nâng cao chất lượng heo thịt bằng kĩ thuật chuyển gen ở động vật

Trang 1

Nâng cao chất lượng heo thịt bằng kĩ thuật chuyển gen ở động vật

LỜI NÓI ĐẦU

Thịt heo là một trong những thực phẩm phổ biến và quan trọng của con người, do đó, việc chăn nuôi heo cũng là một trong những ngành nông nghiệp rất quan trọng Ở đất nước ta, có rất là nhiều vùng và địa phương chăn nuôi loại gia súc này, với nhiều quy mô khác nhau, như trang trại, hộ gia đình,…đặc biệt là ở vùng Đông Nam Bộ.

Mặc dù vậy, tình hình chăn nuôi và giá cả heo hiện nay rất khó khăn Nguyên nhân là do nhiều trang trại hay một số người chăn nuôi đã sử dụng một loại thuốc cấm có chứa Clenbuterol, Salbutamol Họ gọi nó là “ thần dược” giúp lượng mở heo ít

đi và lượng nạc tăng lên, mà không biết rằng khi thịt heo được bán ra ngoài cho người tiêu dùng mà còn tồn dư lượng chất này trong thịt sẽ gây ra hiểm họa về các bệnh ung thư, nhược cơ, tổn hại thần kinh Từ khi Nhà nước phát hiện và công bố sự thật này đã làm cho giá thành heo giảm sút, người tiêu dùng cũng hạn chế sử dụng thịt heo hoặc là chỉ sử dụng heo có nhiều mỡ, tuy nhiên, heo có nhiều mỡ lại không ngon và chứa quá nhiều cholesterol Ngoài ra, nó đã làm ảnh hưởng rất nhiều đến ngành chăn nuôi heo ở nước ta, đặt biệt là ngững người chăn nuôi không sử dụng loại thuốc “thần dược” này cũng bị ảnh hưởng, dẫn đến lượng heo tồn lại không bán được, hoặc là bán với giá rẻ không lời mà còn dẫn đến lỗ nặng.

Do đó, để khắc phục tình trạng trên, ta nên sản xuất một dòng heo thịt có lượng nạc cao mỡ ít mà không sử dụng những chất tăng nạc gây hại đến con người Nhóm em đề ra một hướng giải quyết là sẽ tạo ra một dòng heo thịt chuyển gene và gene được chuyển có khả năng tạo ra hoocmon GH, loại hoocmon sẽ giúp cho heo có lượng nạc cao theo thị hiếu sử dụng của người tiêu dùng, đồng thời không gây hại đến sức khỏe con người.

Và nếu kết quả này thành công, thì ta sẽ thật sự sản xuất được một dòng heo siêu nạc như mong muốn, đem lại lợi nhuận cao cho người chăn nuôi, và đảm bản sức khỏe của người tiêu dùng.

Trang 2

NỘI DUNG

I TỐNG QUAN TÀI LIỆU

1 Sơ lược về chi lợn ( chi heo )

Chi Lợn (hay chi Heo theo phương ngữ miền Nam của tiếng Việt ) là một chi động vật móng guốc có nguồn gốc ở đại lục Á-Âu được gộp nhóm tổng thể với danh pháp khoa học là Sus, thuộc họ Lợn ( Suidae ) Lợn rừng đã được thuần hóa và được nuôi như là một dạng gia súc để lấy thịt cũng như da Các sợi lông cứng của chúng còn được sử dụng để làm một số loại bàn chải, da có thể dùng để sản xuất bóng bầu dục Ngoài ra, phân của lợn nhà cũng được dùng làm phân chuồng để cải tạo đất.

1.1 Thông tin chung

Chi Lợn là các loài động vật ăn tạp, chúng ăn cả thức ăn có nguồn gốc động và thực vật cũng như thức ăn thừa của con người Trong điều kiện hoang dã, chúng là các động vật chuyên đào bới, tức là luôn dũi đất để tìm kiếm thức ăn Lợn là động vật rất dễ huấn luyện, vì thế cùng với đặc tính đào bới và khứu giác rất nhạy của chúng nên ở một số nơi người ta còn dùng chúng để tìm nấm, đặc biệt là ở châu Âu Ngoài

ra, người ta còn nuôi lợn (heo) mọi (một dạng của lợn ỷ Việt Nam) để làm động vật cảnh, đặc biệt là ở Mỹ.

Một đàn lợn con thông thường có từ 6 đến 12 con Tuy nhiên, trong điều kiện nuôi nhốt, thỉnh thoảng người ta thấy hiện tượng lợn mẹ ăn thịt các con sơ sinh của nó, có lẽ là do thiếu chất Lợn có có 44 răng, mõm và tai lớn, chân có 4 ngón, 2 ngón giữa lớn hơn và có lông cứng Thời kỳ mang thai của lợn trung bình là 114 ngày Lợn không có tuyến bài tiết mồ hôi , vì thế chúng phải tìm các nơi râm mát hay ẩm ướt (các nguồn nước, vũng bùn v.v) để tránh bị quá nóng trong điều kiện thời tiết nóng Chúng cũng dùng bùn làm lớp bảo vệ để khỏi bị cháy nắng.

1.2 Các loài

1.2.1 Giống lợn rừng

• Sus barbatus: Lợn râu; Malaysia, Indonesia

• Sus bucculentus: Lợn rừng Đông Dương

• Sus cebifrons: Lợn rừng Visayas

• Sus celebensis: Lợn rừng Celebes

• Sus daelius: Lợn rừng Poulter

• Sus habeoncosus: Lợn rừng Malaysia

• Sus heureni: Lợn rừng Flores

Trang 3

• Sus philippensis: Lợn rừng Philipin

• Sus salvanius: Lợn rừng lùn; đông bắc Ấn Độ, Himalaya

• Sus scrofa (còn gọi là S domesticus): Lợn nhà, lợn lòi, lợn rừng; châu Âu, châu Á

• Sus timoriensis: Lợn rừng Timor

• Sus verrucosus: Lợn rừng Java, Indonesia, Philipin

1.3 Các giống lai

Giống lợn nhà Tamworth thông thường hay được cho lai ghép với lợn rừng để sản sinh ra một giống lợn mà người ta gọi là "lợn thời kỳ đồ sắt", chúng tương tự như lợn nhà thời kỳ nguyên thủy Lợn con mới sinh ra này giống như lợn rừng non "Lợn thời kỳ đồ sắt" là loài vật có sức thu hút phổ biến (vì tính tò mò, hiếu kỳ) tại các trang trại Lợn lai kiểu này giống lợn nhà hơn lợn rừng, nhưng khó huấn luyện hơn lợn nhà và nói chung được dùng để lấy thịt làm xúc xích Các giống lợn nhà khác cũng được lai với lợn rừng sản xuất thịt ít mỡ hơn thịt lợn nhà.

Trong "The Variation Of Animals And Plants Under Domestication" Charles Darwin đã viết: “Lợn rừng châu Âu và lợn nhà Trung Quốc có lẽ gần như là khác biệt một cách chắc chắn: Ngài F Darwin đã cho giao phối một con lợn nái Trung Quốc với lợn rừng đực Alpine, đã được thuần hóa một phần, nhưng các con lợn con, mặc dù có một nửa máu đã thuần hóa trong huyết quản của chúng, lại là cực kỳ hoang dã trong việc nuôi nhốt, và không dễ dàng ăn các loại nước gạo như những con lợn Anh thông thường.”.

Trang 4

Hình 1.3.a Lợn Ỉ Hình 1.3.b Lợn nhà nuôi thả rông

1.4 Các từ để gọi lợn

Trong tiếng Việt có nhiều từ để gọi các loại lợn (heo) khác nhau, chủ yếu áp dụng cho lợn đã thuần hóa (lợn nhà):

• Lợn nái hay heo nái - Lợn cái nuôi để sản xuất lợn con

• Lợn sề - Lợn nái già

• Lợn bột hay heo sữa - Lợn con đang bú mẹ

• Lợn hạch - Lợn đực đã thiến

• Lợn ỷ - Một giống lợn của Việt Nam, có mõm ngắn, lưng võng và bụng sệ với lớp da màu đen hay xám.

• Lợn lang hay heo bông - Lợn lông đốm đen-trắng

• Lợn mọi - Một dạng lợn ỷ, rất chậm lớn, chủ yếu nuôi làm cảnh

• Lợn lòi - Đồng nghĩa của lợn rừng

• Heo nọc - Lợn đực chuyên dùng để phối giống.

và còn nhiều nữa.

2 Kĩ thuật tách chiết DNA

Ở Eukaryote, phần DNA chủ yếu nằm trong nhân, trên các nhiễm sắc thể Vì vậy để tách chiết DNA, trước hết cần bộc lộ DNA ra khỏi màng nhân, ra khỏi tế bào Các bước cơ bản để tách chiết DNA gồm:

Giải phóng DNA ra khỏi màng tế bào bằng cách nghiền, dùng áp xuất, siêu âm hoặc dùng phương pháp hoá học (dùng chất tẩy sodium duodecyl sulfate= sodium lauryl sulfate, triton có tác dụng phá vỡ màng tế bào, tách các phân tử lipid, đồng thời gây biến tính protein và tăng cường tính tủa protein trong quá trình tách chiết) hoặc dùng phương pháp sinh học (dùng enzym) Sau đó ly tâm để loại bỏ cặn (gồm chủ yếu mảnh vụn của tế bào).

Huỷ bỏ phần protein trong tế bào, trong nhiễm sắc thể bằng proteinase K để ở

Trang 5

370C/1-2 giờ Sau đó kết tủa protein bằng phenol: chlorform, NaCl… có tác dụng làm biến tính protein nhưng không hòa tan DNA, sau đó ly tâm để loại phần tủa Sau khi li tâm, protein sẽ tủa ở pha giữa: pha nước chứa DNA nằm ở trên cùng, pha dưới chứa phenol: chloroform Thu pha nước chứa DNA Thông thường phenol: chloroform được trộn với tỷ lệ 1:1 hoặc 4:1 để tăng hiệu quả tủa protein Ngoài ra còn bổ sung thêm một lượng nhỏ isoamylalcohol giúp cho phần phân tách giữa hai pha nước và dung môi hữu cơ rõ hơn và thao tác sử dụng pipet để hút pha nước ở trên sẽ dễ dàng hơn Phenol thường dễ bị xy hóa thành hợp chất quinone có màu hồng Các hợp chất quinone có thể hình thành nên các gốc tự do làm biến tính axit nucleic Vì vậy phenol phải được bảo quản ở nhiệt độ thấp, tránh ánh sáng hoặc bổ sung chất chống oxy hóa như mercapthoethanol, DDT (dithiothreito) hoặc 8-

hydroxy-quinoline 8-hydroxy-quinoline tạo cho dung môi hữu cơ có màu vàng sáng

dễ phân biệt giữa hai pha nước và dung môi hữu cơ.

Kết tủa DNA bằng ethanol tuyệt đối để lạnh trước (tủa hầu hết các loại DNA) hoặc tủa bằng isopropanol- chỉ tủa DNA có trọng lượng phân tử cao Khi tủa, người ta thường sử dụng các muối làm trung hòa điện tích âm của axit amin, thường dùng muối axetate 0,3M Điều kiện tủa thường ở 40C/30 phút Ly tâm để lấy phần tủa DNA DNA thu được được để khô ở nhiệt độ phòng và cho tan trong TE (tris, EDTA) và giữ ở nhiệt độ -4oC Để bảo quản lâu dài dung dịch DNA được bảo quản ở -20 o C.

Chú ý: trong quá trình thao tác, phải đảm bảo sạch và vô trùng để tránh lẫn DNA

của đối tượng khác dính theo dụng cụ Tránh các enzym khác phân huỷ DNA hoặc RNA cần nghiên cứu.

3 DNA tái tổ hợp

ADN tái tổ hợp là phân tử ADN được tạo thành từ hai hay nhiều trình tự ADN của các loài sinh vật khác nhau Trong kỹ thuật di truyền, ADN tái tổ hợp thường là được tạo thành từ việc gắn những đoạn ADN có nguồn gốc khác nhau vào trong vectơ tách dòng Những vectơ tách dòng mang ADN tái tổ hợp này có thể biểu hiện thành các protein tái tổ hợp trong các sinh vật Thí dụ một số dược phẩm là hormone peptide được tạo ra từ công nghệ ADN tái tổ hợp là insulin , hormone tăng trưởng , và oxytocin Những vắc-xin cũng có thể được sản phẩm bằng phương thức này Sinh vật chủ được sử dụng phổ biến nhất trong công nghệ ADN này là Escherichia coli

4 Chuyển gen ở động vật

4.1 Kĩ thuật chuyển gen

Kỹ thuật chuyển gen, ghép gen là kỹ thuật đưa một gen lạ (một đoạn DNA, RNA) vào tế bào vật chủ làm cho gen lạ tồn tại ở các plasmid trong tế bào chủ hoặc gắn

bộ gen tế bào chủ, tồn tại và tái bản cùng với bộ gen của tế bào chủ Gen lạ trong tế

Trang 6

bào chủ hoạt động tổng hợp các protein đặc hiệu, gây biến đổi các đặc điểm đã có hoặc làm xuất hiện những đặc điểm mới của các cơ thế chuyển gen Ngày nay việc ứng dụng các giống cây trồng và cật nuôi chuyển gen càng trở nên phổ biến Người

ta ước tính hiện nay trên thế giới có khoảng hơn một nửa đậu tương và khoảng một phần ba ngũ cốc được trồng từ những hạt giống có chuyển gen.

Có hai hình thức chuyển gen chủ yếu là chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp.

1 Chuyển gen trực tiếp bao gồm các phương pháp sau:

- Kỹ thuật siêu âm

- Kỹ thuật điện xung

- Kỹ thuật PEG

- Kỹ thuật vi tiêm

- Kỹ thuật bắn gen

- Kỹ thuật chuyển gen bằng sốc nhiệt

2 Chuyển gen gián tiếp

- Chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens

- Chuyển gen nhờ virus và phage

4.2 Động vật chuyển gen

Ðộng vật chuyển gen là động vật có gen ngoại lai (gen chuyển) xen vào trong DNA genome của nó Gen ngoại lai này phải được truyền lại cho tất cả mọi tế bào, kể cả các tế bào mầm Việc chuyển gen ngoại lai vào động vật chỉ thành công khi các gen này di truyền lại cho thế hệ sau.

4.3 Công nghệ tạo động vật chuyển gen

Công nghệ tạo động vật chuyển gen là một quá trình phức tạp và ở những loài khác nhau có thể khác nhau ít nhiều nhưng nội dung cơ bản gồm các bước chính sau: tách chiết, phân lập gen mong muốn và tạo tổ hợp gen biểu hiện trong tế bào động vật; tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen; biến nạp gen vào phôi động vật; nuôi cấy phôi và cấy truyền hợp tử (đối với động vật bậc cao); phân tích đánh giá tính ổn định và sự biểu hiện của gen lạ và tạo ra dòng động vật chuyển gen gốc một cách liên tục, sản xuất động vật chuyển gen.

5 Kĩ thuật PCR

PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction, được dịch ở một vài sách là Phản ứng chuỗi trùng hợp cũng có sách gọi là "phản ứng khuếch đại gen" PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E coli hay nấm men PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục

Trang 7

vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền , nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng , tách dòng gene , và xác định huyết thống

Phương pháp căn bản chạy PCR được Kary Mullis phát minh, ông đã đoạt giải Nobel về Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này, chỉ sau 7 năm khi ông đưa ra ý tưởng Ý kiến của Mullis là phát triển một quy trình mà DNA có thể nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme DNA polymerase

DNA polymerase có tự nhiên trong sinh vật sống, nơi mà nó thực hiện chức năng nhân DNA khi tế bào phân chia Nó làm việc bằng cách nối với sợi DNA và tạo sợi bổ sung Theo quy trình PCR gốc của Mullis, enzyme phản ứng nhân bản DNA được thực hiện trong ống nghiệm (in vitro) Sợi DNA đôi bị tách thành 2 sợi đơn khi đun nóng ở 96 °C Tuy nhiên, ở nhiệt độ này DNA polymerase bị phá hủy vì vậy cần bổ sung enzyme sau mỗi giai đoạn nung nóng của mỗi chu kỳ Quy trình PCR gốc của Mullis không có hiệu quả cao vì nó mất nhiều thời gian, cần một lượng lớn DNA polymerase, và phải liên tục lưu ý suốt trong quá trình PCR.

Sau đó, quy trình gốc này được phát triển bằng cách dùng DNA-Polymerase lấy từ

vi khuẩn thermophilic (ưa nhiệt) sống trong mạch nước phun ở nhiệt độ trên

110 °C DNA polymerase từ sinh vật này là thermostable (ổn định ở nhiệt độ cao) và khi dùng trong PCR nó không bị phá vỡ khi hỗn hợp được nung nóng để tách sợi DNA Từ đó, không cần phải thêm DNA-polymerase vào mỗi chu kỳ, quá trình sao chép DNA có thể đơn giản và tự động hơn.

Một trong những DNA-polymerase chịu nhiệt đầu tiên được phân lập được từ Thermus aquaticus và được gọi là Taq Taq polymerase được dùng rộng rãi trong thực nghiệm PCR (5/2004) Nhược điểm của Taq là thỉnh thoảng nó nhầm lẫn trong quá trình sao chép DNA, dẫn đến đột biến (sai) trong chuỗi DNA, vì nó thiếu tính sửa sai exonuclease 3’-5’ Các polymerase như Pwo hay Pfu, được phân lập từ Archaea có cơ chế sửa sai (cơ chế kiểm tra lỗi sai) và có thể làm giảm một cách đáng kể số đột biến xảy ra trong chuỗi DNA được sao chép Ngày nay, sự kết hợp giữa Taq và Pfu có thể cung cấp cả độ tin cậy cao lẫn sự nhân bản chính xác của DNA.

6 Kĩ thuật ELISA

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Hay còn gọi là phương pháp ELISA hay EIA là là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học , nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm sinh học

Trang 8

7 Kĩ thuật Southern Blot

Southern blot là một trong những kỹ thuật chuyển DNA từ gel lên màng lai

do Edwin Southern mô tả năm 1975

Đây là phương pháp cho phép xác định được sự có mặt của những trình tự nucleotide trên một đoạn DNA nào đó, trong hỗn hợp các đoạn DNA khác nhau.

Do E.M.Southern đề xuất vào năm 1975, tại đại học Edingburd.

Được triển khai nhờ 1 số kĩ thuật nền tảng của công nghệ sinh học phân tử như:

• Tách chiết gen.

• PCR

• Thẩm tích các phân tử acid nucleotide lên màng lai (blot).

• Lai phân tử ( lai với mẫu dò đặc hiệu)

8 Chức năng của hormon sinh trưởng GH

Hormon sinh trưởng, khác với các hormon khác do thùy trước tuyến yên tiết ra là nó không thực hiện chức năng thông qua một tuyến nội tiết khác mà ảnh hưởng đến hầu như toàn bộ các mô bào trong cơ thể.

8.1 Ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng:

Growth hormone (GH) còn được gọi là somatotropic hormone (SH) hay somatotropin là một protein có kích thước nhỏ với 191 a.a tạo thành chuỗi đơn có khối lượng phân tử 22,005 Hormon kích thích tăng trưởng của tế bào (cả tăng về kích thước và kích thích quá trình phân bào) Thí nghiệm tiêm GH cho chuột chưa trưởng thành thấy tất cả các cơ quan tăng kích thước so với đối chứng Khi đến tuổi trưởng thành chuột được tiêm GH không phát triển hơn về chiều dài xương nhưng tất cả các mô khác vẫn tiếp tục phát triển Thí nghiệm này cũng cho thấy khi đĩa sinh trưởng của xương dài gắn với cán xương, xương sẽ không phát triển được thêm về chiều dài nhưng hầu hết các mô khác của cơ thể vẫn có thể tiếp tục tăng trưởng trong suốt cuộc đời.

8.2 Ảnh hưởng đến trao đổi chất

8.2.1 Làm tăng cường tổng hợp protein ở tất cả mọi loại tế bào

Một số phương thức tác động của GH dẫn đến quá trình tích lũy protein như sau:

- Làm tăng quá trình vận chuyên amino acid qua màng tế bào dẫn đến tăng nồng

độ amino acid trong tế bào Nồng độ amino acid sẽ có tác động tăng cường quá

Trang 9

trình tổng hợp protein Tác động làm tăng nồng độ amino acid tương tự như tác động của insulin đến quá trình vận chuyển glucose.

- Làm tăng quá trình tổng hợp protein bởi ribosome: GH tác động trực tiếp đến các ribosome Tuy vậy, cơ chế tác động vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ.

- Làm tăng cường quá trình sao mã DNA tạo các RNA trong nhân tế bào (sau khi tác động 24-48 giờ) từ đó làm tăng tổng hợp protein dẫn đến kích thích tăng trưởng nếu có đầy đủ các yếu tố khác như năng lượng, các amino acid, các vitamin…

- Làm giảm sử dụng protein thông qua kích thích sử dụng các axit béo (fatty acids) từ mô mỡ để giải phóng năng lượng cần thiết thay cho việc sử dụng protein.

8.2.2 Ảnh hưởng đến sử dụng mô mỡ

GH có tác dụng giải phóng fatty acid từ mô mỡ làm cho nồng độ của các fatty acid tăng trong các loại dịch thể Thêm vào đó, trong các mô bào, GH làm tăng cường quá trình chuyển fatty acid thành acetyl CoA để sử dụng cho giải phóng năng lượng.

Một số nhà nghiên cứu cho rằng tác dụng huy động fatty acid thay cho việc sử dụng protein là cơ chế quan trọng của GH dẫn đến quá trình sinh trưởng Tuy vậy, GH cần đến vài giời để phát huy được tác động này trong khi đó chỉ cần thời gian tính bằng phút GH đã có thể kích thích tăng cường tổng hợp protein.

8.2.3 Ảnh hưởng đến trao đổi carbonhydrate

- Làm giảm sử dụng glucose: Cơ chế dẫn đến ảnh hưởng này vẫn đang được nghiên cứu Có thể GH làm tăng cường huy động fatty acid dẫn đến tổng hợp một lượng lớn acetyl-CoA sinh ra các tín hiệu phản hồi khóa quá trình biến đổi glucose và glycogen.

- Tăng cường dự trữ glycogen: Vì glucose và glycogen không được huy động để giải phóng năng lượng nên glucose vào trong tế bào nhanh chóng được biến đổi thành glycogen dự trữ Khi tế bào trở thành trạng thái "no" glycogen sẽ không thể dự trữ glycogen thêm nữa.

- Dừng quá trình hấp thu và tích lũy glucose tế bào và làm tăng nồng độ glucose trong máu: Khi đưa glucose vào cơ thể, lúc đầu quá trình chuyển glucose vào tế bào sẽ tăng làm cho nồng độ glucose trong máu giảm nhẹ Tuy vậy, hiện tượng này dừng lại chỉ sau khoảng 30 phút đến 1 giờ sau đó sẽ dẫn đến tác động ngược lại (do giảm quá trình vận chuyển vì tế bào không thể thu nhận thêm glucose được nữa).

Trang 10

Nếu không có sự hấp thu glucose, nồng độ glucose trong máu có thể sẽ tăng cao hơn 50-100 lần trong máu so với bình thường.

II VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Đối tượng dự tính nghiên cứu

Các giống lợn nuôi như Móng Cái, Ba Xuyên

2 Nội dung thực hiện

• Tách chiết DNA từ tế bào ở thùy trước tuyến yên người.

• Phân lập Gen GH mong muốn và tạo tổ hợp gen biểu hiện trong tế bào động vật.

• Tạo cơ sở vật liệu biến nap gen.

• Biến nạp gen vào phôi và nuôi vấy phôi trong ống nghiệm.

• Cấy truyền hợp tử vào con nhận đã được gây chửa giả (pseudopregnant) để phát triển thành cá thể con.

• Kiểm tra động vật được sinh ra từ phôi chuyển gen.

• Tạo nguồn động vật chuyển gen một cách liên tục.

3 Phương pháp nghiên cứu

Trên cơ sở công nghệ DNA tái tổ hợp, ngành chăn nuôi đang đứng trước những cơ hội thay đổi có tính cách mạng Ngày nay người ta có thể tạo ra những động vật mang các đặc tính kỳ diệu mà bằng phương pháp lai tạo bình thường không thể thực hiện được.

Công nghệ tạo động vật chuyển gen là một quá trình phức tạp và ở những loài khác nhau có thể khác nhau ít nhiều nhưng nội dung cơ bản gồm các bước chính sau: tách chiết, phân lập gen mong muốn và tạo tổ hợp gen biểu hiện trong tế bào động vật; tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen; biến nạp gen vào phôi động vật; nuôi cấy phôi và cấy truyền hợp tử (đối với động vật bậc cao); phân tích đánh giá tính ổn định và sự biểu hiện của gen lạ và tạo ra dòng động vật chuyển gen gốc một cách liên tục, sản xuất động vật chuyển gen.

3.1 Tách chiết đoạn Gen mã hóa cho hoocmon tăng trưởng GH từ người.

Trang 11

nhân bằng các phương pháp cơ học, sóng siêu âm… Trong thí nghiệm này chúng

ta có thể dùng hóa chất tẩy (detergent) Các chất Detergent có tính kiềm pH kiềm làm thay đổi điện tích, tính acid base của các đơn phân amino acid nên có thể làm đứt gãy các liên kết trong phân tử protein (cầu nối disulfide, liên kết peptide, liên kết hydro, liên kết Van de Waals), dẫn tới làm mất cấu hình của nó hoặc làm đứt gãy mạch polypeptide Khi đó các enzyme bị mất chức năng, còn các protein màng sẽ bị biến tính dẫn tới cấu trúc màng bị "lỏng hơn" và kết quả là màng bị phá Trong phương pháp này chúng ta có thể dùng 2 chất tẩy là chất tẩy nhẹ (triton X 100) và chất tẩy mạnh (SDS) Trước tiên, chất tẩy nhẹ phá vỡ màng hồng cầu; nếu không có công đọan này thì hồng cầu sẽ cùng lắng với nhân trong lần ly tâm 2 Sau khi đã thu nhận phân đọan nhân mới dùng chất tẩy mạnh để phá màng nhân Tiến hành ly tâm 1 nhằm loại bỏ trong phần dịch nổi những bào quan nhỏ và nhẹ như ti thể, không bào… Trong lần ly tâm 2, còn gọi là ly tâm trên đệm saccharose, chỉ có nhân - bào quan có tỉ trọng cao nhất là có thể di chuyển xuyên qua lớp đệm saccharose đậm đặc để lắng xuống đáy ống ly tâm trong thời gian và lực ly tâm đã tính toán

• Giai đoạn 2:

Tiến hành loại bỏ các tạp chất dựa trên tính hòa tan cảu chúng đối với các dung môi hữu cơ như:

• Phenol: chất làm biến tính mạnh protein và không hòa tan acid nucleic

• Chloroform: đi kèm chung với phenol, có tác dụng biến tính protein giống phenol

Chế phẩm DNA thu được bảo quản trong dung dịch TE ở nhiệt độ thấp.

Sau đó, DNA tách chiết được tiến hành kiểm tra hàm lượng & độ tinh sạch bằng kĩ thuật đo quang.

3.1.1 Đo hàm lượng DNA

Tùy vào cấu trúc của mỗi chất mà chúng có một đỉnh hấp thụ nhất định Đối với nucleic acid, do sự tương tác giữa các proton và các electron của vòng purine và

Trang 12

pyrimine mà nó có khả năng hấp thụ lớn nhất ở bước sóng 260nm trong vùng tử ngoại và hấp thụ cực tiểu ở bước sóng từ 230nm-240nm và không hấp thụ ở vùng có bước sóng lớn hơn 310nm Dựa vào tính chất này mà người ta có thể xác định được hàm lượng các nucleic acid bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 260nm

Độ hấp thụ này còn phụ thuộc vào các nhân tố như là: pH, nhiệt độ, cường độ ion.

độ hấp thụ tăng lên khi ở trong môi trường acid hoặc kiềm Trong thí nghiệm này pha loãng ADN trong dung môi là nước và ở nhiệt độ phòng

Công thức tính hàm lượng và độ tinh sạch của ADN

Hàm lượng ADN (ng/µl) =50×HSPL×OD260 (1)

Công thức (1) được áp dụng tính hàm lượng của ADN sợi đôi Đối với ADN biến tính sợi đơn hay ARN, oligonucleotid thì độ hấp thụ ở bước sóng 260nm tăng lên và được tính bởi công thức sau:

Hàm Lượng ARN hay ADN sợi đơn (ng/µl) = 40× HSPL×OD260 (2)

Hàm lượng oligonucleotid (ng/µl) = 20× HSPL×OD260 (3)

Trong đó

HSPL : hệ số pha loãng

OD260 : chỉ số đo được ở bước sóng 260nm

OD280 : chỉ số đo được ở bước sóng 260nm

3.1.2 Đo độ tinh sạch của DNA

Trong mẫu ADN thường có lẫn phenol và protein Những tạp chất này làm tăng

độ

hấp thụ ở bước sóng 280nm vùng tử ngoại Vì vậy độ tinh sạch của dung dịch nucleic acid được đánh giá bằng tỉ lệ giữa độ hấp thụ ánh sáng ở hai bước sóng 260nm và 280nm Được tính bằng công thức sau:

Độ sạch nucleic acid = OD260/OD280

Nếu tỉ lệ này nằm trong khoảng 1,8 đến 2 thì dung dịch ADN được xem là tinh sạch Tỉ lệ này thấp hơn 1,8 chứng tỏ mẫu có lẫn tạp chất Đối với dung dịch ADN sợi đôi, nếu tỉ lệ quá lớn thì chứng tỏ ADN có chứa trong mẫu bị biến tính hay bị phân hủy 3.2 Phân lập gen mong muốn

Trang 13

Một gen ngoại lai trước khi được chuyển vào genome của tế bào vật chủ để tạo ra động vật chuyển gen phải được phân lập và tinh chế hay nói cách khác là nó phải được tạo dòng Các công cụ sử dụng để tạo dòng bao gồm các enzyme đặc biệt có hoạt tính cắt và nối DNA (enzyme hạn chế và ligase), các mẫu dò (probe), vector và tế bào vật chủ Tế bào vật chủ thường được sử dụng là tế bào vi khuẩn E.coli và vector thường được sử dụng là plasmid.

Việc tách chiết một gen riêng lẻ là rất phức tạp bởi vì DNA mẫu chứa hàng triệu gen Do đó để thực hiện điều này, DNA mẫu chứa gen mong muốn và vector plasmid phải được cắt bởi cùng một loại enzyme hạn chế Các đoạn DNA mẫu sau khi được cắt có mang gen mong muốn sẽ được xen vào vector plasmid và các đầu của các đoạn DNA mẫu này và các đầu của vector plasmid sẽ được nối với nhau nhờ ligase tạo thành plasmid tái tổ hợp Sau đó các plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào các tế bào vi khuẩn E.coli và các tế bào vi khuẩn tiến hành sinh trưởng Vào thời điểm này, các tế bào vi khuẩn chứa plasmid mang gen mong muốn sẽ được phát hiện bằng mẫu dò

Chúng được nuôi cấy trong môi trường thích hợp để sinh trưởng phát triển tạo

ra hàng triệu bản sao của vector chứa gen này Vector chứa gen này sẽ được tách

ra khỏi tế bào vi khuẩn và gen mong muốn sẽ được tách chiết Phương pháp này có thể tạo ra hàng triệu bản sao của gen mong muốn mà không bị nhiễm bởi các gen khác Gen chuyển có nguồn gốc từ genome này chứa các đoạn exon mã hoá và các đoạn intron không mã hoá.

Người ta cũng có thể phân lập được gen mong muốn từ sản phẩm biểu hiện của nó như mRNA hoặc protein Từ mRNA dưới tác động của enzyme sao chép ngược sẽ tổng hợp ra DNA bổ sung mạch đơn (single strand complement DNA-ss cDNA), tiếp theo là DNA bổ sung mạch kép (double strand complement DNA- ds cDNA) DNA bổ sung (complement DNA- cDNA) này khác với DNA gốc là không chứa các intron mà chỉ bao gồm các exon Hoặc từ sản phẩm protein, có thể suy ra trình tự nucleotid của gen cấu trúc trên cơ sở trình tự các axit amin trong phân tử protein Sau đó có thể thiết kế cặp mồi (primer) để dò tìm đoạn gen mong muốn Dạng genome bao gồm tất cả các đoạn exon và intron xuất hiện một cách tự nhiên Các đoạn intron liên quan đến việc cắt ghép mRNA và biểu hiện của gen Dạng cDNA là một trình tự chỉ bao gồm các đoạn exon mã hoá protein của gen.

Hình 3.2 So sánh hai dạng gen chuyễn

3.3 Tạo tổ hợp gen chuyển biểu hiện trong tế bào động vật

Trang 14

Các gen ngoại lai được sử dụng để chuyển vào lợn là mMT-hGH (mouse methallothionein-human growth hormone), mMT-bGH (mouse methallothionein- bovin growth hormone), mMT-pGH (mouse methallothionein-porcine growth hormone), PRL-bGH (prolactin-bovin growth hormone), Alb-hGRF (albumin- human growth hormone releasing factor), mMT-hiGF1 (methallothionein-human insulin like growth factor 1) Trong khuôn khổ để án sẽ sử dụng mMT - hGH và mMT – bGH.

Ðể tạo tổ hợp gen chuyển biểu hiện trong tế bào động vật, các vùng chức năng khác nhau của gen có nguồn gốc từ các loài khác nhau có thể được kết hợp lại với nhau trong ống nghiệm bằng cách sử dụng enzyme hạn chế và ligase Tất cả các thành phần của gen có thể được tách chiết và tái tổ hợp để tạo thành một cấu trúc gen chuyển biểu hiện.

Ở các đầu của cấu trúc đầy đủ này có thể được sửa đổi bằng cách bổ sung các trình tự polylinker chứa một số vị trí nhận biết các enzyme hạn chế khác nhau Trình tự polylinker cho phép có thể xen vào cấu trúc này một vector để kiểm tra và tạo dòng

Gen chuyển được đi kèm với các trình tự không mã hoá có vai trò điều hoà sự biểu hiện của gen Các yếu tố điều hoà cũng có thể nằm ở trong đoạn intron Yếu tố điều hoà ở gần đầu 5’ của gen là promoter, có vai trò quyết định trong việc điều hoà sự biểu hiện của gen Sự biểu hiện của gen có thể xảy ra trong tất cả các mô của cơ thể (không đặc hiệu) hoặc chỉ ở các mô đặc biệt Hay nói cách khác gen cấu trúc muốn hoạt động để biểu hiện ra protein mà nó qui định trong hệ thống tế bào nhất định thì phải có promoter thích hợp với hệ thống mà nó hoạt động Promoter ở tế bào động vật có nguồn gốc hoặc từ động vật như methallothionein (MT), thymidine kinase, ß-actin, amylase, insulin, ß-lactoglobulin, adiposite P2 hoặc từ virus động vật như Simian virus (SV40), Rous sarcoma virus (RSV)

Một yếu tố điều hoà khác là yếu tố tăng cường (enhancer), có chức năng tăng cường sự biểu hiện của gen, không phụ thuộc vào vị trí và sự định hướng đối với gen Các yếu tố tăng cường xuất hiện có tương quan với các trình tự quá mẫn cảm với Dnase và ở cách gen một đoạn khoảng vài kilobase Ðầu 3’ của gen cũng phải mang một trình tự poly-A để đảm bảo thích hợp cho quá trình phiên mã và dịch mã Có nhiều phương pháp tạo DNA tái tổ hợp như:

 Phương pháp đơn giản dùng đầu lệch:

• Chọn và xử lý DNA Plasmid:

Trang 15

Plasmid được tách ra từ tế bào E.Coli hoặc tế bào nấm men theo phương tách chiết DNA plasmid Sau đó, dùng enzyme RE II (như EcoRI) cắt để tạo plasmid hở có hai đầu lệch nhau.

• Chọn và xử lí đoạn cài:

DNA đoạn cài được thu nhận và lựa chọn, tinh chế theo mục đích của từng nghiên cứu Cắt DNA bằng enzyme RE loại II cùng loại với enzyme cắt plasmid (EcoRI) để tạo ra các vết cắt giống nhau.

• Tạo plasmid tái tổ hợp:

Ghép đoạn cài vào plasmid bằng cách ủ các DNA đoạn cài với plasmid với sự có mặt của enzyme DNA ligase, ta thu được DNA tái tổ hợp Phản ứng nối xảy ra theo sơ đồ được biểu diển trên hình.

Hình 3.3.a Phương pháp đơn giản dùng đầu lệch

 Phương pháp sử dụng đoạn nối (linker)

• Chọn và xử lý vector plasmid (tương tự như trên)

Định dạng
Số trang	31
Dung lượng	684,81 KB

nâng cao chất lượng heo thịt bằng kĩ thuật chuyển gen ở động vật

KẾT QUẢ CĨ THỂ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG