Tình hình nghiên cứu trên thế giớ

Một phần của tài liệu Nghiên cứu cấu trúc và khảo sát hoạt tính sinh học của fucoidan và alginate từ hai loài rong nâu sargassum henslowianum và sargassum swartzii của việt nam (1) (Trang 33)

Các nhà khoa học trên thế giới Ďã chiết tách và xác Ďịnh cấu trúc của các ionic polysaccharide như fucoidan, laminaran, alginate, carrageenan từ nhiều loại rong biển [39], [42], [81]. Các nhà khoa học Nga [38], [41] Ďã có các công bố về xác Ďịnh cấu trúc của fucoidan từ nhiều loại rong nâu như Fucus evanescens C.Ag,

Chorda filum hay Fucus distichus L. chủ yếu bằng phổ NMR, các kết quả Ďã chỉ ra tính Ďa dạng cấu trúc của fucoidan.

Năm 1999, Lionel Chevolot và các cộng sự [54] Ďã phát hiện hoạt tính kháng Ďông tụ máu của fucoidan phụ thuộc vào yếu tố rất quan trọng, Ďó là nhóm ester sulfate trong phân tử fucoidan. Nếu nhóm này nằm tại vị trí C-2 thì hoạt tính thể hiện rất mạnh, ngược lại sẽ không có hoạt tính.

Tuy nhiên, khả năng chống Ďông tụ máu và chống kết tập tiểu cầu bị giảm dần với sự tăng thành phần sulfate của fucan [98].

Vị trí của nhóm sulfate cũng có ảnh hưởng tới hoạt tính chống Ďông tụ máu của fucoidan. Hoạt tính liên quan tới vị trí ở C-2 sulfate và disulfate C-2,3. Hơn nữa cấu trúc C-2,3 disulfate là cấu trúc phổ biến ở các fucoidan có khả năng chống Ďông tụ máu. Shiroma và cộng sự [111] Ďã báo cáo rằng hoạt tính chống Ďông tụ máu của fucoidan Ďược quyết Ďịnh bởi nhóm sulfate fucose, Ďặc biệt là các Ďơn vị disulfate.

Silva và cộng sự [112] Ďã chứng minh rằng 3-O-sulfate tại C-3 của 4-α-L- fucose Ďóng vai trò cho hoạt tính chống Ďông tụ máu của fucoidan từ Padina gymnospora.

Các nghiên cứu cho thấy, fucoidan cần có một chiều dài Ďủ và cấu trúc thích hợp Ďể có thể trói buộc Ďược thrombin. Trong Ďó yếu tố khối lượng phân tử Ďủ lớn là cần thiết Ďể có hoạt tính chống Ďông tụ máu [77]. Fucoidan thiên nhiên từ

Lessonia vadosa (có khối lượng khoảng 320.000 Da) có hoạt tính chống Ďông tụ máu tốt, nhưng ngược lại những gốc chia nhỏ có khối lượng khoảng 32.000 Da thì lại có hoạt tính yếu hay thậm chí là không có hoạt tính [49].

Khi giảm kích thước của phân tử fucoidan sẽ giảm mạnh khả năng ảnh hưởng của nó tới bất hoạt thrombin. Sulfate fucan với 45 Ďơn vị tetrasaccharide thì không thể trói Ďược thrombin, chỉ những phân tử có số Ďơn vị lớn hơn 100 thì mới có hoạt tính [98].

Vào năm 2000, nhóm tác giả Catherine Boisson-Vidal và các cộng sự [45] Ďã khử gốc sulfate của fucoidan Ďể khảo sát hoạt tính kháng Ďông huyết khối, họ Ďã Ďi Ďến kết luận hoạt tính kháng Ďông huyết khối của fucoidan giảm Ďi khi mất dần gốc sulfate.

Năm 2003, nhóm tác giả Nora M.A. Ponce và các cộng sự [100] khi chiết xuất fucoidan từ Adenocystis utricularis bằng cách xử lý rong nâu với cồn 80%, bã sau Ďó Ďược chiết với 3 dung môi khác nhau là nước cất, dung dịch CaCl2 2% và dung dịch HCl loãng (pH  2). Các dung dịch chiết ở nhiệt Ďộ phòng cho ra sản phẩm fucoidan giàu L-fucose, D-galactose và ester sulfate Ďược Ďặt tên là “galactofucan”, thể hiện hoạt tính ức chế HSV 1 và 2 nhưng không gây Ďộc tế bào. Dạng uronofucoidan (có chứa acid uronic và các thành phần khác) thì lại không có hoạt tính kháng virus. Nghiên cứu cấu trúc của phân Ďoạn galactofucan Ďược thực hiện bởi phân tích methyl hóa, khử sulfate và phổ NMR. Kết quả chỉ ra rằng thành phần fucan là chủ yếu bao gồm liên kết 3α-L-fucopyranosyl, sulfate chủ yếu tại C-4 trong khi Ďó mạch nhánh tại C-2 của fucopyranosyl và fucopyranosyl không bị sulfate hóa.

Awad N.E. và cộng sự ở Nhật [36] Ďã nghiên cứu chiết tách, phân Ďoạn, xác Ďịnh thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của laminaran và alginate từ 2 loại rong nâu Padina pavonia (L.) Gaill và Hydroclathrus clathratus (C.A) Howe. Các nghiên cứu Ďã Ďưa ra phương pháp chiết tách Ďể thu Ďược từng loại ionic polysaccharide trên cùng một loại rong. Polysaccharide với thành phần chính là fucose có thể thu Ďược từ chiết nóng hay chiết lạnh, acid glucuronic là sản phẩm thủy phân chính từ Padina pavonia kể cả chiết lạnh hay chiết nóng trong khi Ďó acid glucuronic và galacturonic là sản phẩm thủy phân chính khi chiết lạnh của Hydroclathrus clathratus, fucose là thành phần thủy phân chính khi chiết nóng. Dịch chiết nóng của cả 2 loại rong này Ďều có hoạt tính ức chế dòng tế bào HepG2 in vitro.

Năm 2010, Makarenkova và cộng sự [86] qua nghiên cứu cho thấy fucoidan phân lập từ Laminaria japonica còn có khả năng chống lại virus H5N1. Nghiên cứu cho thấy, bên cạnh việc fucoidan không Ďộc ra thì khi dùng fucoidan phân lập từ

Laminaria japonica với liều 50-500 μg/ml nó sẽ bảo vệ tế bào không bị tấn công bởi virus H5N1, thậm chí là nó còn có thể diệt những virus mà cơ thể vừa mắc phải trong vòng 24 giờ.

Những nỗ lực Ďầu tiên nhằm Ďưa ra một phương pháp hệ thống Ďể chiết fucoidan Ďã Ďược thực hiện bởi Conchie và cộng sự [48]. Nhóm nghiên cứu Ďã phân lập fucoidan từ rong nâu Fucus vesiculosusFucus spiralis, bằng cách chiết với nước sôi trong 24 giờ, loại bỏ alginate và protein bằng Pb-acetate và kết tủa fucoidan như một phức hydroxide bằng cách thêm Ba(OH)2. Thủy phân phức thu Ďược với H2SO4 loãng và fucoidan Ďược phân lập sau quá trình thẩm tách kéo dài kèm theo một số bước xử lý với màng lọc. Tiếp Ďó, tác giả Ďã phát triển phương pháp chiết tuần tự, bắt Ďầu bằng xử lý với formaldehyde, tiếp theo bằng chiết với cồn ở nồng Ďộ 80% Ďể loại bỏ mannitol, muối và các sản phẩm khối lượng phân tử thấp, sau Ďó rong Ďược khuấy trộn với dung dịch CaCl2 2% (ở nhiệt Ďộ phòng và tại 700C) Ďể chiết laminaran và fucoidan (alginate Ďược cố Ďịnh ở dạng muối Ca không tan). Fucoidan Ďược chiết tiếp với dung dịch HCl (pH = 2). Đến Ďây bã Ďược chiết tiếp với Na2CO3 Ďể thu nhận lại alginate hòa tan. Tiếp tục bổ xung dung môi nhằm chiết ra thêm các phân Ďoạn fucoidan. Quy trình chiết tuần tự này hầu như không Ďược sử dụng về sau, nhưng Ďã trở thành cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo.

Năm 1952, Black [44] Ďã khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt Ďộ, thời gian chiết và tỷ lệ dung môi chiết với rong lên hiệu suất thu hồi fucoidan. Kết quả cho thấy Ďiều kiện tối ưu Ďể chiết fucoidan bao gồm khuấy huyền phù rong với dung dịch HCl ở pH 2,0-2,5 (tỷ lệ 1:10) tại 70oC trong 1 giờ. Bằng cách xử lý này chỉ một lần chiết có thể rút ra Ďược khoảng 50% fucoidan, và với 3 lần chiết có thể rút ra Ďược hơn 80% fucoidan.

Fucoidan còn có thể Ďược chiết bằng Ďun nóng một phần rong khô với 10 phần H2O tại 1000C trong 3-7,5 giờ và lấy ra Ďược 55-60% fucoidan. Tuy nhiên, nếu chiết bằng nước sẽ rất khó cho việc tách bã rong khỏi dung dịch nước [17].

Tùy theo mục Ďích nghiên cứu, một số tác giả công bố có thể Ďiều chế fucoidan với hàm lượng fucose lớn hơn 40% từ sản phẩm thô bằng cách xử lý với formaldehyde và tách hợp chất không tan tạo thành [76].

Hagiwara và cộng sự [67], Chen và cộng sự [52] Ďã sử dụng phương pháp chiết nhờ sóng siêu âm. Phương pháp này rút ngắn Ďược thời gian chiết xuất và

Ďây là kỹ thuật thân thiện với môi trường. Thời gian chiết, áp suất, tỷ lệ nước/rong ảnh hưởng Ďến hiệu suất chiết fucoidan và fucoidan thu Ďược ở Ďây có thành phần chủ yếu là fucose, xylose và galactose.

Mới gần Ďây các nhà khoa học liên bang Nga [43] Ďã Ďưa ra một quy trình công nghệ chiết tách fucoidan có Ďộ sạch > 90%, sử dụng màng siêu lọc. Quy trình bao gồm xử lý bột rong với dung dịch acid thực phẩm nồng Ďộ 0,5-1,0% trong 4-5 giờ và dịch chiết acid Ďược lọc thẩm tách bằng màng siêu lọc trên màng 100-300 kDa, tiếp theo sấy phun Ďể thu nhận sản phẩm cuối cùng dưới dạng bột.

Năm 2002, Bilan và cộng sự [41] Ďã Ďưa ra quy trình chiết tách fucoidan nhằm thuận lợi cho việc nghiên cứu cấu trúc.

Mẫu rong khô Ďược xử lý ở nhiệt Ďộ phòng với hỗn hợp MeOH-CHCl3- H2O = 4:2:1(v/v) Ďể loại bỏ các chất màu, lọc, rửa với acetone, sấy khô thu Ďược mẫu rong Ďã khử chất béo. Mẫu rong Ďã khử chất béo Ďược khuấy trộn với dung dịch CaCl2 2% (3 lần) tại 850C trong 5giờ, thu lấy phần dịch chiết và thêm vào dịch chiết này dung dịch hexadecyltrimethyl-ammoniumbromide nồng Ďộ 10%. Tủa tạo thành Ďược li tâm, rửa với nước, khuấy với dung dịch NaI nồng Ďộ 20% trong cồn (5 lần) trong vòng 2-3 ngày ở nhiệt Ďộ phòng, rửa với cồn và hòa tan lại trong nước. Dung dịch Ďược thẩm tách và Ďông khô thu Ďược fucoidan thô dạng muối natri. Quy trình Ďược tổng quát trên Sơ Ďồ 1.1.

Sơ đồ 1.1. Sơ đồ ết t v t ế u

Trong thời gian gần Ďây, các nước phát triển trên thế giới hướng Ďến việc nghiên cứu về mối quan hệ cấu trúc - hoạt tính của các ionic polysaccharide [45], [54], [99]. Các nghiên cứu tập trung giải quyết mối quan hệ giữa các yếu tố cấu trúc

1. Ly tâm 2. H2O Cắn chứa fucoidan Rong khô CH3OH:CHCl3:H2O = 4:2:1 Nhiệt Ďộ phòng Bã lọc Dịch lọc chứa các chất màu

Làm khô chân không Rong Ďã loại chất béo

CaCl2 2% (x 3) Khuấy ở 85 °C (8 giờ) Dịch chiết tổng CH3(CH2)15N(Br)(CH3)3 (10%) 1. C2H5OH 2. H2O Tủa Fucoidan thô ethanol NaI 20% (x 5) 2–3 ngày, nhiệt Ďộ phòng Dịch 1. Thẩm tách 2. Đông khô Na fucoidan

trong Ďó quan tâm Ďến các nhóm chức trên mạch polymer (hàm lượng, vị trí của chúng) và tính chất của polymer.

Một số nhà khoa học Ďã tách fucoidan thành 12 phân Ďoạn có khối lượng phân tử khác nhau và khảo sát hoạt tính ức chế bổ thể (bổ thể là một nhóm protein huyết thanh, gồm 9 thành phần, không bền nhiệt bị phá hủy ở nhiệt Ďộ trên 56o

C). Kết quả cho thấy hoạt tính này lớn nhất khi khối lượng phân tử 13.500Da Ďến 40.000Da [130].

Năm 2002, Jang-Su Park, Andre Kim và các cộng sự [95] Ďã khảo sát sự biến Ďổi hoạt tính kháng ung thư của fucoidan khử sulfate, fucoidan tự nhiên (23,5% sulfate) và fucoidan sulfate hóa (53,3% sulfate). Kết quả cho thấy fucoidan sulfate hóa có khả năng kháng ung thư mạnh hơn fucoidan tự nhiên rất nhiều.

Alginate có ở thành tế bào của rong nâu dưới dạng các muối calci, magie và natri. Các muối calci và magie không tan trong nước. Một số tác giả cho rằng, một số alginate có tác dụng chống Ďông tụ máu. Tuy nhiên, cơ chế chống Ďông tụ máu chưa rõ ràng. Theo Fan và cộng sự [58], sự khác biệt trong khả năng chống Ďông tụ máu của alginate có thể liên quan Ďến hàm lượng sulfate và trọng lượng phân tử. Hơn nữa, nhóm anion trong alginate sẽ có hiệu ứng chống Ďông tụ máu. Trọng lượng phân tử khác nhau và thành phần Ďường trung lập cũng sẽ Ďóng vai trò trong quá trình chống Ďông tụ máu.

Nguyên tắc chung của quy trình phân lập là alginate ở trong rong nâu phần lớn dưới dạng muối của ion hóa trị hai không hòa tan như Ca++, Mg++. Cần phải xử lý acid Ďể chuyển hóa alginate sang dạng acid alginic. Sau Ďó lọc sạch cặn bã rong không tan, Ďun với natri carbonat Ďể chuyển hóa acid alginic về natri alginate ta sẽ thu Ďược phần dịch chứa natri alginate. Có hai con Ďường thu hồi alginate khác nhau bởi quá trình tách nước: một quy trình tách alginate ở dạng muối và Ďược tách ra khỏi nước, một quy trình tách alginate ở dạng gel acid alginic kết tủa. Như vậy cả hai quy trình chỉ khác nhau căn bản có một khâu calci hóa. Sở dĩ khâu calci hóa Ďược dùng thêm là vì calci alginate dễ ép tách nước hơn là acid alginic [119].

Con Ďường thứ nhất là thêm acid Ďể tạo thành gel acid alginic không tan trong nước và tách nó ra khỏi nước. Acid alginic Ďược tách ra dưới dạng gel mềm và một

phần lượng nước cần phải Ďược loại khỏi chúng. Sau công Ďoạn này cồn Ďược Ďưa vào acid alginic, tiếp theo là natri carbonat Ďể chuyển hóa acid alginic về natri alginate. Natri alginate không hòa tan trong hỗn hợp cồn-nước nên có thể tách chúng ra khỏi hỗn hợp, làm khô, nghiền Ďến kích thước hạt thích hợp phụ thuộc vào từng ứng dụng riêng của nó.

Con Ďường thứ 2 thu hồi natri alginate là thêm vào dung dịch chiết ban Ďầu một muối calci. Nó tác dụng tạo thành gel calci alginate có kết cấu dạng sợi, không hòa tan trong nước và có thể tách ra khỏi chúng. Calci alginate tách ra nằm lơ lửng trong nước và acid Ďược thêm vào Ďể chuyển hóa thành acid alginic. Acid alginic dạng sợi này Ďược tách ra rất dễ và Ďặt vào trong một máy trộn hình cầu với cồn và natri carbonat Ďược Ďưa từ từ vào bột nhão cho Ďến khi tất cả acid alginic Ďược chuyển hóa về natri alginate, bột natri alginate Ďôi khi còn Ďược ép thành những viên nhỏ sau Ďó sấy và nghiền mịn.

Để chiết rút alginate, rong biển Ďược cắt nhỏ và khuấy với một dung dịch kiềm nóng (thường là natri carbonat) tại nhiệt Ďộ 60-70oC trong khoảng 2-2,5 giờ thu Ďược một huyền phù Ďặc. Các cặn không tan Ďược loại bỏ khỏi dung dịch bằng cách lọc. Vì dung dịch quá Ďặc, có Ďộ nhớt rất cao nên Ďể có thể lọc Ďược cần phải pha loãng nó với một lượng lớn nước. Sau khi pha loãng với nước, dung dịch Ďược ép qua một lớp vải lọc trong một máy ép lọc. Trước khi bắt Ďầu lọc cần phải Ďưa bột trợ lọc diatomite vào, bột trợ lọc này sẽ giữ lại hầu hết các hạt mịn khỏi bề mặt của vải lọc và làm thuận tiện cho việc lọc [66].

Tuy nhiên, trong công nghệ chiết rút alginate từ rong biển ngày nay cũng Ďã có một số cải tiến. Chẳng hạn người ta Ďã phát hiện ra rằng các loài rong

Alginophytes ngoài alginate, fucoidan và laminaran chúng còn có chứa một lượng lớn acid mannuronic có hoạt tính kích thích hệ miễn dịch, vì vậy Ďã xuất hiện công nghệ chiết rút alginate kết hợp với việc thu hồi một lượng Ďáng kể mannuronic, bằng cách thay Ďổi pH phù hợp với quá trình xử lý trước khi chiết [133].

Năm 2005, các nhà khoa học Thái Lan [55] Ďã Ďưa ra một quy trình công nghệ phức hợp chiết rong nâu cho phép thu nhận Ďồng thời các chế phẩm riêng biệt, Ďó là các acid (alginic, polymannuronic), các polysaccharide trung tính (fucoidan,

laminaran) và các chế phẩm làm giàu của các chất có hoạt tính sinh học trọng lượng phân tử thấp. Quy trình bao gồm các bước sau:

1) Xử lý rong với cồn Ďể thu nhận các hợp chất trọng lượng phân tử thấp tan trong cồn và bã rong không tan.

2) Tách phân Ďoạn cồn.

3) Phân Ďoạn cồn Ďược cho bay hơi Ďể thu dịch làm giàu chứa các hợp chất trọng lượng phân tử thấp có hoạt tính sinh học.

4) Chiết bã rong Ďầu tiên với dung dịch nước ở pH<6, Ďể thu Ďược dịch chiết lần Ďầu với nước và bã rong lần 2 không tan.

5) Cô Ďặc dịch chiết nước lần 1 và chỉnh pH dung dịch chiết về 5-8 ta nhận Ďược phân Ďoạn chứa hỗn hợp laminaran và fucoidan, tủa với cồn sau Ďó tách riêng fucoidan và laminaran.

6) Chiết bã rong lần 2 với nước. Cô Ďặc dung dịch chiết lần 2 và sấy khô ta thu Ďược phân Ďoạn polysaccharide thứ 2 chứa hỗn hợp laminaran, fucoidan và acid polymannuronic. Chỉnh pH về 2,5 Ďể kết tủa acid mannuronic còn lại fucoidan và laminaran tan trong nước. Trung hòa dung dịch còn lại sau khi tách tủa với cồn ta thu Ďược phân Ďoạn polysaccharide có chứa fucoidan và laminaran.

7) Xử lý bã rong lần 3 với NaHCO3 sau Ďó kết tủa với cồn ta thu Ďược acid alginic.

Quy trình chung Ďể chiết alginate từ rong biển như sau:

Rong sau khi thu hái, mẫu Ďược rửa dưới vòi nước máy Ďể loại muối, cát và phơi khô trong bóng râm. Cắt nhỏ nghiền thành bột nhỏ Ďóng gói vào bao nilon và bảo quản ở nhiệt Ďộ phòng nơi khô ráo. Bột rong này Ďược thêm formaldehyde 2%, khuấy Ďều, duy trì hỗn hợp trong vòng 24h tại nhiệt Ďộ phòng. Tiếp Ďó lọc Ďể thu hồi bã rửa sạch lại bằng nước cất và cho thêm HCl 0,2 M vào bã trên, Ďể trong vòng 24h.

Sau Ďó lọc và rửa sạch lại bằng nước cất. Cho dung dịch Na2CO 2% vào bã Ďến pH =8, Ďun sôi trong khoảng thời gian 3h. Vẩy li tâm trong khoảng thời gian 30

Một phần của tài liệu Nghiên cứu cấu trúc và khảo sát hoạt tính sinh học của fucoidan và alginate từ hai loài rong nâu sargassum henslowianum và sargassum swartzii của việt nam (1) (Trang 33)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(128 trang)