vấn đề động vật chuyển gen

Phương pháp này cung cấp một nguồnprotein an toàn, có giá trị cao và không thể sản xuất bằng các phương pháp khác.Chuyển gen là việc di chuyển các gen từ cấu trúc di truyền ban đầu gọi l

NHÓM THỰC HIỆN:

Phạm Thị Thùy Trâm Nguyễn Thị Thu Nguyệt

Hồ Thị Dung

Nguyễn Thị Lụa

Nguyễn Thị Hồng Hà

1.Giới thiệu:

Trong những cố gắng không ngừng của con người trong việc nâng cao sứckhoẻ, sự tiến bộ của nền khoa học hiện đại bao gồm công nghệ gen và công nghệchuyển gen đã phát hiện ra những liệu pháp gen mới dựa trên việc sản xuất proteintái tổ hợp có trong sữa của bò chuyển gen Phương pháp này cung cấp một nguồnprotein an toàn, có giá trị cao và không thể sản xuất bằng các phương pháp khác.Chuyển gen là việc di chuyển các gen từ cấu trúc di truyền ban đầu gọi là thểcho (donor) tới một cấu trúc di truyền khác có khả năng dung nạp gen đó gọi là thểnhận (recipient) thông qua một vector, một phương tiện kỹ thuật hay bằng các kíchthích là các nhân tố chuyển gen như nhân tố sinh học, lí-sinh, hoá- sinh, hoặc bằngcách tự vận động của gen Đây là một trong những kỹ thuật phức tạp nhất và cũnghứa hẹn mang lại lợi ích to lớn nhất của kỹ thuật di truyền

Động vật chuyển gen là những con vật mang những gen lạ (khác loài hoặcnhững gen tái tổ hợp) mà những gen này được đưa vào hệ gen của nó có chủ ýdưới sự can thiệp của con người Gen chuyển phải được di truyền theo mô hìnhcủa Menden và cho phép tạo ra một đàn gia súc theo các phương pháp lai tạotruyền thống Sử dụng động vật biến đổi gen có hàng loạt những ưu điểm, đó là:chúng có khả năng sinh sản được để tạo ra thế hệ động vật chuyển gen tiếp theo;khả năng sản xuất linh động, sản lượng của chúng phụ thuộc vào số lượng con vậtsản xuất; chúng có khả năng tự duy trì nguồn nguyên liệu và năng lượng cho bảnthân chúng; và trong hầu hết các sản phẩm thuốc được chế tạo từ vật nuôi, sảnphẩm được tạo ra tiện lợi nhất đó là ở dạng sữa

Ở động vật, những nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc nâng cao năng suấtnuôi trồng, tạo ra các thế hệ động vật mới, có thêm một số tính trạng mới nhưchống chịu bệnh tật, cho năng suất cao hơn, nhiều trứng hơn, tỷ lệ nạc cao hơn Hơn nữa, các động vật chuyển gen còn có khả năng sản xuất được các loạiprotein quý hiếm mà con người rất cần trong trị liệu

Kể từ những năm 1970, các nhà khoa học đã có thể chuyển một gen lạ vào vikhuẩn và bắt nó biểu hiện gen Tuy nhiên, những protein phục vụ cho nhu cầu củacon người ngày càng đòi hỏi phức tạp và cơ thể vi khuẩn không biểu hiện được vàcần đến động vật chuyển gen Sản phẩm thành công đầu tiên của con người về sảnxuất sản phẩm sinh học thông qua chuyển gen là Insulin và Hoc môn sinh trưởng

vào vi khuẩn E.coli (1982 và 1987) Năm 1998 có khoảng dưới 1% dược phẩm làprotein được tổng hợp tái tổ hợp nhưng trị giá của nó tới 12 tỷ USD Người ta dựtính rằng chỉ cần 600 con bò chuyển gen là có thể cung cấp đủ nhu cầu của cả thếgiới về một dược phẩm là 1 loại protein nào đó (ví dụ như human serum albumincho điều trị bỏng) Động vật chuyển gen được nghiên cứu nhằm các mục đích.

1 Nghiên cứu những gen gây bệnh như gen gây loạn dưỡng cơ tim, ung thư, tựmiễn dịch, hồng cầu lưỡi liềm Dùng phương pháp chuyển gen để tạo động vậtthí nghiệm mà bị loại bỏ hoặc khoá các gen nào đó để xác định chức năng củagen

2 Tạo ra các loại protein, hóc môn, yếu tố sinh trưởng dùng trong trị liệu

3 Thay đổi cấu trúc giải phẫu, sinh lý cơ quan, nội tạng ( đưa một số gen mới,loại bỏ một số gen) nhằm phục vụ mục đích cấy ghép nội tạng

Ở Việt nam, việc tạo động vật chuyển gen vẫn còn là vấn đề mới mẻ Việcnghiên cứu mới được bắt đầu vài năm gần đây và mới thực hiện được ở trên đốitượng là cá, đầu tiên là cá vàng và cá chạch là những cá có kích thước nhỏ, thờigian sinh trưởng và thành thục ngắn, rất thuận tiện cho công tác nghiên cứu trongphòng thí nghiệm Thành công của những nghiên cứu này không những mang lạihiệu quả kinh tế lớn cho sản xuất và mở rộng cho những nghiên cứu tiếp theo trênđối tượng động vật bậc cao mà còn khẳng định được sự tiến bộ vượt bậc củangành khoa học công nghệ nước ta

2 Các nguyên lý sinh học của quá trình chuyển gen.

2.1 Mục tiêu, yêu cầu

Mục tiêu của kỹ thuật chuyển gen là phải đưa một đoạn gen vào hệ gen nhâncủa tế bào nhận, có khả năng biểu hiện và di truyền ổn định… Để đạt được điều

đó, chúng ta phải làm thoả mãn và đạt được các mục tiêu, yêu cầu sau:

• Gen được chuyển phải xâm nhập vào tế bào của sinh vật chuyển gen Docác tế bào của cơ thể nhận có xu hướng tự chọn lọc và ngăn cản sự xâmnhập của các yếu tố lạ, do vậy chúng ta phải có một số biện pháp sinh lý,sinh hoá hoặc cưỡng bức để đưa các thành phần lạ vào trong tế bào làmtăng hiệu suất chuyển gen

• Tế bào thể nhận phải tiếp nhận gen lạ vào hệ gen nhân Không phải tất cảcác tế bào trong cơ thể đều có thể tiếp nhận các thành phần lạ, các cơ thểkhông giống nhau phản ứng khác nhau với sự xâm nhập của một gen lạ.Thậm chí, các mô khác nhau trong một cơ thể hay các tế bào khác nhau củacùng một mô cũng có khả năng tiếp nhận sự biến nạp một cách khác nhau

• Gen được chuyển phải được biểu hiện sau khi tiếp nhận vào hệ gen nhân.Vấn đề quan trọng là sau khi đoạn gen được đưa vào trong tế bào và được

tế bào đó chấp nhận nhưng vấn đề gen đó có khả năng biểu hiện không vàbiểu hiện như thế nào lại là một vấn đề khác Có khoảng 1% của tế bàophôi chuyển gen có chứa gen cần chuyển nhưng không phải bất cứ tế bàophôi nào cũng phát triển bình thường Khi một gen nào đó chuyển vàotrong tế bào phôi mới thụ tinh, do tính chất ngẫu nhiên nên đoạn gen có thể

chèn vào một gen cấu trúc nào đó và có thể gây lên hiện tượng gián đoạnchức năng bình thường của cơ thể đẫn đến hiện tượng khiếm khuyết, pháttriển kém, ung thư, viêm khớp hoặc hàng loạt các loại bệnh khác.

• Tế bào chứa gen biến nạp phải có khả năng tái sinh (ở thực vật) hoặc cókhả năng chuyển lại cho đời sau Đây là cơ sở cho việc duy trì cơ thểchuyển gen để chọn lọc, tăng số lượng của cơ thể chuyển gen

2.1 Biểu hiện các sản phẩm chuyển gen.

Sử dụng động vật chuyển gen như một nhà máy dược phẩm là một lựa chọnmang lại lợi nhuận cao thay cho việc nuôi cấy tế bào Đối với một số protein phứctạp (có chứa các phân tử đường, cấu trúc bậc 2, bậc 3…) thì đây là một biện pháptối ưu Những động vật này trở thành một phương tiện sản xuất có nhiều lợi íchnhư dễ dàng duy trì, tái sản xuất bằng sinh sản, năng suất thay đổi linh hoạt qua sốlượng vật nuôi, giá thành thấp và đặc biệt, sản phẩm được biểu hiện qua sữa là mộtdạng dễ sử dụng và tiện lợi

Thực tế có khá nhiều cách để thu được sản phẩm chuyển gen của cơ thể nhưthu hoạch từ máu, từ nước tiểu hoặc từ sữa Hemoglobin từ lợn chuyển gen này làmột loại protein được tạo ra và thu hoạch từ máu với hy vọng tìm ra nguồn thaythế máu người Một số loại protein được thu lại từ nước tiểu của động vật chuyểngen và họ cho rằng, có một số lợi thế khi tạo động vật chuyển gen sản xuất proteinqua nước tiểu như khong cần đợi đến khi động vật sinh sản, sản xuất liên tục,không theo chu kỳ… Tuy nhiên, bàng quang, thận không phải là cơ quan có thểsản xuất một lượng lớn và liên tục protein và việc sản xuất thuốc (protein) quađường này cần tiếp tục nghiên cứu

Một con đường chủ yếu các công ty dược phẩm và các nghiên cứu tập trungvào đó là sản suất protein qua sữa Vậy, làm thế nào để chuyển một gen vào cơ thể

và protein của gen đó được tổng hợp trong quá trình tạo sữa và bài tiết theo đườngsữa

Như chúng ta đã biết, để một gen hoạt động thì nó cần phải có gen chỉ huy, genkhởi động, gen điều hoà, gen cấu trúc Muốn protein nào đó được tổng hợp trongquá trình tạo sữa thì gen cấu trúc của nó cần phải được đưa vào 1 promotor điềukhiển hoạt động và mã hoá protein ở tuyến sữa và như vậy nó sẽ hoạt động trongquá trình tạo sữa Vì vậy, gen đó có ở mọi mô bào nhưng nó chỉ hoạt động ở tuyếnsữa và được bài tiết vào trong sữa Các gen, promoter của gen k-casein hoặc b-lactoglobunin là những promoter đích cần chèn vào Sản xuất protein qua tuyếnsữa có rất nhiều lợi thế, bao gồm:

-Tuyến sữa của động vật có vú là một cơ quan sản xuất sinh học thích nghi vớiviệc sản xuất protein và bài tiết sữa;

-Nhiều protein được sản xuất ở tuyến sữa của động vật có vú;

-Sự biểu hiện gen ở tuyến sữa của động vật có vú là chính xác về thời gian;Sảnlượng sữa được tiết ra ở động vật có vú là khá lớn

3 Các bước tạo động vật chuyển gen

Thông qua chuyển gen, ADN cho một loại protein hay dược phẩm nào đó cóthể chuyển vào động vật để sản xuất một số lượng lớn dược phẩm nào đó, baogồm:

3.1 Xác định, đánh giá và phân lập gen mong muốn.

Để bắt đầu chuyển gen, chúng ta phải xác định gen cần chuyển, đặc tính mongmuốn là gì và gen điều khiển tính trạng đó là gen nào, nằm ở đâu trong hệ gen củavật cho Ví dụ, với mục đích sản xuất protein hemoglobin của người vào lợn,người ta phải xác định tính trạng cần chuyển là protein hemoglobin ở người, tiếptheo, người ta phải xác định gen tổng hợp lên hemoglobin là gen nào, trình tự gen

đó là gì và sau đó là phải phân lập được gen đó Mục đích là tìm được gen cấu trúccủa tính trạng mình mong muốn

Để một gen hoạt động được thì nó cần phải có gen chỉ huy, gen khởi động, genđiều hoà, gen cấu trúc Vùng điều hoà có chiều dài khoảng 100 bp kết hợp với các

nhân tố điều hoà cis- hoặc trans- để tham gia vào quá trình phiên mã, để khởi

động hoặc kết thúc quá trình phiên mã của một gen Để tìm được gen cấu trúcngười ta có thể đi từ nhiều hướng khác nhau như từ ADN nhân, hoặc các sản phẩmbiểu hiện của nó là từ ARN thông tin (mARN) hoặc từ protein Khi tìm được mộtgen cấu trúc cần thiết rồi, người ta cần phân phân lập gen cấu trúc đó và kết hợpvới một promotor đã được xác định để tạo ra một tổ hợp gen cấu trúc và promotor.Đoạn gen cấu trúc trong tổ hợp này có thể được phân lập trực tiếp từ ADN của hệgen, nó bao gồm cả vùng intron và vùng exon do vậy kích thước của nó khá dài.Gen cần chuyển có thể được tổng hợp từ mARN để tạo ra cADN Kích thước đoạncADN ngắn hơn nhiều so với kích thước đoạn gen phân lập tử ADN hệ gen, dotrong mARN chỉ có đoạn mang mã (exon) Tuy nhiên, theo kinh nghiệm của nhiềutác giả thì hiệu quả chuyển gen từ ADN hệ gen cao hơn nhiều so với chuyển gentừcDNA

Hình 1 So sánh 2 loại ADN đích có thể được sử dụng trong chuyển gen vào phôi

non.

3.2 Thiết kế và biểu hiện gen vào vật mang.

3.2.1 Các loại vật mang(nhân tố chuyển gen)

Vật mang là những yếu tố cần thiết cho việc đưa các gen muốn chuyển từthể cho sang thể nhận Tuỳ theo cấu trúc gen cần chuyển mà yêu cầu các loại vậtmang khác nhau Vật mang chủ yếu là các vector sinh học, đó là một đoạn phân tửacid nucleic thường có dạng vòng, mang nhiều đặc tính trong đó có khả năng xâmnhập vào tế bào vật chủ và mượn bộ máy của tế bào vật chủ để tạo ra nhiều bảnsao giống hệt ban đầu Các loại vector dùng trong kỹ thuật chuyển gen là:

Plasmid( nhóm plasmid tự nhiên, plasmid nhân tạo ), phage, cosmide, virus của eukaryote (SV40, adenovirus, retrovirus, herpes virus ), nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men và động vật có vú.

Các đặc tính cần thiết của một vector:

- Có khả năng sao chép tích cực và độc lập trong tế bào vật chủ;

- Vector phải có kích thước càng nhỏ càng tốt để thu nhận ADN ngoại lai

có kích thước tối đa;

- Vector phải cho phép phát hiện dễ dàng so với tế bào không mang vectornày (thường là kháng kháng sinh hoặc sản sinh enzyme b-gallactosidase);

- Vector phải có khả năng tồn tại trong tế bào chủ trong nhiều thế hệ;

- Vector phải có vị trí nhận biết duy nhất (tồn tại vị trí cho mỗi enzyme giớihạn, càng nhiều loại enzyme càng tốt)

3.2.2 Chuyển gen vào vật mang

Sau khi đã tạo được tổ hợp gen biểu hiện, chèn tổ hợp này vàovector thích hợp có thể là plasmid hoặc phage để tạo dòng trong tế bào vikhuẩn Sự chuyển nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn có thể được kiểm trabằng cách nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường chọn lọc sử dụng kháng sinhtương ứng với gen kháng kháng sinh có trong plasmid đó Số lượng tổ hợpgen chuyển và plasmid sẽ được khuếch đại lên theo sự phân chia của tế bào

vi khuẩn Hàng triệu plasmid sẽ được tách khỏi vi khuẩn và đoạn gen mongmuốn sẽ dược cắt khỏi plasmid bằng enzyme giới hạn Sau khi cắt khỏiplasmid, tổ hợp gen biểu hiện có thể thu lại được bằng cách thôi gel sau khiđiện di

Tổ hợp plasmid mang gen chuyển cũng được biến nạp vào tế bàoeukaryote nuôi cấy để đánh giá sự biểu hiện của gen Đoạn gen ngoại lai saukhi tinh sạch từ gel agarose được hoà tan trong đèm chuyên dùng cho vi tiêm(đệm TRIS-EDTA) Dung dịch ADN dùng cho vi tiêm có nồng độ từ l-5mg/ml

3.3 Thu nhận tế bào nhận.

Ở động vật có vú thì giai đoạn biến nạp gen thích hợp nhất là trứng ở giaiđoạn tiền nhân (pronucleus), giai đoạn mà nhân của tinh trùng và trứng chưadung hợp với nhau Ở giai đoạn này tổ hợp gen lạ có cơ hội xâm nhập vào hệgen của động vật nhờ sự tái tổ hợp ADN của tinh trùng và của trứng Do tế bàophôi chưa phân chia và phân hóa nên tổ hợp gen lạ được biến nạp vào giai

đoạn này sẽ có mặt ở tất cả các tế bào kể cả tế bào sinh sản của động vậttrưởng thành sau này Đối với động vật có vú, trứng chín được thu nhận bằngphương pháp sử dụng kích dục tố để gây siêu bài noãn theo chương trình đãđược xây dựng cho mỗi loài hoặc bằng phương pháp nuôi cấy trứng trong ống

nghiệm (in-vitro) Sau đó thụ tinh nhân tạo để tạo ra trứng tiền nhân

3.4 Chuyển vật mang vào tế bào nhận.

Tổ hợp gen ngoại lai có thể được chuyển vào tế bào nhận theo nhiều cáchkhác nhau như, các phương pháp chính bao gồm:

1 Vi tiêm (microinjection), là một phương pháp sử dụng các thiết bị vi thao

tác cực nhạy với vi kim được thực hiện dưới kính hiển vi để tiêm một đoạnADN trong dịch tiêm vào phôi non của động vật

2 Chuyển gen bằng sử dụng tế bào gốc(stem cell) Các tế bào phôi ở giai

đoạn 16-32 tế bào là các tế bào đa năng (totipotent) nghĩa là có thể phânhóa thành bất kỳ loại mô nào Người ta đã tiến hành nuôi cấy và biến nạpgen vào những tế bào này bằng cách nhiễm với vector virus Sau khi chọn

ra những tế bào đã được biến nạp gen lạ người ta đưa nó vào phôi khác ởgiai đoạn phôi nang để tạo ra động vật chuyển gen thể khảm Tỉ lệ các phôisống sót sau thao tác là khá cao (80%), trong số đó 90% biểu hiện tínhtrạng mới Tiếp theo, người ta lai tạo qua các đời để thu được động vậtđồng hợp tử về các tính trạng mà ta chuyển vào

3 Chuyển gen bằng súng bắn gen (gene gun), là biện pháp chuyển gen xuất

hiện cuối những năm 1980 Biện pháp này sử dụng các hạt bụi volframhoặc bụi vàng trộn lẫn ADN (tổ hợp gen cần chuyển) và bắn vào khối mô,

tổ chức cần nhận nhờ áp lực khí helium (3500 psi) Đây là biện phápchuyển gen có nhiều ưu điểm và hiệu quả, ở Việt nam đã có một số cơ quannghiên cứu áp dụng kỹ thuật này như Viện Di truyền Nông nghiệp, ViệnCông nghệ sinh học nhưng kỹ thuật này chỉ chủ yếu tiến hành đối với môthực vật

4 Phương pháp xung điện (electroporation) Phương pháp này tạo cho các

màng sinh học dễ thấm và dễ dung hợp nhờ sự kích thích của điện trường,Một yếu tố khác đó là, xung điện tạo ra những lỗ thủng nhỏ trên bề mặt củamàng tế bào, nhờ vậy rất nhiều loại plasmid có thể chuyển qua được.Phương pháp này có hiệu quả cao, phù hợp cho việc biến nạp với số lượnglớn tế bào Tuy nhiên tỷ lệ tế bào chết cũng khá nhieù và một một loại tếbào cũng cần đòi hỏi biện pháp tiền xử lý thích hợp

5 Qua trung gian virus(virus mediated), là biện pháp chuyển gen khá đặc

hiệu để chuyển gen vào đối tượng nhận Nguyên lý của phương pháp nàykhá đơn giản Khi xâm nhập vào tế bào vật chủ, virus thường chuyển mộtđoạn gen cỉa nó vào tế bào chủ và bắt tế bào chủ phải tổng hợp nguyên vậtliệu cho nó Phương pháp này mở ra một triển vọng cũng như là một tháchthức đối với khoa học để điều khiển và lợi dụng các đặc điểm có lợi để sửachữa khuyết tật di truyền trong liệu pháp gen Chuyển gen sử dụng trung

gian virus (retrovirus- là loại virus không gây bệnh) có lợi thế là không làmthay đổi hoạt động của gen cũ của cơ thể nhưng gây nên mối nghi ngại việctạo ra virus mới, lan truyền các thành phần của virus để tạo ra một loạivirus mạnh hơn, nguy hiểm hơn.

6 Chuyển qua trung gian tinh trùng (sperm mediated), là một phương pháp

chuyển gen sử dụng tinh trùng ủ với liposome có chứa ADN plasmide vàdùng thụ tinh nhân tạo Phương pháp này được thực hiện khá thành công ởthỏ Phương pháp này cũng đang được nghiên cứu và áp dụng đối vớichuyển gen ở lợn, nhằm tạo ra nguồn cơ quan, tổ chức phục vụ cho cấyghép

3.5 Phân tích hiệu quả của việc chuyển gen.

Để khẳng định động vật có được chuyển gen lạ vào hay không người taphải kiểm tra xem gen lạ có xâm nhập vào được bộ máy di truyền của động vật

và có biểu hiện được hay không Đây là công việc đòi hỏi nhiều thời gian vàcông sức, các phương pháp xác định bao gồm:

3.5.1 Phương pháp nhân gen

Phương pháp để sàng lọc sơ bộ trước tiên là phản ứng nhân gen (PCR ) sửdụng cặp mồi đặc hiệu để nhân đoạn gen được chuyển Phương pháp PCR chophép nhân rất nhanh (hàng triệu lần trong một hai giờ) và chính xác từng đoạnADN riêng biệt

Đây thật sự là phương pháp khá hiện đại, kinh tế và thuận tiện cho việc xácđịnh sự có mặt của một gen nào đó trong tế bào với độ chính xác tương dốicao Sự có mặt của băng ADN với kích thước mong muốn khi điện di sảnphẩm PCR chứng tỏ sự có mặt của gen ngoại lai trong hệ gen vật chủ Tuynhiên, đây là một phương pháp có độ nhạy cao, do đó kết quả có thể bị nhiễu

vì PCR nhân các đoạn gen không phân biệt đó là ADN ngoài nhiễm sắc thể haykhông hoặc có thể bị lây nhiễm ADN trong quá trình thao tác

Do tính phức tạp của hệ gen vật chủ, cặp mồi cũng có thể bắt cặp với nhữngđoạn không đặc hiệu trong hệ gen vật chủ tạo nên kết quả dương tính khôngchính xác Để nâng cao tính chính xác của việc xác định sự hội nhập của genngoại lai, người ta còn sử dụng phương pháp Southern blot Đây là mộtphương pháp khá tốn kém nhưng là một phương pháp rất hữu hiệu để xác định

sự có mặt của gen ngoại lai và có thể phát hiện số lượng bản sao của gen hộinhập

Trong phần lớn các phòng thí nghiệm, người ta sử dụng PCR để sàng lọc sơ

bộ hàng trăm thậm chí hàng nghìn cá thể được chuyển gen sau đó sử dụng cácphương pháp khác để xác nhận lại kết quả PCR mà cho dương tính

3.5.2 Phương pháp Southern blot.

Đây là phương pháp sử dụng để định vi những trình tự đặc biệt trên ADN

hệ gen ADN mẫu được cắt bằng các loại enzyme giới hạn sau đó được điện ditrên gel (agarose hoặc polyacrylamide), tiếp theo mẫu được làm biến tính và

chuyển lên màng lai nitrocellulose, ở đó, ADN dò có đánh dấu phóng xạ (hoặckhông phóng xạ) được sử dụng để lai ghép Tiếp theo, kết quả được phân tích

và đánh giá

3.5.3 Phương pháp Dot blot và slot blot.

Hai phương pháp này được áp dụng để định lượng tương đối một loại ADNđặc trưng nào đó cũng bằng phương pháp lai phân tử và đánh dấu phóng xạhoặc không phóng xạ.Tuy gen chuyển có thể hội nhập vào hệ gen vật chủnhưng có thể biểu hiện hoặc không Các phương pháp trên cho phép kiểm tra

sự có mặt của gen chuyển ở trong cơ thể vật chuyển gen, nhưng sự biểu hiệncủa gen là bước cuối cùng và quan trọng nhất để đánh giá động vật chuyểngen Có hai cách đánh giá sự biểu hiện của gen ngoại lai trong cơ thể vật chủ làphát hiện sự có mặt của mARN hoặc sự có mặt của protein do gen đó qui địnhđược tổng hợp

3.5.4 Các phương pháp phát hiện mRNA.

Để xác định gen chuyển có được hoạt động không, người ta có thể xác nhận

sự biểu hiện của gen thông qua sự có mặt của mARN bằng Northem blot, ARN

dot blot (kỹ thuật lai phân tử mà đối tượng là mARN), RT-PCR (PCR

ngược) Trong các phương pháp trên thì RT-PCR là phương pháp nhạy và

nhanh hơn cả Chỉ cần một lượng ARN khuôn rất nhỏ để tổng hợp nên sợicDNA đầu tiên bằng enzyme phiên mã ngược Sợi cDNA sau đó được khuếchđại lên nhờ PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen ngoại lai đó

3.5.5 Các phương pháp phát hiện protein

Một cách khác để theo dõi thế hệ sau của động vật chuyển gen có gen lạxuất hiện không, tức là có tổng hợp ra protein mới hay không, trong trườnghợp có sẵn kháng thể kháng protein, kỹ thuật lai thấm protein (Westemblotting) có thể được sử dụng để phát hiện sự biểu hiện của gen đó Nội dungcủa phương pháp này có thể tóm tắt như sau: Điện di protein tổng số trên gelSDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

để tách các protein theo trọng lượng phân tử khác nhau Chuyển protein sangmàng lai (nitrocellulose) Lai với kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody)

có đánh dấu phóng xạ Phản ứng dương tính nói lên protein của gen lạ đã

được tổng hợp Người ta có thể sử dụng kỹ thuật miễn dịch enzyme (ELISA)

hoặc kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA) để phát hiện protein lạ trong động vật

3.6 Tạo dòng động vật chuyển gen

Động vật chuyển gen có thể sử dụng làm nguồn nguyên liệu ban đầu để tạodòng động vật chuyển gen Con vật mới được tạo ra gọi là Fo (foundationanimal) khi có những biểu hiện gen được chuyển Lai ghép để nhân lên dòngchuyển gen có gen chuyển ở một vị trí (locus) nào đó) và là đồng hợp tử.Thông thường, khi chuyển gen thì kết quả ban đầu sẽ là gen được chuyển vào

nhiều vị trí trong hệ gen và ở trạng thái dị hợp tử và cũng không thể điều khiểnđược số lượng vị trí kết hợp Các vị trí kết hợp khác nhau có những biểu hiệnkhác nhau, nhiều nghiên cứu cho thấy rằng, có sự khác biệt đáng kể giữa cáccon của thế hệ sau của động vật chuyển gen Và hy vọng rằng, sự di truyền cácgen đó tuân theo các định luật Menden.

4 Chuyển gen bằng kỹ thuật vi tiêm.

Việc chuyển gen bằng vi tiêm vào phôi non của động vật được tiến hànhnhờ sự trợ giúp của các máy móc và thiết bị vô cùng chính xác và chuyên dụng.Trong số các biện pháp chuyển gen, cho đến nay, vi tiêm là biện pháp hiệu quảnhất trong việc chuyển gen vào tế bào động vật đặc biệt là phôi của động vật có

vú Trường hợp vi tiêm và phôi non để tạo ra động vật chuyển gen thành công đầutiên là của Gordon trên chuột Tuy nhiên, gen đó đã không biểu hiện mặc dù tổhợp gen được thiết kế trên cấu trúc tái tổ hợp của virus Trường hợp quan sát thấythay đổi về kiểu hình đầu tiên ở chuột chuyển gen hocmoon sinh trưởng được mô

tả năm 1982 nhờ công trình của Palmiter và cộng sự và đến nay, hàng trăm bài báoliên quan đến việc chuyển gen bằng kỹ thuật vi tiêm được xuất bản hàng năm Kỹthuật vi tiêm lượng ADN thuần khiết vào phôi non của động vật tạo ra việc kếthợp đoạn gen đó vào trong bộ nhiễm sắc thể của trứng mới thụ tinh Nếu nguyênliệu di truyền đó được dung hợp vào nhiễm sắc thể thì con non sinh ra sẽ có bảncopy thông tin di truyền ở tất cả các tế bào ADN ngoại lai cần phải được kết hợpvào bộ gen của tế bào chủ trước khi được phân bào lần đầu tiên, nếu không, ta sẽthu được con vật chuyển gen thể khảm Chính vì vậy, gen cần phải được chuyểnvào ở giai đoạn sớm nhất có thể được ví dụ như giai đoạn nhân non, lý tưởng nhất

là một vài giờ sau khi thụ tinh, khi đó nhân của tinh trùng và nhân của trứng có thểquan sát được dưới kính hiển vi Gen chuyển có thể được tiêm vào bất cứ nhânnào, tuy nhiên, nhiễm sắc thể X và Y cũng có thể tiếp nhận gen chuyển và có thểcho kiểu hình khác nhau, như vậy chúng ta có thể lựa chọn tiền nhân thích hợp.Bình thường nhân đực to hơn và gần phía ngoài hơn là nhân cái (hình )

4.1 Điều kiện cơ bản để thực hiện vi tiêm.

Brinster và các cộng sự (1985) đã thông báo về những thay đổi trongphương pháp luận đối với chuyển gen thông qua vi tiêm vào phôi chuột và kết quảcuối cùng chỉ ra rằng cần có những điều kiện cơ bản để tăng tần số hoà nhập củaADN ngoại lai vào tế bào thể nhận Có một vài nhân tố quan trọng nhất, đó là:

· Nồng độ ADN được tiêm: Nồng độ ADN được tiêm có thể là một nhân tốhạn chế đối với hiệu quả hoà nhập Nồng độ tối ưu là 1-2 ng/ml, tức là khoảng100-1000 bản sao của đoạn ADN

· Tạo đầu dính (non-blunt end): Một phân tử ADN mạch thẳng sẽ đượctiêm vào hiệu quả hơn nếu được cắt bởi enzym endonuclease tạo ra hai đầu dính

· Vị trí tiêm ADN vào trong tế bào: Tiêm ADN ngoại lai vào nhân thườngcho hiệu quả cao hơn vào tế bào chất

· Kiểu tế bào được tiêm: Tiêm ADN lạ vào nhân trứng hoặc nhân tinh trùngcũng làm thay đổi kiểu gen và kiểu hình của hợp tử do trứng hoặc tinh trùng này

tạo ra Một cách khác cho hiệu quả cao hơn là tiêm vào nhân của hợp tử Tuynhiên, bằng cách này người ta tiến hành ở bò và cừu thì hiệu quả cũng chỉ đạt 0 2-2% Sau đó những tiến bộ đã được thông báo trong lĩnh vực nghiên cứu các tế bàocuống phôi (ES) và nguyên bào tinh, nguyên bào noãn (PGC) Những dòng tế bàonày đã cho phép sự hoà nhập của ADN lạ vào hệ gen của động vật một cách cóhiệu quả cao.

· Nguồn vật liệu di truyền được tạo phôi: Hiệu quả gắn kết ADN lạ vàogenome của phôi lai giữa các nòi cho hiệu quả cao hơn vào genome của phôi đốivới các dòng cận huyết

4.2 Quy trình tạo động vật chuyển gen

(1) Gen có chức năng nào đó được lựa chọn và phân lập trong phòng thínghiệm

(2) Một con vật cho được gây siêu bài noãn và thu hoạch phôi từ ống dẫntrứng

(3) Gen được đưa vào trứng được thụ tinh bằng kỹ thuật vi tiêm

(4) Phôi chuyển gen được đưa vào con vật nhận mà có thể cho ra đời con non

Gía thết bị cần thiết cho thao tác chuyển gen bằng vi tiêm khoảng 50ngàn-80ngàn USD và bao gồm:

· Hệ thống kính hiển vi độ phân giải cao với vật kính Nomarski hoặcHoffman(Kính hiển vi soi ngược) với thị kính là 10x-15x và vật kính 20x hoặc40x để quan sát nhân non

· Tủ ấm CO2, để duy trì nhiệt độ là 37-38oC với nồng độ CO2 là 5%-6%

· 1 cặp vi thao tác Litz hoặc tương đương có tác dụng điều khiển kim vi tiêm

và kim giữ;

· Cặp syringe điều khiển lượng dung dịch trong kim vi tiêm và kim giữ

· Thiết bị giữ và điều khiển syringe,

· Các thiết bị chế tạo và gia cố kim ống capillary dùng đế chế tạo kim vi tiêm,kim giữ và kim nạp

·Dầu parafin, agar và các hoá chất cần thiết khác

· Bàn chống rung, kính hiển vi soi nổi, dụng cụ phẫu thuật và vi phẫu thuật,

4.4 Các gen dùng để chuyển vào động vật.

Cho đến nay, người ta đã chuyển khá nhiều gen lạ có nguồn gốc từ người,động vật, thực vật và vi sinh vật vào các loại động vật như chuột, thỏ, cá và cácloại vật nuôi như bò, cừ, dê, lợn , gà, chim thậm chí cả vào muỗi

Động vật

nhận

Gen và chức năng của chúng

Cá -Gen sinh trưởng và yếu tố sinh trưởng (fGH, hGH, bGH) d-crystallin

(gà), b-gallactosidase, kháng hygromycine, protein chống đông lạnh, ÀP,a-globin, neomicine, phosphats-transferase, liciferase

Lợn -Các loại gen hóc môn sinh trưởng và yếu tố sinh trưởng

(mMT, hGH, bGH, PRL-bGH, hGRF, alb-hGRF, hGF và mMT-bGH

mMT-Chuột hGH, rGH, hGRF, gen mã hoá luciferase

5 Ứng dụng của chuyển gen thông qua vi tiêm.

Ngày nay, chuyển gen nói chung và vi tiêm ADN nói riêng như là một cuộccách mạng trong ngành chăn nuôi trên thế giới Mục tiêu chính của chăn nuôi làtăng khả năng sinh sản, tăng hiệu quả chăn nuôi, tăng năng suất sản phẩm và tăngkhả năng chống bệnh Do chuyển gen làm thay đổi cấu trúc vật chất di truyền nên

có thể tạo ra bước nhảy vọt vế khả năng của vật nuôi mà trong tự nhiên không cóđược Những thành tựu và ứng dụng tạo động vật chuyển gen nhờ vi tiêm như sau: