ĐỀ TÀI: Thử nghiệm chuyển gen GFP trên gà (gallus gallus domesticus) sử dụng vector pt2 BH CVpf SB11

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Nguyễn Thị Hồng Hạnh Cao học K17 – Sinh học 1 PHẦN MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Việc nâng cao năng suất, cải tiến tiềm năng di truyền là vấn đề hàng đầu trong phát triển nông nghiệp nói chung và chăn nuôi nói riêng. Tuy nhiên, trong công tác cải tạo giống cổ truyền chủ yếu sử dụng phương pháp lai tạo và chọn lọc để cải tạo nguồn gen của vật nuôi nên còn tồn tại nhiều hạn chế (con lai thu được qua lai tạo và chọn lọc vẫn còn mang cả các gen không mong muốn…). Vậy, một câu hỏi đặt ra là làm sao để tạo được những giống vật nuụi cú năng suất cao, phẩm chất tốt và những giống vật nuôi mang nhưng gen mong muốn (gen mã hóa những protein dược liệu quý, gen có khả năng chống chịu tốt ) [2],[9]? Gần đây, nhờ những thành tựu trong lĩnh vực ADN tái tổ hợp, công nghệ chuyển gen ra đời đã cho phép khắc phục những trở ngại nói trên. Nó cho phép chỉ đưa những gen mong muốn vào vi sinh vật, thực vật và động vật để tạo ra những giống sinh vật có đặc tính mới. Việc chuyển gen không chỉ dừng lại ở việc sử dụng nguồn gen cùng loài mà còn có thể đưa gen của loài này vào loài khác. Kể từ những năm 1970, các nhà khoa học đã có thể chuyển một gen lạ vào vi khuẩn và bắt nó biểu hiện. Ở động vật, quá trình chuyển gen tương đối phức tạp nhưng trong những năm gần đây cũng đã thu được nhiều thành tựu đáng kể. Trong hướng này các nhà nghiên cứu tập trung vào những mục tiêu: tạo ra động vật chuyên sản xuất protein quý phục vụ y học; tạo ra động vật có sức chống chịu tốt, có tốc độ lớn nhanh, hiệu suất sử dụng thức ăn cao, cho năng suất cao và chất lượng sản phẩm tốt Ðộng vật chuyển gen còn được sử dụng làm mô hình thí nghiệm nghiên cứu các bệnh ở người để nhanh chóng tìm ra các giải pháp chẩn đoán và điều trị các bệnh hiểm nghèo như ung thư, AIDS, Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Nguyễn Thị Hồng Hạnh Cao học K17 – Sinh học 2 thần kinh, tim mạch Việc tạo ra các động vật chuyển gen đã trở thành một khía cạnh nghiên cứu trung tâm trong lĩnh vực sinh sản động vật và tạo giống vật nuôi [2],[11]. Với những ưu điểm nổi bật, công nghệ tạo động vật chuyển gen đã, đang và sẽ tạo ra các tiềm năng phát triển vô cùng to lớn trong nhiều lĩnh vực của đời sống xã hội. Trước các ứng dụng đa năng của sinh vật chuyển gen nói chung và động vật chuyển gen nói riêng, nhiều quốc gia trên thế giới đã chú trọng đầu tư nghiên cứu và phát triển sinh vật chuyển gen. Trên cơ sở công nghệ ADN tái tổ hợp, ngành chăn nuôi đang đứng trước những cơ hội thay đổi có tính cách mạng. Ngày nay người ta có thể tạo ra những động vật mang các đặc tính kỳ diệu mà bằng phương pháp lai tạo bình thường không thể thực hiện được. Quá trình chuyển gen ở động vật đã được tiến hành thành công trên nhiều đối tượng khác nhau như chuột, cá, thỏ, lợn, cừu, bò Đặc biệt, ở gà, do cấu tạo và sinh lý có nhiều ưu thế để tiến hành chuyển gen nờn đó có nhiều thí nghiệm chuyển gen thành công với tỉ lệ cao, rất thuận lợi cho việc cải thiện tính hiệu quả của hệ thống chuyển gen một cách trực tiếp. Đõy chớnh là đối tượng tuyệt vời để sản xuất protein tái tổ hợp trong trứng. éõy là một bước quan trọng để tiến đến mục tiêu nhân giống gà mái có thể đẻ những “quả trứng vàng” mang protein dược phẩm [32]. Ở Việt Nam cũng đã có nhiều nghiên cứu trong lĩnh vực tạo động vật chuyển gen và cũng bắt đầu đạt được những thành công đáng khích lệ. Tuy nhiên, ở nước ta, việc tạo động vật chuyển gen vẫn còn là vấn đề chưa được nghiên cứu sâu. Việc nghiên cứu mới được bắt đầu vài năm gần đây và mới thực hiện được ở trên đối tượng là cá. Đó mới chỉ là những nghiên cứu bước đầu, chúng ta cần có những nghiên cứu với quy mô sâu rộng hơn để có thể Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Nguyễn Thị Hồng Hạnh Cao học K17 – Sinh học 3 đưa những động vật chuyển gen vào sản xuất. Hiện nay, ở Việt Nam chưa có công trình nào công bố về chuyển gen thành công tạo gia cầm chuyển gen. Chớnh vì những lí do trên, chúng tôi chọn đề tài “Thử nghiệm chuyển gen GFP trên gà (Gallus Gallus Domesticus) sử dụng vector pT2/BH- CVpf-SB11 bằng phương pháp chuyển gen qua tinh trùng và vi tiêm vào phôi gà 0 giờ ấp” làm đề tài nghiên cứu của mình. 2. Mục đích nghiên cứu - Thiết lập quy trình chuyển vector pT2/BH-CVpf-SB11 vào phôi gà 0 giờ ấp. - Đánh giá khả năng phát triển của phôi được tiêm vector pT2/BH- CVpf-SB11 - Ấp nở thành công trứng gà đó tiờm vector pT2/BH-CVpf-SB11 - Hoàn thiện phương pháp chuyển gen qua tinh trùng gà - So sánh được hiệu quả chuyển gen của phương pháp vi tiêm vào phôi 0 giờ ấp và phương pháp chuyển gen qua tinh trùng gà. - Đánh giá được sự biểu hiện của gen chuyển ở các giai đoạn phát triển khác nhau của phôi gà và gà sau khi nở. - Đánh giá được sự biểu hiện của gen chuyển ở cỏc mụ khác nhau của gà con ở các giai đoạn phát triển khác nhau. Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Nguyễn Thị Hồng Hạnh Cao học K17 – Sinh học 4 PHẦN NỘI DUNG Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. CHUYỂN GEN Ở ĐỘNG VẬT Sự ra đời của công nghệ sinh học và kỹ thuật chuyển gen đã tạo ra một bước phát triển mới cho nền nông nghiệp thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng. Chuyển gen là việc di chuyển các gen từ cấu trúc di truyền ban đầu gọi là thể cho (donor) tới một cấu trúc di truyền khác có khả năng dung nạp gen gọi là thể nhận (recipient) thông qua một vector [9]. Ðộng vật chuyển gen là động vật có gen ngoại lai (gen chuyển) xen vào trong ADN genome của nó. Gen ngoại lai này phải được truyền lại cho tất cả mọi tế bào, kể cả các tế bào mầm. Việc chuyển gen ngoại lai vào động vật chỉ thành công khi các gen này di truyền lại cho thế hệ sau [2]. Với những ưu điểm nổi bật, công nghệ tạo động vật chuyển gen đã, đang và sẽ tạo ra các tiềm năng phát triển vô cùng to lớn trong nhiều lĩnh vực của đời sống xã hội. Trước các ứng dụng đa năng của sinh vật chuyển gen chung và động vật chuyển gen nói riêng, nhiều quốc gia trên thế giới đã chú trọng đầu tư nghiên cứu và phát triển sinh vật chuyển gen. 1.1.1. Quy trình tạo động vật chuyển gen Ở động vật, những nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc tạo ra các thế hệ động vật mới cho năng suất cao, phẩm chất tốt, tăng khả năng chống chịu bệnh tật, có khả năng sản xuất được các loại protein quý hiếm rất cần trong trị liệu Quy trình tạo động vật chuyển gen thể hiện qua hình 1.1, gồm các bước sau: Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Nguyễn Thị Hồng Hạnh Cao học K17 – Sinh học 5 Hình 1.1: Sơ đồ quy trình tạo động vật chuyển gen [2] - Tách chiết, phân lập gen mong muốn và tạo tổ hợp gen biểu hiện trong tế bào động vật - Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen Ở động vật có vú thì giai đoạn biến nạp gen thích hợp nhất là trứng ở giai đoạn tiền nhân. Ở giai đoạn này, tổ hợp gen lạ có cơ hội xâm nhập vào genome của hợp tử và phân chia cho các tế bào con làm tăng khả năng mang gen của tế bào sinh dục. - Chuyển gen vào động vật Hiện nay có nhiều phương pháp khác chuyển gen nhau đang được sử dụng để tạo động vật chuyển gen: vi tiêm, chuyển gen bằng cách sử dụng các tế bào gốc phôi, chuyển gen bằng cách sử dụng vector virus, xung điện, chuyển gen qua tinh trùng, chuyển gen vào trứng mới thụ tinh (hình 1.2) - Nuôi cấy phôi trong ống nghiệm và chuyển vào tử cung cơ thể mẹ (đối với động vật bậc cao) - Kiểm tra động vật được sinh ra từ phôi chuyển gen - Tạo nguồn động vật chuyển gen một cách liên tục [2]. Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Nguyễn Thị Hồng Hạnh Cao học K17 – Sinh học 6 Hình 1.2: Một số phương pháp chuyển gen ở động vật [2] A: Chuyển gen nhờ retovirus; B: Chuyển gen bằng phương pháp vi tiêm 1.1.2. Ứng dụng của động vật chuyển gen a. Trong nghiên cứu cơ bản Chuyển gen là một công cụ lý tưởng cho việc nghiên cứu thuộc nhiều lĩnh vực của y - sinh học. Trong sinh học phân tử, động vật chuyển gen được sử dụng để phân tích sự điều hoà biểu hiện của gen để đánh giá một biến đổi di truyền đặc biệt ở mức độ toàn bộ cơ thể động vật. Ðộng vật chuyển gen còn được sử dụng để nghiên cứu trong di truyền học phát triển ở động vật có vú [2]. b. Trong nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm Công nghệ chuyển gen động vật ra đời đã cho phép khắc phục những trở ngại của phương pháp cải tạo giống cổ truyền để tạo ra các động vật biểu hiện các tính trạng mong muốn trong một thời gian ngắn hơn và chính xác A B Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Nguyễn Thị Hồng Hạnh Cao học K17 – Sinh học 7 hơn. Mặt khác, nó cho các nhà chăn nuụi một phương pháp hiệu quả để tăng sản lượng, tăng năng suất và khả năng chống chịu bệnh tật. Các nhà khoa học đã tạo ra các vật nuôi chuyển gen có tốc độ lớn nhanh, hiệu suất sử dụng thức ăn cao, cho năng suất cao (nhiều thịt, nhiều sữa, nhiều trứng ), chất lượng sản phẩm tốt (nhiều nạc, ít mỡ, sữa chứa ít cholesterol ) và có khả năng kháng bệnh [24],[30]. Năm 1985, giáo sư Zuoyan Zhu và nhóm nghiên cứu của ụng đó chuyển được gen hormone sinh trưởng người vào cá. Theo Zhu thì thế hệ F 1 của cỏ đó được chuyển gen này lớn gấp hai lần so với cá đối chứng (hình 1.3) [2]. Hình 1.3: Cá chép (Common carp) chuyển gen hormone sinh trưởng [2]. c. Trong y học Động vật chuyển gen được sử dụng trong công nghệ cấy ghép cơ quan cho các bệnh nhân mắc các bệnh như tim, gan, thận… Ðộng vật chuyển gen còn được sử dụng làm mô hình thí nghiệm nghiên cứu các bệnh ở người để nhanh chóng tìm ra các giải pháp chẩn đoán và điều trị các bệnh hiểm nghèo như ung thư, AIDS, thần kinh, tim mạch [19] Liệu pháp gen người bao gồm cả việc thêm một bản sao gen bình thường (gen chuyển) vào genome của một người mang các bản sao gen có thiếu sót để chữa các bệnh di truyền ở người. Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Nguyễn Thị Hồng Hạnh Cao học K17 – Sinh học 8 Trong kỹ nghệ dược phẩm, động vật chuyển gen được sử dụng để sản xuất protein dược phẩm, thuốc chữa bệnh (hình 1.4) [2],[24]. Hình 1.4: Sơ đồ quy trình tạo động vật chuyển gen sản xuất protein thông qua tuyến sữa [2]. 1.1.3. Khả năng ứng dụng tại Việt nam Động vật chuyển gen đã và đang trở thành một xu hướng nghiên cứu và phát triển. Việc nghiên cứu và tạo động vật chuyển gen để tạo ra các dược phẩm, sản xuất các protein quý và các sản phẩm của chúng đang thực hiện ở nhiều nước trên thế giới. Việc chuyển gen vào động vật hiện nay đang gặp những rào cản về pháp lý và đạo đức. Nhiều người lo sợ rằng tạo động vật chuyển gen đe dọa phá vỡ sự cân bằng hệ sinh thái hoặc động vật chuyển gen có khả năng sinh sản thấp, nếu lai với động vật tự nhiên có thể làm giảm khả năng sinh sản, giảm số lượng, đe dọa sự tồn tại của loài. Một số trường hợp Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Nguyễn Thị Hồng Hạnh Cao học K17 – Sinh học 9 động vật chuyển gen có khả năng kháng bệnh kém hoặc có biểu hiện bệnh lý. Khả năng trôi dạt của những dòng gen có thể gây ra hiểm hoạ đối với môi trường sinh thái. Bên cạnh đó, khi sử dụng retrovirus làm vector có thể sẽ nảy sinh những nguy cơ không thể lường trước được (loại virus thường chứa gen gây ung thư). Thêm vào đó, động vật chuyển gen sử dụng làm thực phẩm cũng không đạt được sự ủng hộ của công chúng [9],[19]. Ở Việt Nam, những nghiên cứu về áp dụng công nghệ sinh học và đặc biệt là công nghệ gen được phát triển khá mạnh mẽ trong những năm gần đây. Nghiên cứu chuyển gen đã được tiến hành ở nhiều cơ sở nghiên cứu như Viện Di truyền nông nghiệp, Viện Công nghệ sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, Trung tâm Công nghệ sinh học - Đại học quốc gia Hà Nội…. Ở động vật, những nghiên cứu chuyển gen mới được bắt đầu và chủ yếu thực hiện ở cá chạch, cá vàng với tổ hợp gen hormone sinh trưởng bằng vi tiêm. Ở Việt Nam, chưa có công trình nào công bố thực hiện thành công việc chuyển gen vào gia cầm và động vật có vú. Tuy nhiên, các kỹ thuật liên quan đến việc tạo động vật chuyển gen thỡ đó được tiếp cận và thực hiện ở một số cơ sở nghiên cứu. Với điều kiện cơ sở vật chất và con người ở các cơ quan nghiên cứu ở nước ta, việc kết hợp nghiên cứu để tiến hành chuyển gen vào động vật có vú là hoàn toàn có thể thực hiện được [2],[19]. 1.2. CHUYỂN GEN Ở GÀ Công nghệ chuyển gen ở gà mới phát triển trong những năm gần đây, trong khi công nghệ chuyển gen ở động vật có vú đã phát triển từ trước đó một thời gian dài. Chuyển gen ở gia cầm nói chung và gà nói riêng là vô cùng phức tạp và khó khăn. Tuy nhiên, gà lại là đối tượng có nhiều tiềm năng cho công nghệ chuyển gen. Tại sao các nhà khoa học lại chọn gà làm đối tượng chuyển gen? Để hiểu được những lợi thế của mô hình gà chuyển gen, chúng ta sẽ tìm hiểu sự phát triển của phôi gà và sinh lý sinh dục gà. Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Nguyễn Thị Hồng Hạnh Cao học K17 – Sinh học 10 1.2.1. Sự phát triển của phôi gà 1.2.1.1. Sự phát triển phôi trước khi đẻ 1.2.1.1.1. Thụ tinh Quá trình thụ tinh xảy ra ở phần trên của ống dẫn trứng. Khi trứng rụng được hứng vào phễu của ống dẫn trứng. Tại đây, tinh trùng đến và xâm nhập vào tế bào trứng. 1.2.1.1.2. Sự phân cắt Hình 1.5: Quá trình phân cắt trứng và tạo phôi nang ở gà [41] Trứng gà thuộc loại đoạn noãn hoàng (teloleciathal) có nghĩa là noãn hoàng tập trung ở cực thực vật của trứng cũn nhõn và tế bào chất tinh khiết ở cực động vật. Phân cắt ở phôi gà là dạng phân cắt đĩa (phân cắt không hoàn toàn) (hình 1.5). Noãn hoàng không phân cắt và không có cấu tạo tế bào, còn đĩa phôi phân chia tạo thành một cụm hình đĩa các tế bào nhỏ nằm bên trên khối noãn hoàng. Sự phân cắt bắt đầu từ trung tâm của đĩa phôi và cỏc rónh phân cắt dần dần phân chia vùng này ra thành các tế bào [5],[26]. [...]... nguyên thủy và các tế bào tinh trùng đã được phát triển 1.2.4 Lịch sử nghiên cứu gà chuyển gen - Con gà chuyển gen đầu tiên được tạo ra lại theo phương pháp sử dụng vector retrovirus Thông qua sử dụng vector retrovirus (vi rút phiờn mó ngược), trường đại học North Carolina State đã tạo ra được cỏc dũng gà chuyển gen biểu hiện β - galactosidase Vector này được thiết kế bởi Takashi Mikawa [42] - Vào giữa thập... phương pháp chuyển gen qua tinh trùng và chuyển gen nhờ liposome, người ta đã đề xuất phương pháp chuyển gen qua tinh trùng nhờ liposome 1.2.6 Ứng dụng của gà chuyển gen Gà mái và trứng của chúng đang được sử dụng như là các nhà máy sản xuất protein và kháng thể Các nhà khoa học đã tạo ra gà chuyển gen có thể sản xuất protein trong trứng éõy là một bước quan trọng để tiến đến mục tiêu nhân giống gà mái... phôi gà giai đoạn X - Đến năm 2006, Bon Chul Koo và cộng sự đã tạo ra gà khảm dòng sinh biểu hiện protein phát huỳnh quang sử dụng vector MoMLV (moloney murine leukemia virus) được thiết kế dựa trên dựa trên vector retrovirut [47] Tuy nhiên, cho đến nay gà là đối tượng chuyển gen thu được ít thành tựu nhất 1.2.5 Các phương pháp chuyển gen ở gà Về nguyên tắc, các phương pháp tạo ra động vật chuyển gen. .. 2 nu TA trên toàn hệ gen (hình 1.17) [22] Hình 1.17: Cấu trúc và hoạt động của transposon Sleeping beauty (theo Perry et al., 2004 và B.-W Kong, 2008) Vector Transposon Sleeping Beauty (SB) được sử dụng rộng rãi trên nhiều đối tượng, từ cá tới người như một công cụ chuyển gen Nó đó được sử dụng thành công để chuyển gen biểu hiện lâu dài trên chuột và cá ngựa vằn Thêm vào đó, chuyển gen qua vector transposon... cho việc sử dụng các động vật thớ nghiêm [42] - Tạo dòng sản xuất gà thịt [47] Nguyễn Thị Hồng Hạnh 25 Cao học K17 – Sinh học Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm - Nghiên cứu sự phát triển phôi: Hiện nay cỏc phụi gà chuyển gen này được sử dụng như là một mô hình để hiểu được sự phát triển của phôi bình thường và phôi không bình thường Cỏc dũng gà chuyển gen mới này được sử dụng trong... 1.18) Hình 1.18: Elba, thỏ chuyển gen protein huỳnh quang màu xanh lá cây[2] Nguyễn Thị Hồng Hạnh 29 Cao học K17 – Sinh học Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Người ta đã lợi dụng tính phát quang của GFP dùng như một chất đánh dấu rất đặc trưng Gen mó hoỏ cho GFP vì thế được sử dụng như một gen chỉ thị (gen báo cáo) trong công nghệ chuyển gen Các dạng dẫn xuất của GFP (phát ánh sáng có... các gà bình thường với các gà trống và gà mái đã biểu hiện beta-lactamase trong tinh trùng hay trong trứng của chúng Thế hệ con sinh ra đã mang các bản sao của gen beta-lactamase ở trong tất cả các tế bào và các gen chuyển ổn định trong gà [27],[28] - Mo Sun Kwon năm 2004 đã tạo gà chuyển gen biểu hiện protein phát huỳnh quang tăng cường eGFP (Enhanced green fluorescent protein) nhờ sử dụng hệ thống chuyển. .. pháp tạo ra động vật chuyển gen đều có thể áp dụng với gia cầm để tạo ra gia cầm chuyển gen Như đã mô tả ở trên, quá trình sinh lý sinh sản của gia cầm phức tạp, vì thế đối với gia cầm người ta sử dụng các phương pháp chuyển gen với trứng chủ yếu là giai đoạn sau khi đẻ Trong nội dung của luận văn này, chúng tôi sử dụng hai phương pháp là vi tiêm và chuyển gen qua tinh trùng, mỗi phương pháp đều có những... lợi cho các nghiên cứu chuyển gen ở gia cầm với mục đích sản xuất protein dược liệu trong lòng trắng trứng Nguyễn Thị Hồng Hạnh 35 Cao học K17 – Sinh học Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm A B Hình 2.1: Gà Leghorn (A: Gà trống; B: Gà mái) 2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.2.1 Dụng cụ nghiên cứu Dụng cụ cần thiết để làm các TN trong đề tài gồm: Bảng 2.1: Các dụng cụ TN sử dụng trong đề tài STT... thống chuyển gen qua vector retrovirut (hình 1.11) [35] Nguyễn Thị Hồng Hạnh 18 Cao học K17 – Sinh học Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Hình 1.11: Gà chuyển gen GFP có khả năng phát sáng dưới ánh sáng huỳnh quang (trái) bên cạnh gà bình thường (phải) [35] - Năm 2005, Zhu và cộng sự công bố sản xuất thành công lượng lớn kháng thể đơn dòng từ trứng của gà khảm bằng cách chuyển nhiễm . cầm chuyển gen. Chớnh vì những lí do trên, chúng tôi chọn đề tài Thử nghiệm chuyển gen GFP trên gà (Gallus Gallus Domesticus) sử dụng vector pT2/ BH- CVpf-SB11 bằng phương ph p chuyển gen qua. tiêm vector pT2/ BH- CVpf-SB11 - p nở thành công trứng gà đó tiờm vector pT2/ BH -CVpf-SB11 - Hoàn thiện phương ph p chuyển gen qua tinh trùng gà - So sánh được hiệu quả chuyển gen của phương ph p. Chuyển gen vào động vật Hiện nay có nhiều phương ph p khác chuyển gen nhau đang được sử dụng để tạo động vật chuyển gen: vi tiêm, chuyển gen bằng cách sử dụng các tế bào gốc phôi, chuyển gen