2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của Ďề tài là fucoidan và alginate phân lập Ďược từ các mẫu rong thu thập tại các vùng biển của Việt Nam, cụ thể như sau:
+ Fucoidan từ rong nâu Sargassum henslowianum thu thập tại bán Ďảo Sơn Trà - Thừa Thiên - Huế.
+ Fucoidan từ rong nâu Sargassum swartzii thu thập tại vịnh Nha Trang. + Alginate từ rong nâu Sargassum swartzii thu thập tại vịnh Nha Trang.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Để Ďạt Ďược các mục tiêu Ďề ra của luận án, các phương pháp nghiên cứu Ďược sử dụng là:
Chiết tách các ionic polysaccharide từ rong biển bằng các phương pháp chiết tách thông thường, tham khảo các công bố trên thế giới Ďể Ďưa ra một phương pháp chiết tách tối ưu, phù hợp với Ďối tượng và mục Ďích nghiên cứu của luận án.
Phương pháp chính Ďể xác Ďịnh thành phần và cấu trúc của các polysaccharide là kết hợp các phương pháp sắc ký (GC, LC), phương pháp hóa học và phổ hiện Ďại (NMR, IR, MS, LS, SAXS).
Thử hoạt tính sinh học: khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật, hoạt tính gây Ďộc tế bào hay hoạt tính hạ mỡ máu của ionic polysaccharide chiết tách Ďược bằng cách tham khảo các phương pháp Ďã công bố trên thế giới và quy trình cụ thể tại Việt Nam.
Trong nghiên cứu cấu trúc của các ionic polysaccharide, các vấn Ďề sau cần Ďược làm sáng tỏ:
Thành phần Ďịnh tính và Ďịnh lượng, tức là loại và số lượng monosacharide, cấu hình tuyệt Ďối (D hoặc L) và loại vòng (pyranose hoặc furanose).
Cấu hình của liên kết glycoside ( hoặc ) Vị trí của liên kết glycoside
Trật tự sắp xếp của dãy monosacharide (chuỗi liên kết). Vị trí và hàm lượng của nhóm thế
Cấu trúc không gian của phân tử polysaccharide (hình cầu, hình trụ, hình xoắn hay hình sợi)
2.2.1. Phƣơng pháp IR trong nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide [85]
Ngày nay, phương pháp phổ hồng ngoại là phương pháp vật lý Ďược sử dụng rộng rãi trong phân tích cấu trúc nói chung và phân tích cấu trúc các ionic polysaccharide nói riêng [27]. Phương pháp này mang Ďến những thông tin cấu trúc quan trọng Ďể xác Ďịnh vị trí nhóm chức trong phân tử ionic polysaccharide.
Mặc dù việc sử dụng phương pháp phổ hồng ngoại Ďặc biệt hiệu quả khi xác Ďịnh vị trí của nhóm sulfate trong cấu trúc của polysaccharide nhưng chúng vẫn còn một số hạn chế nhất Ďịnh, Ďó là không xác Ďịnh Ďược dạng hỗn hợp monosaccharide, vị trí liên kết của vòng glycoside cũng như sự khác nhau giữa hai Ďồng phân quang học D, L của các gốc Ďường.
2.2.2. Phƣơng pháp NMR trong nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide [47]
Phổ 1
H-NMR của polysaccharide có thể khẳng Ďịnh Ďộ tinh khiết của mẫu (không có mặt của các tín hiệu các oligonucleotide, protein hay lipid). Phổ cũng có thể cho biết số monosaccharide thực từ số các cộng hưởng proton anomer thông qua các tín hiệu trong khoảng 4,4 Ďến 5,8 ppm. Như vậy dựa vào tỷ lệ tích phân tương Ďối của các cộng hưởng anomer cũng có thể Ďánh giá tỷ lệ phân tử của các monosaccharide. Về mặt này kết quả phân tích hoá học có thể phù hợp với kết quả phân tích 1H-NMR. Nhìn chung, kết quả tính tích phân NMR là chính xác hơn so với kết quả phân tích hoá học [9], [27]. Nhiều nhóm thế có thể Ďược xác Ďịnh hoặc sự có mặt của chúng Ďược dự Ďoán dựa vào phổ 1D 1H-NMR. Tiếp theo, số lượng chính xác của các monosaccharide có thể Ďược khẳng Ďịnh chính xác nhờ vào việc khảo sát vùng anomer của phổ 2 chiều dị hạt nhân 1H-13C-HSQC.
Độ dịch chuyển hoá học của proton anomer (4,4 – 5,8ppm) Ďược tách biệt một cách không hoàn toàn rõ rệt khỏi các cộng hưởng 1H ở các vị trí khác (3,2 – 4,5ppm) trong khi Ďộ dịch chuyển 13
C anomer (95 – 110 ppm) lại tách biệt rất rõ, không hề trùng chập với các cộng hưởng 13C ở các vị trí còn lại (60 – 85ppm).
Dạng vòng (hexose hay furanose) và các cấu hình anomer Ďược suy ra từ các thông tin kết hợp có giá trị từ Ďộ dịch chuyển hoá học 1H (H cộng hưởng giữa 5,0 và 5,8 ppm trong khi H cộng hưởng trong khoảng 4,4 và 4,8 ppm) với hằng số tương tác vô hướng của C-1, H-1 (1
JC-1, H-1 165-175 Hz Ďối với trong khi 1JC-1, H-1
158-165 Hz Ďối với ). Tương tác dị hạt nhân liên kết 1JC-1,H-1 có thể thu Ďược từ phổ 1 H – 13C HSQC không khử tương tác. B 2.1. Độ uyể ị δ(pp ) t ơ sở ữ u SUGABASE glucose và galactose [109] Monosaccharide H-1 C-1 H-2 C-2 H-3 C-3 H-4 C-4 H-5 C-5 H-6a C-6 H-6b -D-Glcp 5,11 0,30 97,5 4.5 3.520,06 72,51,0 3,760,10 73,80,4 3,410,05 70,70,6 3,740,10 72,90,5 3,640,16 61,40,4 3,780,08 -D-Glcp 4,840,46 102,92,4 3,310,05 74,11,1 3,550,07 76,31,4 3,510,13 70,41,0 3,550,09 76,01,3 3,770,05 61,51,0 3,940,05 -D-Galp 5,160,35 99,13,1 3,890,12 68,91,3 3,930,16 70,21,7 4,120,19 68,61,9 4,110,29 71,02,0 3,730,07 61,70,8 3,730,04 -D-Galp 4,680,26 103,52,4 3,530,17 71,72,1 3,800,16 73,51,7 4,080,18 67,92,0 3,740,20 75,51,1 3,740,05 61,80,7 3,740,05
Các vị trí Ďược thế của monosaccharide Ďược gọi là vị trí aglycon tương ứng với các nguyên tử C ở các vị trí không phải anomer của liên kết glycoside. Từ dữ liệu NMR, vị trí liên kết Ďược suy ra dựa trên sự tăng mạnh (> + 3ppm) về Ďộ dịch chuyển hoá học của 13C so với Ďộ dịch chuyển hoá học của các monomer không thế. Việc phân tích này cũng mang lại thông tin giống với những phân tích khi methyl hoá. Trật tự các Ďơn phân trong mạch của polysaccaride Ďược xác Ďịnh chính là
chuỗi các liên kết glycoside, thể hiện thông tin cấu trúc chính cần xác Ďịnh thu Ďược từ hai loại phổ HMBC và NOESY.
2.2.3. Phƣơng pháp phổ khối lƣợng trong nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide polysaccharide
Cho Ďến tận những năm Ďầu của thập kỷ 80, việc làm thế nào Ďể phân tích các hợp chất cao phân tử bằng phương pháp phổ khối và làm cho khối phổ trở thành detector mạnh trong kỹ thuật phân tích lỏng vẫn còn là một thách thức [10]. Nguyên nhân chủ yếu là do các nhà khoa học bị giới hạn bởi ý tưởng cho rằng một chất phải luôn cho hoá hơi các phân tử trước rồi sau Ďó mới ion hoá chúng. Hơn nữa năng lượng cần thiết Ďể giải phóng các phân tử chủ yếu Ďược cung cấp từ nhiệt và các phân tử chứa các “nhóm phân cực” cần Ďược biến Ďổi hoá học Ďể có thể hoá hơi Ďược. Một thời gian dài, Ďối với các polysaccharide nói chung và các ionic polysaccharide nói riêng, phương pháp khối phổ chỉ có thể Ďược áp dụng sau khi Ďã có sự chuyển hoá hoá học. Trước hết mẫu Ďược thuỷ phân Ďể tạo thành các mono hoặc disaccharide, sau Ďó các tiểu phân này cần Ďược methyl hoá Ďể có thể phân tích bằng GC/MS [117]. Quá trình phân tích Ďòi hỏi nhiều thực nghiệm, tiêu tốn thời gian và hoá chất, trong khi kết quả thu Ďược chỉ cho biết gián tiếp về các Ďơn phân hình thành nên mạch mà không cung cấp nhiều thông tin về trật tự liên kết, do các Ďơn phân Ďã Ďược methyl hoá nên có thể thông tin về nhóm thế của Ďơn phân sẽ bị mất Ďi. Chính vì thế phương pháp MS sử dụng kĩ thuật ion hoá thông thường và chùm electron EI không phát huy sức mạnh Ďối với các mẫu polysaccharide.
Cuối những năm 80, vướng mắc về kĩ thuật ion hoá Ďối với các Ďại phân tử Ďã Ďược giải quyết nhờ sự ra Ďời gần như Ďồng thời của 2 kĩ thuật: ESI (Electro Spray Ionisation) và MALDI (Matrix-Assited Laser Desorption Ionisation). Đây là bước nhảy vọt về mặt kĩ thuật Ďã Ďưa khối phổ thành một công cụ mạnh trong nghiên cứu các phân tử sinh học lớn, và nó Ďã Ďược trao giải Nobel 2002 cùng với những thành tựu về cộng hưởng từ hạt nhân. Một ưu Ďiểm của kĩ thuật ESI là Ďối với những phân tử lớn có nhiều trung tâm Ďiện tích thì tỉ lệ khối lượng/Ďiện tích trở nên Ďủ nhỏ Ďể cho phép chất có thể Ďược phân tích bằng các máy khối phổ thông thường.