbon tổng hợp hàng năm nhờ quang hợp mơi trường lỏng, có 20% rong biển tổng hợp nên Rong biển thường phân bố vùng nước mặn, nước lợ, cửa sông, vùng triền sâu,… Rong Đỏ rong Nâu hai đối tượng nghiên cứu với sản lượng lớn ứng dụng nhiều ngành công nghiệp đời sống Đối với rong Lục loại tảo Chlorella xếp vào loại tảo kì diệu, có tốc độ sinh khối cực nhanh, nghiên cứu phục vụ cho người Rong biển sống biển, hấp thụ lượng thức ăn phong phú chảy trôi dạt từ lục địa ra, rong có nhiều tính chất không giống thực vật cạn Một số yếu tố sinh thái động vật sống cạn quan trọng, song rong biển lại không quan trọng độ ẩm khơng khí, lượng mưa Nhưng yếu tố sinh thái biển có ảnh hưởng đến đời sống rong biển như: địa bàn sinh trưởng, nhiệt độ, ánh sang, độ muối, độ PH, muối dinh dưỡng, khí hịa tan, mức triều, song, gió, hải lưu Nhiều hợp chất hữu rong biển có tác dụng điều hịa, kích thích sinh trưởng trồng auxin, giberelin, cytokinin, mannitol oligosacaride khác Ngày rong biển sản xuất thành phân bón hữu (phân bón phân bón gốc) 78 13 TL: Sang- Hoon Lee, Li- Yong, Fatih Karadeniz, Moon- Moo Kim, Se- Kwon Kim, Alpha- glucosidase and alpha- amylase inhibitory activities of phlorotannin derivatives from Ecklonia cava, Journal of Biotechnology 136S (2008) S577- S588 14 Moon- Moo Kim, Quang Van Ta, Eresha Mendis, Niranjan Rajapakse, Won- Kyo Jung, Hee- Guk Byun, You- Jin Jeon, Se- Kwon Kim, Phlorotannins in Ecklonia cava extract inhibit matrix metalloproteinase activity, Life Sciences 79 (2006) 1436- 1443 15 Murat Artan, Yong Li, Fatih Karadeniz, Sang- Hoo Lee, Moon- Moo Kim, Se- Kwon Kim, Anti- HIV- activity of phloroglucinol derivative, 6,6’- bieckol, from Echlonia cava, Bioorganic & Medicinal Chemistry 16 (2008) 7921- 7926 16 Quang- To Le, Yong Li, Zhong- Ji Qian, Moon- Moo Kim, Se-Kwon Kim, Inhibitory effects of polyphenols isolated from marine alga Ecklonia cava on hictamine release, Process Biochemistry 44 (2009) 168- 176 17 Nelson T.E., Lewis B.A Separation and characterization of the soluble and insoluble components of insoluble laminaran // Carbohydr Res – 1974.- Vol.33.P 63- 74 18 Maria E.R Duarte, a Marc A Cardoso, a Miguel D Noseda, a, l Alberto S.Cerezo (2001), “Structural studies on fucoidans from the brown seaweed Sargassum Stenophyllum”, Carbohydrate Research 333, pp 281- 293 19 Google.com.vn PHỤ LỤC Phụ lục 1: Xác định hàm lượng ẩm phương pháp sấy [3] a) Nguyên lý: Dùng nhiệt độ cao để làm bay mẫu thử, sau dựa vào hiệu số khối lượng mẫu thử trước sau sấy khơ, từ tính hàm lượng nước thực phẩm (%) b) Dụng cụ hóa chất:  Tủ sấy điều chỉnh nhiệt độ  Cân phân tích, độ xác 10-4 g  Cốc sấy thủy tinh  Đũa thủy tinh  Bình hút ẩm c) Tiến hành: Sấy cốc đến khối lượng không đổi: Cốc rửa sạch, úp khô, sấy nhiệt độ 100 ÷ 105 0C khoảng giờ, sau lấy làm nguội bình hút ẩm mang cân sấy tiếp nhiệt độ trên, làm nguội bình hút ẩm cân đến hai lần liên tiếp sai khác khối lượng không 5.10-4 g (sấy đến khối lượng không đổi) Cân xác lượng rong cắt nhỏ (khoảng 10 g) vào cốc sấy khô đến khối lượng không đổi Dùng đũa thủy tinh đánh tơi mẫu dàn mẫu đáy cốc Chuyển cốc vào tủ sấy, sấy 60 ÷ 800C Sau nâng nhiệt độ lên 100 ÷ 1050C, sấy liên tục Chú ý, trình sấy sau đảo mẫu lần Lấy mẫu để nguội bình hút ẩm, sau mang cân cân phân tích sấy tiếp nhiệt độ 100 ÷ 1050C đến khối lượng khơng đổi d) Tính kết quả: Độ ẩm rong tính theo cơng thức: X  G  G * 100 G  G (%) Trong đó: X : Độ ẩm (hàm lượng nước) rong (%) G1: Khối lượng cốc sấy mẫu thử trước sấy (g) G2: Khối lượng cốc sấy mẫu thử sau sấy (g) G : Khối lượng cốc sấy (g) Phụ lục 2: Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Kjeldadl Từ hàm lượng nito định lượng theo phương pháp Kjeldadl, nhân với hệ số 6.25 tính hàm lượng protein mẫu rong Phương pháp Kjeldadl [3]: a) Nguyên lý: Để xác định đạm tổng quát thực phẩm người ta dùng H2SO4 đậm đặc chất xúc tác đặc biệt hỗn hợp CuSO4 K2SO4 theo tỷ lệ 1/10 để vơ hóa; mục đích để chuyển tồn nito thực phẩm dạng muối (NH4)2SO4 Sau dùng NaOH đặc để đẩy NH3 dùng nước lôi NH3 khỏi thiết bị chưng cất vào cốc hứng chứa H2SO4 1.1N dư, cuối dùng NaOH 0.1N chuẩn độ lại H2SO4 dư b)  Cách tiến hành: Lấy xác g mẫu rong cắt nhỏ cho vào bình Kjeldadl Thêm g hỗn hợp chất xúc tác CuSO4 K2SO4 20 ml H2SO4 đậm đặc để nghiêng bếp điện đun từ từ Trong trình vơ hóa màu sắc mẫu chuyển từ màu nâu đen sang màu vàng xanh không màu Chú ý:  Trong q trình vơ cơ, mẫu chưa đạt đén màu xanh mà dung dịch bị cạn lấy bình để nguội thêm vào 5ml dung dịch H2SO4 đậm đặc tiếp tục vơ  Khi vơ hóa mẫu, tránh tượng mẫu sôi mạnh bị bắn ngồi gây sai số, phải vơ triệt để hồn toàn  Rửa thiết bị chưng cất: Tiến hành sục rửa thiết bị chưng cất kiểm tra khớp nối phải đảm bảo kín  Chuẩn bị cốc hứng: Lấy cốc thủy tinh 250 ml cho vào 25 ml dung dịch H2SO4 0.1 N vài giọt metyl đỏ 0.1% Đặt cốc hứng ngập đầu ống sinh hàn thiết bị chưng cất  Chưng cất chuẩn độ: cho mẫu vô hóa vào bình chưng cất thiết bị, tráng bình Kjeldadl vài lần nước cất để lấy hết mẫu thử vơ hóa, dịch tráng chuyển vào bình chưng cất Thêm vài giọt phenolphthalein 1% cho từ từ dung dịch NaOH 40% có màu đỏ (hoặc tím đỏ), tráng phễu nước cất, đậy kín khớp nối tiến hành chưng cất lôi NH3 nước hết NH3 bình chưng cất (thử giấy đo pH) Định lượng trực tiếp NH3 bay H2SO4 0.1N dư cốc hứng, sau dùng NaOH 0.1N chuẩn độ lại lượng H2SO4 0.1N dư cốc hứng đến dung dịch chuyển từ màu đỏ sang màu vàng nhạt c) Tính kết quả: Hàm lượng đạm tồn phần tính theo cơng thức sau: Ntp  0014 * ( A  B ) * 100 P (%) Trong đó: A: số ml H2SO4 0.1N dùng cốc hứng B: số ml NaOH dùng chuẩn độ P: khối lượng mẫu thử (mẫu rắn) (g) 0.0014: số gam nito tương ứng với ml H2SO4 0.1N Hàm lượng protein rong tính theo công thức sau: Xp = Ntp* 6.25 (%) Phụ lục 3: Xác định hàm lượng lipid tổng phương pháp Bligh Dyer hỗn hợp chloroform/methanol a Nguyên lý: Giải phóng lipid từ hợp chất với protein glucid nhờ thủy phân chloroform (CHCl3) mơi trường có cồn (CH3OH) b Dụng cụ hóa chất: Sử dụng dụng cụ hóa chất thơng thường phịng thí nghiệm c Tiến hành: Cân 50- 100 gam mẫu rong hay bã rong nghiền nhỏ máy xay, đem ngâm chiết CHCl3- CH3OH tỷ lệ 1: (100 ml CHCl3: 200 ml CH3OH) siêu âm (chiết lần) Bổ sung 100 ml CHCl3, sau thêm nước vào lắc Phân lớp lấy phần dung dịch phía , rửa lại nước lần, sau đem làm khan Na2SO4 Dịch chiết thu đem cô cất loại dung môi máy quay cất chân không 400C áp suất 25 tor Hàm lượng dầu béo thu sau cân cân phân tích Sortorius analytic (10-4) tính tốn theo phần trăm khối lượng so với mẫu ban đầu d Tính kết quả: Hàm lượng lipid (%) theo công thức sau: A  P * 100 G (%) Trong đó: A: hàm lượng lipid mẫu thử (%) P: khối lượng lipid đem cân (g) G: khối lượng mẫu thử (g) Phụ lục 4: Xác định hàm lượng Iod theo phương pháp chuẩn độ [3] a) Nguyên lý: Iodua (I-) oxy hóa nước Brom bão hòa thành Iodat (IO3-), Iodat kết hợp (I-) mơi trường acid giải phóng I2 tự Chuẩn độ Na2S2O3 với thị hồ tinh bột Từ tính lượng Iod thực phẩm Các phản ứng chính: KI + Br2 + H2O = KIO3 + HBr KIO3 + KI + H3PO4 = I2 + 2K3PO4 + H2O I2 + Na2S2O3 = NaI + Na2S4O6 b) Tiến hành Cân 20 gam mẫu cho vào cốc nung Trộn với 10g bột MgO để khống chế nhiệt độ tránh Iod thăng hoa Nung 2h nhiệt độ tối đa 3500C Hòa tan tro nước cất (10- 15ml) lọc giấy lọc không tàn, lấy dung dịch Phần tro lại giấy lọc nung lại nhiệt độ 450- 5000C Sau hịa tan nước cất, lọc giấy lọc khơng tàn Nếu cặn cịn đen tiếp tục nung lại lần thành tro trắng (phải nung nhiều lần để tránh Iod thăng hoa) Dịch lọc dồn chung vào bình định mức 50 ml, thêm nước cho đủ mức dung dịch thử Cho vào bình tam giác có nút mài kín: Dung dịch thử : 10ml Dung dịch H2C2O4 10% (acid oxalic) : giọt Nước Brom bão hòa : ml Đun cách thủy bình tam giác khoảng 10 phút để đuổi Brom dư Để nguội làm lạnh đến 100C Cho thêm vào bình tam giác: H3PO4 đ (d = 1.3): 1ml KI tinh thể: 1g Đậy nắp, lắc đều, để n bóng tối 15 phút (để phản ứng hồn tồn) Sau mở nắp thêm ml hồ tinh bột 1% dung dịch có màu xanh tím Chuẩn độ Na2S2O3 0.01N tới màu xanh tím Đọc thể tích Na2S2O3 0.01N dùng hết Từ tính hàm lượng Iod theo công thức: X  N * 21 * F * 100 P (%) Trong đó: X1 : hàm lượng Iod mẫu phân tích (%) N : số ml Na2S2O3 0.01N dùng để chuẩn độ (ml) 0.21 : số mg I2 tương đương 1ml Na2S2O3 0.01N F : hệ số pha loãng P : khối lượng mẫu phân tích (g) Để xác định hàm lượng Iod dịch chiết tiến hành từ khâu cho vào bình tam giác Phụ lục 5: Xác định tro toàn phần [3] a) Nguyên lý Dùng sức nóng (550- 6000C) nung cháy hồn tồn chất hữu Phần lại đem cân tính hàm lượng tro tồn phần mẫu phân tích b) Dụng cụ, vật liệu thuốc thử  Chén nung sứ  Đèn cồn hay bếp điện  Lò nung điều chỉnh nhiệt độ (đến 550- 6000C)  Cân phân tích  Bình hút ẩm, phía để chất hút ẩm  H2O2 10 thể tích HNO3 đậm đặc c) Tiến hành Nung chén sứ rửa lò nung tới đến 550- 6000C đến trọng lượng khơng đổi Để nguội bình hút ẩm cân phân tích xác đến 10-4 g Cho vào chén khoảng gam chất thử Cân tất cân phân tích với độ xác Cho tất vào lò nung tăng nhiệt độ từ từ 550- 6000C Nung cho trắng , nghĩa loại hết chất hữu thơng thường khoảng 6-7 Trường hợp cịn tro đen, lấy để nguội, cho thêm vài giọt H2O2 10 thể tích HNO3 đậm đặc nung lại tro trắng Để nguội bình hút ẩm cân cân có độ xác Tiếp tục nung thêm nhiệt độ 30 phút để nguội bình hút ẩm cân, lặp lặp lại thao tác trọng lượng không đổi Kết lần nung cân liên tiếp không cách 0.0005 gam d) Tính kết Hàm lượng tro theo phần trăm (X1) tính cơng thức: X1 G2G * 100 (%) G1  G Trong đó: X1: Hàm lượng tro mẫu phân tích (%) G1: khối lượng chén nung mẫu (g) G : khối lượng chén nung (g) G2 : khối lượng chén nung tro trắng (g) Chú ý: Khi chén nung cịn nóng để vào bình hút ẩm, nhớ để nắp mở lúc đầu mở vịi khơng khí nắp bình hút ẩm tránh khơng khí nóng nở đầy làm bật vỡ nắp bình Phụ lục 6: Xác định hàm lượng xơ thô theo Crudefibre định lượng Carbohydrat Để xác định xơ thô, việc đánh giá xử lý dựa rong nhiên liệu loại ẩm chất béo với acid lỗng 1.25 %, sau với kiềm 1.25% Như vậy, g rong nhiên liệu loại ẩm chất béo xử lý với 200 ml dung dịch H2SO4 1.25% Sauk hi lọc rửa, bã xử lý với dung dịch NaOH 1.25% Bã lọc, rửa với nước nóng sau với HNO3 1% rửa lại với nước nóng Bã sấy khơ 1300C ± 20C, để nguội bình hút ẩm cân (W2) Nung 30 phút 6000C ± 150C, để nguội bình hút ẩm cân (W3) CrudeFiger  W W * 100 (%) W1 Trong đó: W1: lượng mẫu thử Xác định hàm lượng carbohydrate: % Carbohydrat = 100 – (ẩm + protein + chất béo + tro + xơ) Phụ lục 7: Xác định hàm lượng Fucoidan Lượng sinh khối rong nghiền mịn (100g) xử lý nhiệt độ phòng với hỗn hợp MeOH- CHCl3- H2O = 4:2:1 để loại bỏ chất màu, lọc sấy khô chân không cho lượng sinh khối rong khử chất béo Nguyên liệu dung dịch CaCl2 2% (5×250ml) khuấy trộn học 850C Đưa 80 ml dung dịch hexadecyl trimethylammonium bromide nồng độ 10% nước vào dung dịch chiết gom chung lại Tủa tạo thành ly tâm, rửa với nước khuấy với dung dịch NaI 20% cồn (5×150ml) vòng 2- ngày nhiệt độ phòng, rửa với cồn hòa tab nước Dung dịch thẩm tách đông khô nhanh để thu fucoidan thô (F) dạng muối Na+ Cân cân phân tích Sortorius analytic (10-4) tính tốn theo phần trăm khối lượng so với mẫu ban đầu Phụ lục 8: Xác định hàm lượng Alginate Cân khoảng 10 gam rong khô, ngâm rong 500 ml formaldehyt 1%, khuấy nhẹ 12 Sau rửa rong nước cất Tiếp tục ngâm rong H2SO4 0.2N lại rửa nước cất Chiết alginate Na2CO3 1% 12 giờ, có khuấy nhẹ Lọc thu dịch lọc Tủa cồn 950 theo tỷ lệ dịch chiết: cồn 1: 2, lọc thu tủa, rửa tủa acetone, sấy khô 400C Cân sản phẩm tính thành phần phần trăm Hàm lượng alginate (%) tính theo cơng thức: A  P * 100 G (%) Trong đó: A: hàm lượng alginate (%) P: khối lượng alginate đem cân (g) G: khối lượng mẫu thử (g) Phụ lục 9: Xác định hàm lượng phlorotannin dịch chiết Hàm lượng phlorotannin dịch chiết xác định phương pháp so màu, dùng thuốc thử Folin- Ciocalteu bước sóng 750 nm a) Nguyên lý: Oxi hóa tồn lượng phlorotannin dịch chiết dung dịch FolinCiocalteu (hỗn hợp acid phosphotungstic acid phosphomolyblic) Các acid bị khử thành Vonfram (W8O23) oxyt molipden (Mo8O23) có màu xanh Màu xanh hấp thụ nhiều bước sóng 750 nm b) Dụng cụ, hóa chất: Dụng cụ:  Máy quang phổ UV-Vis  Pipet  Bình định mức  Ống đong  Các ống nghiệm c) Tiến hành: Lấy 1ml dịch chiết dung môi + ml Folin- Ciocalteu 10% + ml Na2CO3 10% Sau đặt ống nghiệm bóng tối nhiệt độ phòng khoảng Sau khoảng thời gian quan sát thấy màu xanh đen xuất tiến hành so màu máy quang phổ UV- Vis bước sóng 750 nm, ghi độ hấp thụ tính tốn xác định hàm lượng phlorotannin có mẫu thử Chú ý: Trước tiến hành thí nghiệm ta phải pha lỗng mẫu cần thiết Phụ lục 10: Xác định hàm lượng Carbohydrat dịch chiết Lấy 0.5 ml dung dịch cần xác định có nồng độ khoảng 10- 100 µg/l Thêm ml dung dịch cồn: phenol (1:8) lắc đều, thêm ml H2SO4 đậm đặc đem đun cách thủy nhiệt độ 600C 10 phút, để nguội Đem dung dịch đo mật độ quang 484 nm, chất chuẩn dùng galacto Chú ý: Trước tiến hành thí nghiệm ta phải pha loãng mẫu cần thiết Phụ lục 11 Bảng 3.3: Kết xác định ảnh hưởng pH đến khả trích ly phlorotannin pH OD Độ pha lỗng V dịch trích ly (ml) ∑P(mg/∑Vdịch trích ly từ 10 (g) nguyên liệu) 1.0 0.254 10 178 26.26 1.5 0.201 10 175 21.64 2.0 0.221 10 165 22.03 2.5 0.179 10 170 19.18 3.0 0.184 10 160 18.44 3.5 0.188 10 160 18.76 4.0 0.190 10 160 18.92 5.0 0.196 10 160 19.39 6.0 0.194 10 145 17.43 7.0 0.192 10 145 17.29 8.0 0.147 10 160 15.53 Phụ lục 12 Bảng 3.4: Kết xác định ảnh hưởng pH đến khả trích ly carbohydrate pH OD Độ pha lỗng V dịch trích ly (ml) ∑carbohydrate (µg/∑ Vdịch trích ly từ 10 (g) ngun liệu) 1.0 0.339 178 70975.5 1.5 0.337 175 69343.75 2.0 0.330 165 63937.5 2.5 0.312 170 62050 3.0 0.310 160 58000 3.5 0.301 160 56200 4.0 0.304 160 56800 5.0 0.305 160 57000 6.0 0.316 145 53650 7.0 0.313 145 53106.25 8.0 0.302 160 56400 Phụ lục 13 Bảng 3.5: Kết xác định ảnh hưởng tỷ lệ ngun liệu: dung mơi đến khả trích ly phlorotannin Tỷ lệ OD Độ pha lỗng V dịch trích ly (ml) ∑ P(mg/∑Vdịch trích ly từ 10 (g) nguyên liệu) 1: 0.556 10 18 5.37 1: 10 0.376 10 67 14.06 1: 15 0.242 10 105 15.10 1: 20 0.218 10 165 21.78 1: 25 0.170 10 210 22.76 1: 30 0.153 10 250 25.00 1:40 0.119 10 310 25.81 1:50 0.072 10 410 24.64 Phụ lục 14 Bảng 3.6: Kết xác định ảnh hưởng tỷ lệ ngun liệu: dung mơi đến khả trích ly carbohydrate V dịch trích ly ∑carbohydrat(µg/∑ Vdịch trích ly (ml) từ 10 (g) nguyên liệu) Tỷ lệ OD Độ pha loãng 1: 1.103 18 24367.5 1: 10 0.541 67 43633.75 1: 15 0.518 105 65362.5 1: 20 0.310 165 59812.5 1: 25 0.266 210 64575 1: 30 0.283 250 82187.5 1: 40 0.264 310 94550 1: 50 0.167 410 75337.5 Phụ lục 15 Bảng 3.7: Kết xác định ảnh hưởng nhiệt độ đến khả trích ly phlorotannin Nhiệt độ (0C) OD Độ pha lỗng V dịch trích ly (ml) ∑ P(mg/∑Vdịch trích ly từ 10 (g) nguyên liệu) 40 0.174 10 165 18.21 50 0.184 10 165 19.02 60 0.243 10 165 23.82 70 0.250 10 165 24.38 80 0.233 10 165 23.00 90 0.224 10 165 22.27 100 0.205 10 165 20.73 Phụ lục 16 Bảng 3.8: Kết xác định ảnh hưởng nhiệt độ đến khả trích ly carbohydrate Nhiệt độ (0C) OD Độ pha lỗng V dịch trích ly (ml) ∑carbohydrat(µg/∑Vdịch trích ly từ 10 (g) nguyên liệu) 40 0.291 165 55893.75 50 0.295 165 56718.75 60 0.269 165 51356.25 70 0.301 165 57956.25 80 0.355 165 69093.75 90 0.370 165 72187.5 100 0.319 165 61668.75 Phụ lục 17 Bảng 3.9: Kết xác định ảnh hưởng thời gian đến khả trích ly phlorotannin Thời gian (phút) OD Độ pha lỗng V dịch trích ly (ml) ∑ P(mg/∑Vdịch trích ly từ 10 (g) nguyên liệu) 20 0.209 10 165 21.05 40 0.215 10 165 21.54 60 0.223 10 165 22.19 80 0.234 10 165 23.08 100 0.262 10 165 25.36 120 0.268 10 165 25.85 140 0.269 10 165 25.93 160 0.282 10 165 26.99 180 0.285 10 165 27.23 200 0.288 10 165 27.47 220 0.271 10 165 26.09 240 0.278 10 165 26.66 Phụ lục 18 Bảng 3.10: Kết xác định ảnh hưởng thời gian đến khả trích ly carbohydrate Thời gian (phút) OD Độ pha lỗng V dịch trích ly (ml) ∑carbohydrat(µg/∑Vdịch trích ly từ 10 (g) ngun liệu) 20 0.198 165 36712.5 40 0.270 165 51562.5 60 0.280 165 53625 80 0.311 165 60018.75 100 0.327 165 63318.75 120 0.333 165 64556.25 140 0.379 165 74043.75 160 0.429 165 84356.25 180 0.435 165 85593.75 200 0.420 165 82500 220 0.399 165 78168.75 240 0.297 165 57131.25 Phụ lục 19 Bảng 3.11: Kết xác định hiệu suất trích ly phlorotannin V dịch trích ly ∑P (mg/ ∑Vdịch trích ly từ (ml) 10 (g) nguyên liệu) 10 165 25.36 0.467 - 165 4.20 Lần 0.251 - 165 2.45 Lần 0.148 - 165 1.61 Số lần OD Độ pha loãng Lần 0.262 Lần Phụ lục 20 Bảng 3.12: Kết xác định hiệu suất trích ly carbohydrate V dịch trích ly ∑carbohydrat(µg/∑Vdịch trích ly (ml) từ 10 (g) nguyên liệu) 165 62700 0.506 - 165 20047.5 Lần 0.332 - 165 12870 Lần 0.171 - 165 6228.75 Số lần OD Độ pha loãng Lần 0.324 Lần ... gia tăng giá trị rong biển Việt Nam Để góp phần vào xu đó, tơi thực đề tài ? ?Nghiên cứu trích ly phlorotannin từ rong Nâu Sargassum Seratum ứng dụng tạo sản phẩm đồ uống giàu phlorotannin? ?? Đề... từ thiên nhiên ứng dụng rộng rãi vào đời sống Thật vậy, sản phẩm đồ uống không đơn giải khát mà phải tốt cho sức khỏe Vì việc nghiên cứu sản xuất chiết xuất từ thiên nhiên để bổ sung vào đồ uống. .. phần hóa học chủ yếu nguyên liệu rong Nâu Khảo sát q trình trích ly phlorotannin Thử nghiệm tạo sản phẩm đồ uống giàu phlorotannin Bước đầu tiếp cận với nghiên cứu khoa học, điều kiện kiến thức