Chuyển gen GFP trên Gà (Gallus Gallus domesticus)
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HCM KHOA SINH HỌC Chuyển gen động vật Sinh viên thực 11/3/15 Mai Hữu Phương Nguyễn Duy Hải Ngô Thị Hoài Diễm Lê Thị Thu Trang Nguyễn Thanh Như Lê Thị Hằng Nội dung Quy trình phương pháp chuyển gen động vật 11/3/15 Mô hình chuyển gen gà Thử nghiệm chuyển gen GFP Gà (Gallus Gallus domesticus) 1.1 Quy trình chuyển gen động vật 11/3/15 1.2 Phương pháp chuyển gen động vật Phương pháp vi tiêm Chuyển gen vào tinh trùng Chuyển gen qua liposome Chuyển gen nhờ virus Chuyển gen nhờ sử dụng tế bào gốc Chuyển gen nhờ xung phôi điện 11/3/15 2.1 Giới thiệu Quá trình chuyển gen động vật tiến hành thành công nhiều đối tượng khác Đặc biệt, gà, cấu tạo sinh lý có nhiều ưu để tiến hành chuyển gen Đây đối tượng tuyệt vời để sản xuất protein tái tổ hợp trứng Đây bước quan trọng để tiến đến mục tiêu nhân giống gà mái đẻ “quả trứng vàng” mang protein dược phẩm 11/3/15 2.2 Những thuận lợi khó khăn sử dụng gà làm đối tượng chuyển gen Thuận lợi Thời gian hệ ngắn, tốc độ sinh trưởng nhanh Năng suất trứng cao Kích thước thích hợp Trứng có môi trường vô trùng tự nhiên TP protein đơn giản Sự di cư tế bào mầm 11/3/15 2.2 Những thuận lợi khó khăn sử dụng gà làm đối tượng chuyển gen Khó khăn Trứng gà vừa đẻ ra, phôi bắt đầu phát triển chứa khoảng 40.000-60.000 tế bào Trứng lớn, dễ vỡ khó thao tác Khó tiếp cận giai đoạn phôi sớm chúng 11/3/15 3.1 Đối tượng nghiên cứu Gà Leghorn giống chuyên trứng cao sản giới nay: Sản lượng trứng năm khoảng 250 - 270 Trứng to, nặng 60 - 65 g Tỉ lệ lòng trắng so với lòng đỏ cao Vỏ trứng màu trắng, dễ kiểm tra phôi trứng ấp 11/3/15 3.1 Đối tượng nghiên cứu Gà Leghorn giống chuyên trứng cao sản giới Gà Leghorn đối tượng thuận lợi cho nghiên cứu chuyển gen gia cầm với mục đích sản xuất protein dược liệu lòng trắng trứng 11/3/15 3.2 Vector pT2/BH-CVpf-SB11 Vector transposon Sleeping Beauty (SB) Hệ thống transposon SB chứa gen đơn mã hóa cho enzyme transposase transposon chứa đầu tận lặp lại vị trí liên kết với transposase 11/3/15 10 3.6.1 Phương pháp tách tế bào phôi ngày ấp nuôi cấy nguyên bào sợi Đếm số lượng tế bào Pha loãng huyền phù tế bào 200 lần PBS sau dùng pipet nhỏ giọt lên buồng đếm hồng cầu, đậy lamen Nồng độ tế bào tính theo công thức sau: C - nồng độ tế bào (tế bào/ml dịch mẫu tế bào) n - số lượng tế bào đếm (trong 80 ô nhỏ) 200 - số lần pha loãng mẫu dịch tế bào 4.000.000 - thể tích ô tính cm3 (ml) 80 - tổng số ô đếm 11/3/15 38 3.6.1 Phương pháp tách tế bào phôi ngày ấp nuôi cấy nguyên bào sợi Phá vỡ tế bào Tế bào sau lấy từ giếng nuôi cấy li tâm thu cặn tế bào Tế bào giếng cho vào khoảng 10 dung dịch TE o Để hỗn hợp tế bào TE vào nước 94 C khoảng 10 phút 11/3/15 39 3.6.2 Phương pháp thu nhận DNA từ tế bào hồng cầu nội quan gà Thu nhận DNA từ tế bào hồng cầu Lấy máu gà 10 ngày tuổi Ly tâm với tốc độ 1200 RPM, 15 phút Loại bỏ huyết tương, thu hồng cầu Bổ sung thêm 0,5 ml TE Sau sử dụng kit để tách ADN 11/3/15 40 3.6.2 Phương pháp thu nhận DNA từ tế bào hồng cầu nội quan gà Thu nhận DNA từ nội quan gà Gà khoảng tháng tuổi Tách nội tạng gà (gan, lách, ruột, phổi, tủy xương, tụy…) để riêng vào ống eppendorf có chứa dung dịch PBS Chuyển nội quan sang ống eppendorf có chứa sẵn dung dịch TE, nghiền nát nội quan Sử dụng kit để tách ADN 11/3/15 41 3.7 Phương pháp kiểm tra có mặt DNA ngoại lai 3.7.1 Khuyếch đại PCR Sử dụng kĩ thuật Multiplex PCR với hai cặp mồi đặc hiệu cho eGFP Cặp mồi khuếch đại đoạn ADN có kích thước 418 bp gen eGFP Sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn ADN có kích thước 321 bp gen ribosome 18S gà để chứng minh diện hệ gen gà mẫu thí nghiệm 11/3/15 42 3.7 Phương pháp kiểm tra có mặt DNA ngoại lai 3.7.1 Khuyếch đại PCR Tên mồi Trình tự mồi Nhiệt độ bắt cặp GFPfor 5’ – ACA AGT TCA GCG TGT CCG – 3’ 55,3 GFPrev 5’ – TTC ACC TTG ATG CCG TTC – 3’ 55,2 C O C Cặp mồi khuếch đại đoạn ADN có kích thước 418 bp gen eGFP Tên mồi Trình tự mồi Nhiệt độ bắt cặp 18Sfor 5’ – GTC GGC GTC CAA CTT CTT – 3’ 55,4 18Srev 5’ – CGA TCC GAG GAC CTC ACT – 3’ 55,7 O C C Cặp mồi khuếch đại đoạn ADN có kích thước 321 bp gen ribosome 18S 11/3/15 43 3.2.4 Phương pháp kiểm tra có mặt DNA ngoại lai 3.7.1 Khuyếch đại PCR Thành phần phản ứng PCR sau: 11/3/15 Thành phần Thể tích H2O 13.75 l dNTP (10mM) 0.5 l Buffer 10X for Taq 2l Taq (1 unit/l) 1.5 l eGFP (primer) (10 M) 1l 18S (primer)(10 M) 0.25 l Template Template 1l ∑ ∑ 20 l 44 3.7 Phương pháp kiểm tra có mặt DNA ngoại lai 3.7.1 Khuyếch đại PCR Chu kì nhiệt phản ứng PCR sau: Bước 11/3/15 o Nhiệt độ ( C) 94 94 59 72 Trở lại bước 72 Thời gian phút 30 giây phút 30 giây 35 chu kì phút 60 phút 45 3.7 Phương pháp kiểm tra có mặt DNA ngoại lai 3.7.2 Điện di kiểm tra có mặt DNA ngoại lai Chuẩn bị Gel Agarose 1,5 g agarose + 100 ml dung dịch đệm TBE 1X Đun sôi cho agarose tan hoàn toàn o Để nguội xuống khoảng 50 C đổ dung dịch agarose vào khay cài sẵn lược Sau khoảng 1h gel, gỡ lược đặt gel vào bể điện di Đổ đệm TBE vào bể để dung dịch ngập mặt gel từ - mm 11/3/15 46 3.7 Phương pháp kiểm tra có mặt DNA ngoại lai 3.7.2 Điện di kiểm tra có mặt DNA ngoại lai Tra mẫu DNA Lấy 10 l sản phẩm PCR tra vào giếng gel Chạy điện di hiệu điện 70 V, khoảng thời gian 45 phút Sau đó, tiếp tục chạy hiệu điện 90 V 10 phút 11/3/15 47 3.7 Phương pháp kiểm tra có mặt DNA ngoại lai 3.7.2 Điện di kiểm tra có mặt DNA ngoại lai Nhuộm ADN Ethidium Bromide (EtBr) Bản gel nhẹ nhàng lấy khỏi khuôn cho vào ngâm dung dịch EtBr nồng độ g/ml khoảng 10 phút Sau lấy gel tráng nước quan sát chụp ảnh 11/3/15 48 3.8 Kết Gà chuyển gen GFP (bên trái gà thường (bên phải) 11/3/15 49 3.8 Kết Kết điện di sản phẩm multiplex PCR kiểm tra có mặt gen eGFP nguyên bào sợi gà 11/3/15 50 3.8 Kết Kết điện di ADN thu từ máu gà chuyển gen Chuyển gen qua tinh trùng 11/3/15 Vi tiêm 51 3.8 Kết Kết điện di ADN thu từ nội quan gà chuyển gen Chuyển gen qua tinh trùng 11/3/15 Vi tiêm 52 [...]... 77 cm/giây; tốc độ quạt: 300 vòng/phút 11/3/15 24 3.5 Chuyển gen GFP bằng PP chuyển gen qua tinh trùng Nhân dòng E.coli mang vector pT2/BH-CVpf-SB11 Gà trống Tinh trùng Tinh trùng mang gen pT2/BHCVpf-SB11 Gà mái 11/3/15 25 3.5 Chuyển gen GFP bằng PP chuyển gen qua tinh trùng 3.5.1 Phương pháp lấy tinh trùng gà Thực hiện thao tác gây xuất tinh ở gà trống → cong đuôi lên → ngón cái và ngón trỏ bóp nhẹ... (ADN- liposome) (ADN- liposome) Chuyển gen bằng PP vi tiêm Chuyển gen bằng PP vi tiêm Chuyển gen qua tinh trùng Chuyển gen qua tinh trùng Kiểm tra sự có mặt của gen Kiểm tra sự có mặt của gen cần chuyển cần chuyển 11/3/15 12 3.2 Nhân dòng E.coli mang vector pT2/BH-CVpf-SB11 Vector pT2/BH-CVpf-SB11 được biến nạp vào E.coli nhờ xung điện → Nuôi cấy vi khuẩn E.coli mang gen biến nạp Tách chiết, thu... 17 3.4 Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp 3.4.3 Phương pháp mở cửa sổ Chuẩn bị vỏ đậy cửa sổ Màng vỏ Tách màng vỏ ra khỏi màng đá vôi Rửa như mảnh vỏ đá vôi và bảo quản trong PBS để dùng cho các TN sau 11/3/15 18 3.4 Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp 3.4.3 Phương pháp mở cửa sổ Mở cửa sổ kết hợp vi tiêm DNA 11/3/15 19 3.4 Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ... biến nạp Tách chiết, thu nhận plasmid từ E.coli Plasmid sẽ được điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8 % 11/3/15 13 3.4 Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp Nhân dòng E.coli mang vector pT2/BH-CVpf-SB11 Trứng gà 0 giờ ấp 11/3/15 Trứng gà mang gen pT2/BH-CVpf-SB11 14 3.4 Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp 3.4.1 Phương pháp rèn kim tiêm Ống mao quản thủy tinh, d = 1 mm ... 11/3/15 28 3.5 Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp 3.5.3 Phương pháp tạo phức hợp lipoplex (ADN- liposome) Lắc nhẹ Lipofectamin Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng Nhỏ 8 g ADN lên vị trí nhỏ Lipofectamin Ủ 20 phút ở nhiệt độ phòng để tạo thành phức hệ ADN-Liposome 11/3/15 TM 2000, nhỏ 20 l lên bề mặt của 100 l môi trường Opti-MEM TM 2000 ở trên 29 3.5 Chuyển gen GFP bằng PP chuyển gen qua tinh... 15 3.4 Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp 3.4.2 Phương pháp tạo phức hợp lipoplex (ADN- liposome) Lắc nhẹ Lipofectamin Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng Nhỏ 0,8 g ADN lên vị trí nhỏ Lipofectamin Ủ 20 phút ở nhiệt độ phòng để tạo thành phức hệ ADN-Liposome 11/3/15 TM 2000, nhỏ 2 l lên bề mặt của 100 l môi trường Opti-MEM TM 2000 ở trên 16 3.4 Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ... vào buồng thao tác vô trùng và được xé rách màng vỏ bằng panh 11/3/15 21 3.4 Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp 3.4.3 Phương pháp mở cửa sổ Mở cửa sổ kết hợp vi tiêm DNA Sử dụng kim vi tiêm tiêm 2 l ADN vào xoang dưới phôi (chú ý không để bọt khí đi vào phôi) 11/3/15 22 3.4 Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp 3.4.3 Phương pháp mở cửa sổ Mở cửa sổ kết hợp vi tiêm DNA Lấy... thẳng đứng với đầu tù quay lên trên 11/3/15 23 3.4 Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp 3.4.4 Phương pháp ấp trứng Trứng 0 giờ ấp sẽ được xông khử trùng bằng KMnO4 và focmon Trứng sau khi đã khử trùng được xếp vào khay với đầu tù quay lên trên Khay trứng được chuyển vào tủ ấp với chế độ ấp như sau: o Nhiệt độ: 37,8 C Đảo trứng: 2h/lần 10-12 lần/ngày Thông thoáng: vận tốc gió... trùng 3.5.4 Phương pháp chuyển phức hợp lipoplex vào tinh trùng Lấy 1-1,5 ml tinh dịch thu được pha loãng với 4 ml môi trường DMEM không có FBS (tỉ lệ pha loãng thích hợp nhất của tinh dịch và môi trường là 1:3) Trộn đều phức hợp lipoplex với tinh dịch vừa thu được (tổng khoảng 6ml), ủ 20 - 50 phút rồi tiến hành TTNT cho gà mái 11/3/15 30 3.5 Chuyển gen GFP bằng PP chuyển gen qua tinh trùng 3.5.5... 3.5.5 Phương pháp thụ tinh nhân tạo 11/3/15 31 3.6 Phương pháp thu nhận DNA từ gà mang gen chuyển Phương pháp tách tế bào phôi 7 ngày ấp và Phương pháp thu nhận DNA từ tế bào hồng nuôi cấy nguyên bào sợi cầu và nội quan gà 11/3/15 32 3.6.1 Phương pháp tách tế bào phôi 7 ngày ấp và nuôi cấy nguyên bào sợi Tách tế bào phôi 7 ngày ấp Khử trùng trứng bằng cách lau cồn 70 độ Lấy phôi ra khỏi trứng và ... phương pháp chuyển gen động vật 11/3/15 Mô hình chuyển gen gà Thử nghiệm chuyển gen GFP Gà (Gallus Gallus domesticus) 1.1 Quy trình chuyển gen động vật 11/3/15 1.2 Phương pháp chuyển gen động vật... vi tiêm Chuyển gen vào tinh trùng Chuyển gen qua liposome Chuyển gen nhờ virus Chuyển gen nhờ sử dụng tế bào gốc Chuyển gen nhờ xung phôi điện 11/3/15 2.1 Giới thiệu Quá trình chuyển gen động... liposome) (ADN- liposome) Chuyển gen PP vi tiêm Chuyển gen PP vi tiêm Chuyển gen qua tinh trùng Chuyển gen qua tinh trùng Kiểm tra có mặt gen Kiểm tra có mặt gen cần chuyển cần chuyển 11/3/15 12 3.2