bài tiểu luận các sản phẩm thực vật chuyển gen thương mại hoá

Chẳng hạn, cây “lúa vàng” có hàm lượng β-carotein cao  -carotein là một thành phần quan trọng trong việc tạo ra vitamin A, hoặc giống khoai tây công nghệ sinh học có hàm lượng protein c

Trang 1

MỞ ĐẦUCây trồng chuyển gen hay còn gọi là cây trồng biến đổi gen hiện đang

là vấn đề được cả thế giới tranh luận Song không thể phủ nhận hiệu quảcủa nó trong sản xuất cùng lợi ích kinh tế rất lớn do nó mang lại Hiện nay,công nghệ sinh học trên thế giới phát triển với tốc độ chóng mặt, riêng trongnông nghiệp đã có hơn 60 triệu ha gieo trồng bằng các giống cây biếnđổi gen như: ngô, lúa, đậu tương, bông, hoa hướng dương, khoai tây, đuđủ

Cây trồng chuyển gen với năng suất và chất lượng cao đã đem lại lợiích khổng lồ cho những quốc gia có nền công nghệ sinh học tiên tiến Đồngthời giảm được việc sử dụng thuốc trừ sâu, phân bón hóa học vốn làm suykiệt tài nguyên thiên nhiên và phá vỡ cân bằng sinh thái, ảnh hưởng nghiêmtrọng đến khí hậu toàn cầu

Những nghiên cứu hiện nay cho phép tạo ra các loại cây lương thực

“thế hệ đầu tiên” có khả năng chống lại các stress của môi trường như hạnhán, sự thay đổi nhiệt độ đột ngột hay đất nhiễm mặn Các nhà khoa họctrên thế giới đang nghiên cứu “thế hệ thứ hai” của các sản phẩm công nghệsinh học-những sản phẩm mang lại lợi ích trực tiếp cho người tiêudùng

Chẳng hạn, cây “lúa vàng” có hàm lượng β-carotein cao ( -carotein

là một thành phần quan trọng trong việc tạo ra vitamin A), hoặc giống khoai

tây công nghệ sinh học có hàm lượng protein cao hơn giống bình thường.Cây trồng cũng có thể tạo ra các loại vaccine thực phẩm (vaccine thựcphẩm là loại vaccine thế hệ mới được tạo ra bằng cách chuyển một genkháng nguyên vào thực vật Gen này khi hoạt động trong cơ thể thựcvật sẽ sinh ra protein kháng nguyên tương ứng Khi những khángnguyên này đi vào cơ thể người thông qua ăn uống (dạng tươi sống), hệthống miễn dịch của người sẽ tự động sinh ra kháng thể để chống lạikháng nguyên đó Như vậy là đã thay việc tiêm chủng vaccine bằngviệc ăn hoa quả hoặc rau xanh có kháng nguyên), đem lại những loại

Sinh viên: Đào Duy Hưng Lớp Công Nghệ |Sinh Học K2

1

Trang 2

thuốc có chi phí sản xuất và bảo quản thấp Đây là một trong nhiều nghiêncứu mũi nhọn nhằm thúc đẩy phát triển ngành lương thực cũng nhưdược phẩm thế giới Những triển vọng mà cây chuyển gen mang lại là vôcùng to lớn Với những hiệu qủa thiết thực như vậy nên rất nhiều sản phẩmthực vật chuyển gen đã được thương mại hoá nhưng cùng với việc thương mạihoá thì các sản phẩm này đã gặp rất nhiều sự trở ngại do những nỗi lo củangười tiêu dùng về những ảnh hưởng xấu đến sức khoẻ của họ mà những thựcphẩm chuyển gen có thể gây ra Để hiểu rõ hơn về cây chuyển gen cũng nhưnhững vấn đề xoay quanh cây chuyển gen chúng ta cùng tìm hiểu vấn đề :

“Các sản phẩm thực vật chuyển gen thương mại hoá”

2

Trang 3

Chương 1 CÁC MỐC LỊCH SỬ CỦA THỰC VẬT CHUYỂN GEN VÀ

MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT

1.1 Các mốc lịch sử của thực vật chuyển gen:

Năm 1980, những thử nghiệm chuyển gen của vi khuẩn vào cây trồngnhờ Agrobacterrium tumefaciens được thực hiện

Năm 1983, có marker chọn lọc và Ti – Plasmid được loại bỏ các genkhông cần thiết

Năm 1986, tạo được cây kháng virus và những cây chuyển gen đầu tiênđược trồng thử nghiệm trên đông ruộng Năm 1990, thực phẩm chuyển genđầu tiên được chấp nhận ở Mỹ Năm 1994, sản phẩm cây trồng chuyển genđầu tiên được thương mại hoá là giống cà chua Flavr savr mang gen chínchậm

Từ năm 1995, nhiều loại cây trồng biến đổi gen được đưa ra đồng ruộng,diện tích trồng cây chuyển gen cũng như số loại cây chuyển gen phát triểnkhông ngừng Trong thời gian 8 năm (1996 - 2003), diện tích trồng câychuyển gen tăng 40 lần, từ 1,7 triệu ha (1996) tăng lên 67,7 triệu ha (2003)

Số quốc gia trồng cây chuyển gen tăng gấp 3 lần, từ 6 nước (1996) đến 2003

có 18 quốc gia trồng cây biến đổi gen

Năm 2003, diện tích trồng cây chuyển gen vẫn chủ yếu ở các nước pháttriển, chiếm 70% tổng diện tích cây chuyển gen toàn cầu với diện tích 42,7triệu ha Hiện nay, Mỹ có diện tích trồng cây chuyển gen lớn nhất 42,8 triệu

ha, chiếm 63% diện tích cây chuyển gen toàn cầu, Argentina 13,9 triệu ha(21%), Canada 4,4 triệu ha (6%), Brazil 3 triệu ha (4%), Trung Quốc 2,8 triệu

ha (3,85%) và các nước Nam Phi có diện tích trồng cây chuyển gen là 0,4triệu ha chiếm 0,1% diện tích trồng cây chuyển gen toàn cầu

1.2 Một số phương pháp chuyển gen ở thực vật:

1.2.1 Chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens:

Mục đích của công nghệ gen thực vật là tạo ra những cây biến đổi gencónhững đặc tính mới Ở đây DNA lạ được đưa vào tế bào thực vật và tồn tại

3

Trang 4

bền vững trong hệ gen Các vi khuẩn đất A tumefaciens và một số loài họ

hàng có khả năng chuyển một phần nhỏ DNA của nó vào tế bào thực vật vàqua đó kích thích tạo khối u Những khối u này là không gian sống của vikhuẩn Một số chất dinh dưỡng (opine) có lợi cho vi khuẩn cũng được tạo ratrong những khối u này Những opine phổ biến nhất là nopalin và octopin

Việc sử dụng A tumefaciens đã bắt đầu từ 1907, khi người ta

phát hiện vi khuẩn này có khả năng tạo nên khối u ở cây hai lá mầm bịthương, được gọi là khối u cổ rễ Trong những năm bảy mươi người ta

tìm thấy trong các chủng A tumefaciens tạo khối u có một plasmid rất lớn

có kích thước 200 đến 800 kb Qua những thí nghiệm chuyển đếnnhững chủng không độc (không có plasmid này), đã khẳng định plasmidnày cần thiết cho việc tạo khối u Vì vậy, plasmid này được gọi là Ti-plasmid (tumorinducing-plasmid)

Hình 1 Vikhuẩn Agrobacterium

tumefaciens

a: Dưới kính hiển vi điện tử

b: Khối u ở cây và từ khối u này xuất hiện chồi một cách tự nhiên

Ti-plasmid mang các gen mã hóa cho protein phân giải opine,nhận biết những tế bào thực vật bị thương, cắt và vận chuyển đoạn đượcgọi là T- DNA T-DNA là một phần của Ti-plasmid, được chuyển vàothực vật (transfer-DNA) Trên đó định vị những gen tạo khối u và tổng hợpopine T- DNA được giới hạn bởi hai vùng, bờ trái và bờ phải (LB : leftborder và RB:right border) Các bờ này gồm một trình tự lặp lại của 25 bp,

là trình tự nhận biết cho việc cắt T-DNA T-DNA được đưa vào DNA thựcvật trong nhân tế bào Vị trí gắn vào thường là ngẫu nhiên, tuy nhiênthường là những vùng có khả năng sao chép Quá trình lây nhiễm được mô

tả ở hình 2

4

Trang 5

bị thương NST của vi khuẩn

Hình 2: Sơ đồ lây nhiễm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Ở opine người ta phân biệt octopin và nopalin Một số loài vi khuẩn A

tumefaciens chứa Ti-plasmid của loại octopin và loại khác của nopalin

Những plasmid octopin chỉ có thể tạo octopin và phân giải chúng,

5

Trang 6

nhưng không tạo và phân giải được nopalin.

Một sự khác biệt khác của các loại plasmid ở Agrobacterium là

Ti- plasmid của loại nopalin chứa một bản copy của T-DNA, ngược lạiplasmid octopin chứa ba Ở hình 3, trên đoạn T-DNA định vị những gentổng hợp opine và tạo khối u Khối u được tạo nên là dophytohormone (auxin và cytokinin) được tạo ra ở trong tế bào thực vật bịnhiễm, chúng kích thích sự phân chia tế bào và tạo nên mô không phân hóa

Hình 3: Ti-Plasmid của Agrobacterium dạng nopalin, T-DNA:

Transfer-DNA, LB: Bờ trái, RB: Bờ phải, ori: khởi đầu sao chép của A tumefaciens,

noc: phân giải nopalin, nos: tổng hợp nopalin, tmr: tổng hợp cytokinin, tms:

tổng hợp auxin, tra: Vận chuyển tiếp hợp, vir: vùng độc tính.

Điều kiện cho việc chuyển T-DNA vào thực vật trước hết là tế bào bịthương Khi tế bào bị thương chúng tiết ra các hợp chất phenol(acetosyringon), chất có vai trò quan trọng trong việc nhận biết và sự gắnkết giữa vi khuẩn và tế bào thực vật

Cơ chế nhận biết được giải thích là nhờ tính đặc hiệu của A.

tumefaciens với cây hai lá mầm, ở cây một lá mầm thì phản ứng này chỉ ở

6

Trang 7

một ít loài Vì vậy, Agrobacterium được sử dụng giới hạn cho biến nạp cây một lá mầm Khi bổ sung syringon người ta có thể biến nạp nấm bằng A.

tumefaciens Thực vật một lá mầm quan trọng như ngô có thể được biến nạp

bằng A tumefaciens.

Ti-Plasmid khó được dùng trực tiếp trong các thí nghiệm chuyển gen, vì

nó có kích thước lớn và mang các gen gây khối u; hơn nữa DNA của Plasmid có quá nhiều chỗ để các enzyme giới hạn có thể cắt, trong khi đóngười ta chỉ cần một số ít vị trí như vậy mà thôi Tuy nhiên, Ti-Plasmid có thểcung cấp cho ta những yếu tố cần thiết để thiết kế những vector hữu ích cho

Ti-kỹ thuật chuyển gen Thường người ta hay sử dụng các Ti-Plasmid, mà trong

đó vùng T-DNA gây khối u đã bị tách bỏ và thay thế vào đó các gen trội chỉthị cho chọn lọc (thường là các gen vi khuẩn kháng chất kháng sinh, nhưkanamycin) Tuy nhiên, kích thước lớn của Ti-Plasmid rất khó khăn cho việcgắn trực tiếp một phân đoạn DNA vào vùng giữa hai trật tự biên Để giảiquyết khó khăn này người ta thiết kế ra hai hệ thống vector không gây khối u,khác nhau ở chỗ: vùng gen vir và hai trật tự biên (LB và RB) cùng nằm trênmột đơn vị tái bản (plasmid) hay trên hai đơn vị khác nhau Đó là hệ thốngvector liên hợp và vector nhị thể

* Hệ thống vector liên hợp:

Hệ thống này gồm hai plasmid Plasmid thứ nhất là Ti-Plasmid chứavùng gen vir, vùng T-DNA mà ngoài hai đoạn biên LB và RB cùng một sốgen chỉ thị được giữ lại, còn thì loại bỏ hết Plasmid thứ hai là một plasmid đã

tách dòng và có thể tái sinh được ở Agrobacterium, nó chứa: hai nhóm gen

chỉ thị (một cho sự chọn lọc ở vi khuẩn và một cho sự sàng lọc ở tế bào thựcvật), một đoạn tương đồng với đoạn có trên plasmid thứ nhất, một đoạn cóphổ tái bản rộng và đoạn MCS để gắn gen cần chuyển Sau đó hai plasmidnày được trộn lẫn với nhau, chúng sẽ hợp nhất với nhau nhờ hiện tượng traođổi chéo xảy ra giữa các vùng tương đồng Vì thế vector liên hợp đã chứatoàn bộ đặc điểm của hai loại plasmid và có thể chuyển được đoạn vector cầnchuyển vào cơ thể thực vât

7

Trang 8

* Hệ thống vector nhị thể:

Khác với hệ thống vector liên hợp, ở hệ thống vetor nhị thể đoạn mangT-DNA và đoạn mang gen vir nằm trên hai plasmid khác nhau Mặt khác, nókhông nhất thiết phải chứa đoạn tương đồng với Ti-Plasmid và có khả năng

tái bản độc lập trong cả tế bào E.coli và Agrobacterium Đây cũng là ưu điểm

của hệ thống vector này so với vector liên hợp

1.2.2 Chuyển gen bằng súng bắn gen:

Chuyển gen bằng súng bắn gen là một phương pháp rất có triển vọng

ở thực vật, được phát triển năm 1987 bởi Sanford và cộng tác viên, đặc

biệt ở cây ngũ cốc vì thường không thể biến nạp được bằng A.

tumefaciens và sự tái sinh thực vật từ tế bào trần gặp khó khăn Để vượt

qua thành tế bào người ta thiết kế một dụng cụ để bắn những hạt wolframhoặc vàng bọc DNA vào tế bào Hạt này nhỏ đến nỗi khi đi vào tế bào nókhông gây hại kéo dài Ưu điểm của phương pháp này:

- Không cần phải phân hủy thành tế bào bằng enzyme

- Về lý thuyết mọi tế bào và mô đều có thể được biến nạp

- Không phức tạp như ở sự biến nạp A tumefaciens

Phương pháp này đã thành công trong việc đưa được hơn 10gen đồng thời vào các plasmid khác nhau và có thể được sử dụng cho bất

cứ loài sinh vật nào

Hình 4: Ảnh chụp dưới

kính hiển vi điện tử củahạt vàng (a) và volfram (b)trong cùng một tỷ lệ cho

sự biến nạp

8

Trang 9

Dựa vào điểm cuối cùng thì phương pháp này có thể được sửdụng thành công đối với vi khuẩn, nấm, tảo và động vật Ngoài ra, phươngpháp này còn vượt qua một cản trở khác nữa: trong khi các phương phápkhác chỉ phù hợp với việc đưa gen lạ vào nhiễm sắc thể của nhân thì bằngphương pháp này người ta có thể biến nạp cả ty thể và lạp thể.

Thiết bị đầu tiên để chuyển gen là súng bắn gen Máy hiện đại sử dụngkhí helium nén làm đạt đến vận tốc bắn tối ưu và thao tác an toàn hơn Tốc độđạt 1300 m/s (so sánh với vận tốc âm thanh trong không khí 343 m/s) Tỷ

lệ biến nạp hoặc hiệu quả của phương pháp phụ thuộc vào nhiều yếutố: lượng DNA/hạt vàng hoặc wolfram, tốc độ hạt, số lượng hạt, độ lớn vàloại tế bào và mật độ của tế bào hoặc mô được sử dụng

Nòng súng

Đĩa nhựa mang các vi đạn bằng vàng có bọc DNA Đĩa nhựa được chặn lại bởi tấm lưới

Các vi đạn bằng vàng được bọc DNA

Tế bào đích của thực vật

Hình 5: Sơ đồ súng bắn gen

Bằng sự biến nạp phi sinh học chỉ mới đạt được sự biểu hiện tạm thời(transient) của các gen ở hành, đậu tương, lúa và ngô Sự biểu hiện tạm thời cónghĩa là gen biến nạp ban đầu hoạt động nhất thời và sau đó thì mất hoặc sựbiểu hiện bị cản trở bởi sự methyl hóa DNA sau phiên mã Chỉ một số ít biếnnạp bền vững được mô tả và thực tế phương pháp này đạt được ý nghĩa lớn đốivới cây ngũ cốc Tuy nhiên vẫn còn một số khó khăn:

Hiệu quả của phương pháp này thấp, chỉ khoảng 0,05% đỉnh sinh

9

Trang 10

trưởng đậu tương tái sinh sau khi biến nạp.

+ Vì DNA biến nạp không phải luôn luôn bền vững trong DNA củanhân tế bào nên thường biểu hiện tạm thời Thường chỉ một số ít tế bào của

mô được biến nạp và vì vậy không phải lúc nào cũng tái sinh được cây thayđổi gen đồng nhất

+ Phần lớn phải sử dụng mô phân sinh để biến nạp, ví dụ phôilúa hoặc dung dịch tế bào ngô

1.2.3 Chuyển gen trực tiếp vào tế bào trần (Protoplast):

Protoplast có thể coi là một đối tượng lý tưởng để chuyển gen Vì rằng DNA (ngay cả protein hay các cơ quan tử của tế bào) có thể xâm nhập rất dễ dàng vào trong tế bào đã không còn thành tế bào; vả lại, điều đó có thể xảy ra đối với bất kỳ nồng độ protoplast nào và của thực vật nào Việc tách thành tế bào (bằng cơ học hay bằng enzyme) đều tạo ra một phản ứng thương tổn đối với tế bào và chuyển chúng sang trạng thái có khả năng tái sinh và chấp nhận

sự biến nạp Việc biến nạp như vậy không cần một vector sinh học nào Ở đây, DNA được hấp thụ bằng một quá trình vật lý đơn thuần và loại bỏ được giới hạn giữa các nhóm thực vật

Để tạo nên tế bào trần từ những mô lá trước hết cần phải phân giảipectin nhờ enzyme pectinase Bước tiếp theo thành tế bào, phần lớngồm cellulose, phải được phân giải nhờ enzyme cellulase Kết quả xuấthiện tế bào tròn, không có thành, để bền vững chúng phải được giữtrong một dung dịch đồng thẩm thấu

Hình 6: Tế bào trần cây thuốc lá dưới

kính hiển vi

10

Trang 11

DNA được biến nạp vào tế bào trần có thể thực hiện bằng 2 con đường: + Thứ nhất người ta sử dụng chất polyethylenglycol, khi có mặt chấtnày các tế bào trần hòa lẫn vào với nhau và qua đó các phân tử DNA đượctiếp nhận.

+ Thứ hai sự biến nạp có thể được thực hiện bằng sốc điện, được gọi

là xung điện Sốc điện dẫn đến sự không phân cực ngắn của màng tế bàotrần, làm cho DNA được tiếp nhận DNA đi vào trong nhân và kết hợphoàn toàn ngẫu nhiên vào một vị trí bất kỳ trong DNA nhân của thực vật.Tiếp đến là sự chọn lọc và tái sinh toàn cây

Về nguyên tắc bất kỳ thực vật nào cũng có thể được biến nạp bằng cácphương pháp trên Nhưng tái sinh cây hoàn chỉnh thường là rất khó và vìvậy việc sử dụng biến nạp bằng tế bào trần bị hạn chế

1.2.4 Chuyển gen bằng phương pháp vi tiêm (thường tiến hành với các tế bào tiền phôi của hợp tử hoặc của hạt phấn):

Kỹ thuật vi tiêm sử dụng máy vi nhu động và các thiết bị hiển vi để đưaDNA vào tế bào, đã tạo ra được những cây chuyển gen từ protoplast (Chnorf

et al., 1991) hoặc những cây chuyển gen khảm từ các tế bào tiền phôi cónguồn gốc từ hạt phấn (Neuhaus, 19870) Như phương pháp chuyển gen bằngsúng bắn gen, phương pháp vi tiêm cho phép đưa DNA vào các tế bào cóthành tế bào So với phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen thì phươngpháp vi tiêm có hạn ché là nó chỉ cho phép đưa DNA vào một tế bào trongmỗi lần tiêm; hơn nữa, phương pháp này đòi hỏi kỹ năng cao và thiết bị tốnkém Song, nó cũng có một số ưu điểm như:

+ Lượng DNA đưa vào là tuỳ ý

+ DNA được đưa vào đúng chỗ

+ Việc đưa DNA vào đâu là chính xác đến đó, thậm chí có thể tới nhân

Định dạng
Số trang	22
Dung lượng	770 KB