chuyên đề kỹ thuật di truyền vấn đề động vật chuyển gen

1 NHÓM THỰC HIỆN: Phạm Thị Thùy Trâm Nguyễn Thị Thu Nguyệt Hồ Thị Dung Nguyễn Thị Lụa Nguyễn Thị Hồng Hà 1.Giới thiệu: Trong những cố gắng không ngừng của con người trong việc nâng cao sức khoẻ, sự tiến bộ của nền khoa học hiện đại bao gồm công nghệ gen và công nghệ chuyển gen đã phát hiện ra những liệu pháp gen mới dựa trên việc sản xuất protein tái tổ hợp có trong sữa của bò chuyển gen. Phương pháp này cung cấp một nguồn protein an toàn, có giá trị cao và không thể sản xuất bằng các phương pháp khác. Chuyển gen là việc di chuyển các gen từ cấu trúc di truyền ban đầu gọi là thể cho (donor) tới một cấu trúc di truyền khác có khả năng dung nạp gen đó gọi là thể nhận (recipient) thông qua một vector, một phương tiện kỹ thuật hay bằng các kích thích là các nhân tố chuyển gen như nhân tố sinh học, lí-sinh, hoá- sinh, hoặc bằng cách tự vận động của gen. Đây là một trong những kỹ thuật phức tạp nhất và cũng hứa hẹn mang lại lợi ích to lớn nhất của kỹ thuật di truyền. Động vật chuyển gen là những con vật mang những gen lạ (khác loài hoặc những gen tái tổ hợp) mà những gen này được đưa vào hệ gen của nó có chủ ý dưới sự can thiệp của con người. Gen chuyển phải được di truyền theo mô hình của Menden và cho phép tạo ra một đàn gia súc theo các phương pháp lai tạo truyền thống. Sử dụng động vật biến đổi gen có hàng loạt những ưu điểm, đó là: chúng có khả năng sinh sản được để tạo ra thế hệ động vật chuyển gen tiếp theo; khả năng sản xuất linh động, sản lượng của chúng phụ thuộc vào số lượng con vật sản xuất; chúng có khả năng tự duy trì nguồn nguyên liệu và năng lượng cho bản thân chúng; và trong hầu hết các sản phẩm thuốc được chế tạo từ vật nuôi, sản phẩm được tạo ra tiện lợi nhất đó là ở dạng sữa. Ở động vật, những nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc nâng cao năng suất nuôi trồng, tạo ra các thế hệ động vật mới, có thêm một số tính trạng mới như chống chịu bệnh tật, cho năng suất cao hơn, nhiều trứng hơn, tỷ lệ nạc cao hơn. Hơn nữa, các động vật chuyển gen còn có khả năng sản xuất được các loại protein quý hiếm mà con người rất cần trong trị liệu. Kể từ những năm 1970, các nhà khoa học đã có thể chuyển một gen lạ vào vi khuẩn và bắt nó biểu hiện gen. Tuy nhiên, những protein phục vụ cho nhu cầu của con người ngày càng đòi hỏi phức tạp và cơ thể vi khuẩn không biểu hiện được và cần đến động vật chuyển gen. Sản phẩm thành công đầu tiên của con người về sản xuất sản phẩm sinh học thông qua chuyển gen là Insulin và Hoc môn sinh trưởng 2 vào vi khuẩn E.coli (1982 và 1987). Năm 1998 có khoảng dưới 1% dược phẩm là protein được tổng hợp tái tổ hợp nhưng trị giá của nó tới 12 tỷ USD. Người ta dự tính rằng chỉ cần 600 con bò chuyển gen là có thể cung cấp đủ nhu cầu của cả thế giới về một dược phẩm là 1 loại protein nào đó (ví dụ như human serum albumin cho điều trị bỏng). Động vật chuyển gen được nghiên cứu nhằm các mục đích. 1. Nghiên cứu những gen gây bệnh như gen gây loạn dưỡng cơ tim, ung thư, tự miễn dịch, hồng cầu lưỡi liềm. Dùng phương pháp chuyển gen để tạo động vật thí nghiệm mà bị loại bỏ hoặc khoá các gen nào đó để xác định chức năng của gen. 2. Tạo ra các loại protein, hóc môn, yếu tố sinh trưởng dùng trong trị liệu 3. Thay đổi cấu trúc giải phẫu, sinh lý cơ quan, nội tạng ( đưa một số gen mới, loại bỏ một số gen) nhằm phục vụ mục đích cấy ghép nội tạng. Ở Việt nam, việc tạo động vật chuyển gen vẫn còn là vấn đề mới mẻ. Việc nghiên cứu mới được bắt đầu vài năm gần đây và mới thực hiện được ở trên đối tượng là cá, đầu tiên là cá vàng và cá chạch là những cá có kích thước nhỏ, thời gian sinh trưởng và thành thục ngắn, rất thuận tiện cho công tác nghiên cứu trong phòng thí nghiệm. Thành công của những nghiên cứu này không những mang lại hiệu quả kinh tế lớn cho sản xuất và mở rộng cho những nghiên cứu tiếp theo trên đối tượng động vật bậc cao mà còn khẳng định được sự tiến bộ vượt bậc của ngành khoa học công nghệ nước ta. 2 Các nguyên lý sinh học của quá trình chuyển gen. 2.1 Mục tiêu, yêu cầu Mục tiêu của kỹ thuật chuyển gen là phải đưa một đoạn gen vào hệ gen nhân của tế bào nhận, có khả năng biểu hiện và di truyền ổn định… Để đạt được điều đó, chúng ta phải làm thoả mãn và đạt được các mục tiêu, yêu cầu sau: • Gen được chuyển phải xâm nhập vào tế bào của sinh vật chuyển gen. Do các tế bào của cơ thể nhận có xu hướng tự chọn lọc và ngăn cản sự xâm nhập của các yếu tố lạ, do vậy chúng ta phải có một số biện pháp sinh lý, sinh hoá hoặc cưỡng bức để đưa các thành phần lạ vào trong tế bào làm tăng hiệu suất chuyển gen. • Tế bào thể nhận phải tiếp nhận gen lạ vào hệ gen nhân. Không phải tất cả các tế bào trong cơ thể đều có thể tiếp nhận các thành phần lạ, các cơ thể không giống nhau phản ứng khác nhau với sự xâm nhập của một gen lạ. Thậm chí, các mô khác nhau trong một cơ thể hay các tế bào khác nhau của cùng một mô cũng có khả năng tiếp nhận sự biến nạp một cách khác nhau. • Gen được chuyển phải được biểu hiện sau khi tiếp nhận vào hệ gen nhân. Vấn đề quan trọng là sau khi đoạn gen được đưa vào trong tế bào và được tế bào đó chấp nhận nhưng vấn đề gen đó có khả năng biểu hiện không và biểu hiện như thế nào lại là một vấn đề khác. Có khoảng 1% của tế bào phôi chuyển gen có chứa gen cần chuyển nhưng không phải bất cứ tế bào phôi nào cũng phát triển bình thường. Khi một gen nào đó chuyển vào trong tế bào phôi mới thụ tinh, do tính chất ngẫu nhiên nên đoạn gen có thể 3 chèn vào một gen cấu trúc nào đó và có thể gây lên hiện tượng gián đoạn chức năng bình thường của cơ thể đẫn đến hiện tượng khiếm khuyết, phát triển kém, ung thư, viêm khớp hoặc hàng loạt các loại bệnh khác. • Tế bào chứa gen biến nạp phải có khả năng tái sinh (ở thực vật) hoặc có khả năng chuyển lại cho đời sau. Đây là cơ sở cho việc duy trì cơ thể chuyển gen để chọn lọc, tăng số lượng của cơ thể chuyển gen. 2.1 Biểu hiện các sản phẩm chuyển gen. Sử dụng động vật chuyển gen như một nhà máy dược phẩm là một lựa chọn mang lại lợi nhuận cao thay cho việc nuôi cấy tế bào. Đối với một số protein phức tạp (có chứa các phân tử đường, cấu trúc bậc 2, bậc 3…) thì đây là một biện pháp tối ưu. Những động vật này trở thành một phương tiện sản xuất có nhiều lợi ích như dễ dàng duy trì, tái sản xuất bằng sinh sản, năng suất thay đổi linh hoạt qua số lượng vật nuôi, giá thành thấp và đặc biệt, sản phẩm được biểu hiện qua sữa là một dạng dễ sử dụng và tiện lợi. Thực tế có khá nhiều cách để thu được sản phẩm chuyển gen của cơ thể như thu hoạch từ máu, từ nước tiểu hoặc từ sữa. Hemoglobin từ lợn chuyển gen này là một loại protein được tạo ra và thu hoạch từ máu với hy vọng tìm ra nguồn thay thế máu người. Một số loại protein được thu lại từ nước tiểu của động vật chuyển gen và họ cho rằng, có một số lợi thế khi tạo động vật chuyển gen sản xuất protein qua nước tiểu như khong cần đợi đến khi động vật sinh sản, sản xuất liên tục, không theo chu kỳ… Tuy nhiên, bàng quang, thận không phải là cơ quan có thể sản xuất một lượng lớn và liên tục protein và việc sản xuất thuốc (protein) qua đường này cần tiếp tục nghiên cứu. Một con đường chủ yếu các công ty dược phẩm và các nghiên cứu tập trung vào đó là sản suất protein qua sữa. Vậy, làm thế nào để chuyển một gen vào cơ thể và protein của gen đó được tổng hợp trong quá trình tạo sữa và bài tiết theo đường sữa. Như chúng ta đã biết, để một gen hoạt động thì nó cần phải có gen chỉ huy, gen khởi động, gen điều hoà, gen cấu trúc. Muốn protein nào đó được tổng hợp trong quá trình tạo sữa thì gen cấu trúc của nó cần phải được đưa vào 1 promotor điều khiển hoạt động và mã hoá protein ở tuyến sữa và như vậy nó sẽ hoạt động trong quá trình tạo sữa. Vì vậy, gen đó có ở mọi mô bào nhưng nó chỉ hoạt động ở tuyến sữa và được bài tiết vào trong sữa. Các gen, promoter của gen k-casein hoặc b- lactoglobunin là những promoter đích cần chèn vào. Sản xuất protein qua tuyến sữa có rất nhiều lợi thế, bao gồm: -Tuyến sữa của động vật có vú là một cơ quan sản xuất sinh học thích nghi với việc sản xuất protein và bài tiết sữa; -Nhiều protein được sản xuất ở tuyến sữa của động vật có vú; -Sự biểu hiện gen ở tuyến sữa của động vật có vú là chính xác về thời gian;Sản lượng sữa được tiết ra ở động vật có vú là khá lớn. 4 3 Các bước tạo động vật chuyển gen Thông qua chuyển gen, ADN cho một loại protein hay dược phẩm nào đó có thể chuyển vào động vật để sản xuất một số lượng lớn dược phẩm nào đó, bao gồm: 3.1 Xác định, đánh giá và phân lập gen mong muốn. Để bắt đầu chuyển gen, chúng ta phải xác định gen cần chuyển, đặc tính mong muốn là gì và gen điều khiển tính trạng đó là gen nào, nằm ở đâu trong hệ gen của vật cho. Ví dụ, với mục đích sản xuất protein hemoglobin của người vào lợn, người ta phải xác định tính trạng cần chuyển là protein hemoglobin ở người, tiếp theo, người ta phải xác định gen tổng hợp lên hemoglobin là gen nào, trình tự gen đó là gì và sau đó là phải phân lập được gen đó. Mục đích là tìm được gen cấu trúc của tính trạng mình mong muốn. Để một gen hoạt động được thì nó cần phải có gen chỉ huy, gen khởi động, gen điều hoà, gen cấu trúc. Vùng điều hoà có chiều dài khoảng 100 bp kết hợp với các nhân tố điều hoà cis- hoặc trans- để tham gia vào quá trình phiên mã, để khởi động hoặc kết thúc quá trình phiên mã của một gen. Để tìm được gen cấu trúc người ta có thể đi từ nhiều hướng khác nhau như từ ADN nhân, hoặc các sản phẩm biểu hiện của nó là từ ARN thông tin (mARN) hoặc từ protein. Khi tìm được một gen cấu trúc cần thiết rồi, người ta cần phân phân lập gen cấu trúc đó và kết hợp với một promotor đã được xác định để tạo ra một tổ hợp gen cấu trúc và promotor. Đoạn gen cấu trúc trong tổ hợp này có thể được phân lập trực tiếp từ ADN của hệ gen, nó bao gồm cả vùng intron và vùng exon do vậy kích thước của nó khá dài. Gen cần chuyển có thể được tổng hợp từ mARN để tạo ra cADN. Kích thước đoạn cADN ngắn hơn nhiều so với kích thước đoạn gen phân lập tử ADN hệ gen, do trong mARN chỉ có đoạn mang mã (exon). Tuy nhiên, theo kinh nghiệm của nhiều tác giả thì hiệu quả chuyển gen từ ADN hệ gen cao hơn nhiều so với chuyển gen từcDNA. Hình 1. So sánh 2 loại ADN đích có thể được sử dụng trong chuyển gen vào phôi non. 5 3.2 Thiết kế và biểu hiện gen vào vật mang. 3.2.1 Các loại vật mang(nhân tố chuyển gen) Vật mang là những yếu tố cần thiết cho việc đưa các gen muốn chuyển từ thể cho sang thể nhận. Tuỳ theo cấu trúc gen cần chuyển mà yêu cầu các loại vật mang khác nhau. Vật mang chủ yếu là các vector sinh học, đó là một đoạn phân tử acid nucleic thường có dạng vòng, mang nhiều đặc tính trong đó có khả năng xâm nhập vào tế bào vật chủ và mượn bộ máy của tế bào vật chủ để tạo ra nhiều bản sao giống hệt ban đầu. Các loại vector dùng trong kỹ thuật chuyển gen là: Plasmid( nhóm plasmid tự nhiên, plasmid nhân tạo ), phage, cosmide, virus của eukaryote (SV40, adenovirus, retrovirus, herpes virus ), nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men và động vật có vú. Các đặc tính cần thiết của một vector: - Có khả năng sao chép tích cực và độc lập trong tế bào vật chủ; - Vector phải có kích thước càng nhỏ càng tốt để thu nhận ADN ngoại lai có kích thước tối đa; - Vector phải cho phép phát hiện dễ dàng so với tế bào không mang vector này (thường là kháng kháng sinh hoặc sản sinh enzyme b-gallactosidase); - Vector phải có khả năng tồn tại trong tế bào chủ trong nhiều thế hệ; - Vector phải có vị trí nhận biết duy nhất (tồn tại vị trí cho mỗi enzyme giới hạn, càng nhiều loại enzyme càng tốt) 3.2.2 Chuyển gen vào vật mang Sau khi đã tạo được tổ hợp gen biểu hiện, chèn tổ hợp này vào vector thích hợp có thể là plasmid hoặc phage để tạo dòng trong tế bào vi khuẩn. Sự chuyển nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn có thể được kiểm tra bằng cách nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường chọn lọc sử dụng kháng sinh tương ứng với gen kháng kháng sinh có trong plasmid đó. Số lượng tổ hợp gen chuyển và plasmid sẽ được khuếch đại lên theo sự phân chia của tế bào vi khuẩn. Hàng triệu plasmid sẽ được tách khỏi vi khuẩn và đoạn gen mong muốn sẽ dược cắt khỏi plasmid bằng enzyme giới hạn. Sau khi cắt khỏi plasmid, tổ hợp gen biểu hiện có thể thu lại được bằng cách thôi gel sau khi điện di. Tổ hợp plasmid mang gen chuyển cũng được biến nạp vào tế bào eukaryote nuôi cấy để đánh giá sự biểu hiện của gen. Đoạn gen ngoại lai sau khi tinh sạch từ gel agarose được hoà tan trong đèm chuyên dùng cho vi tiêm (đệm TRIS-EDTA). Dung dịch ADN dùng cho vi tiêm có nồng độ từ l-5 mg/ml 3.3 Thu nhận tế bào nhận. Ở động vật có vú thì giai đoạn biến nạp gen thích hợp nhất là trứng ở giai đoạn tiền nhân (pronucleus), giai đoạn mà nhân của tinh trùng và trứng chưa dung hợp với nhau. Ở giai đoạn này tổ hợp gen lạ có cơ hội xâm nhập vào hệ gen của động vật nhờ sự tái tổ hợp ADN của tinh trùng và của trứng. Do tế bào phôi chưa phân chia và phân hóa nên tổ hợp gen lạ được biến nạp vào giai 6 đoạn này sẽ có mặt ở tất cả các tế bào kể cả tế bào sinh sản của động vật trưởng thành sau này. Đối với động vật có vú, trứng chín được thu nhận bằng phương pháp sử dụng kích dục tố để gây siêu bài noãn theo chương trình đã được xây dựng cho mỗi loài hoặc bằng phương pháp nuôi cấy trứng trong ống nghiệm (in-vitro). Sau đó thụ tinh nhân tạo để tạo ra trứng tiền nhân . 3.4 Chuyển vật mang vào tế bào nhận. Tổ hợp gen ngoại lai có thể được chuyển vào tế bào nhận theo nhiều cách khác nhau như, các phương pháp chính bao gồm: 1. Vi tiêm (microinjection), là một phương pháp sử dụng các thiết bị vi thao tác cực nhạy với vi kim được thực hiện dưới kính hiển vi để tiêm một đoạn ADN trong dịch tiêm vào phôi non của động vật. 2. Chuyển gen bằng sử dụng tế bào gốc(stem cell). Các tế bào phôi ở giai đoạn 16-32 tế bào là các tế bào đa năng (totipotent) nghĩa là có thể phân hóa thành bất kỳ loại mô nào. Người ta đã tiến hành nuôi cấy và biến nạp gen vào những tế bào này bằng cách nhiễm với vector virus. Sau khi chọn ra những tế bào đã được biến nạp gen lạ người ta đưa nó vào phôi khác ở giai đoạn phôi nang để tạo ra động vật chuyển gen thể khảm. Tỉ lệ các phôi sống sót sau thao tác là khá cao (80%), trong số đó 90% biểu hiện tính trạng mới. Tiếp theo, người ta lai tạo qua các đời để thu được động vật đồng hợp tử về các tính trạng mà ta chuyển vào. 3. Chuyển gen bằng súng bắn gen (gene gun), là biện pháp chuyển gen xuất hiện cuối những năm 1980. Biện pháp này sử dụng các hạt bụi volfram hoặc bụi vàng trộn lẫn ADN (tổ hợp gen cần chuyển) và bắn vào khối mô, tổ chức cần nhận nhờ áp lực khí helium (3500 psi). Đây là biện pháp chuyển gen có nhiều ưu điểm và hiệu quả, ở Việt nam đã có một số cơ quan nghiên cứu áp dụng kỹ thuật này như Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Công nghệ sinh học nhưng kỹ thuật này chỉ chủ yếu tiến hành đối với mô thực vật 4. Phương pháp xung điện (electroporation). Phương pháp này tạo cho các màng sinh học dễ thấm và dễ dung hợp nhờ sự kích thích của điện trường, Một yếu tố khác đó là, xung điện tạo ra những lỗ thủng nhỏ trên bề mặt của màng tế bào, nhờ vậy rất nhiều loại plasmid có thể chuyển qua được. Phương pháp này có hiệu quả cao, phù hợp cho việc biến nạp với số lượng lớn tế bào. Tuy nhiên tỷ lệ tế bào chết cũng khá nhieù và một một loại tế bào cũng cần đòi hỏi biện pháp tiền xử lý thích hợp. 5. Qua trung gian virus(virus mediated), là biện pháp chuyển gen khá đặc hiệu để chuyển gen vào đối tượng nhận. Nguyên lý của phương pháp này khá đơn giản. Khi xâm nhập vào tế bào vật chủ, virus thường chuyển một đoạn gen cỉa nó vào tế bào chủ và bắt tế bào chủ phải tổng hợp nguyên vật liệu cho nó. Phương pháp này mở ra một triển vọng cũng như là một thách thức đối với khoa học để điều khiển và lợi dụng các đặc điểm có lợi để sửa chữa khuyết tật di truyền trong liệu pháp gen. Chuyển gen sử dụng trung 7 gian virus (retrovirus- là loại virus không gây bệnh) có lợi thế là không làm thay đổi hoạt động của gen cũ của cơ thể nhưng gây nên mối nghi ngại việc tạo ra virus mới, lan truyền các thành phần của virus để tạo ra một loại virus mạnh hơn, nguy hiểm hơn. 6. Chuyển qua trung gian tinh trùng (sperm mediated), là một phương pháp chuyển gen sử dụng tinh trùng ủ với liposome có chứa ADN plasmide và dùng thụ tinh nhân tạo. Phương pháp này được thực hiện khá thành công ở thỏ. Phương pháp này cũng đang được nghiên cứu và áp dụng đối với chuyển gen ở lợn, nhằm tạo ra nguồn cơ quan, tổ chức phục vụ cho cấy ghép. 3.5 Phân tích hiệu quả của việc chuyển gen. Để khẳng định động vật có được chuyển gen lạ vào hay không người ta phải kiểm tra xem gen lạ có xâm nhập vào được bộ máy di truyền của động vật và có biểu hiện được hay không. Đây là công việc đòi hỏi nhiều thời gian và công sức, các phương pháp xác định bao gồm: 3.5.1 Phương pháp nhân gen Phương pháp để sàng lọc sơ bộ trước tiên là phản ứng nhân gen (PCR ) sử dụng cặp mồi đặc hiệu để nhân đoạn gen được chuyển. Phương pháp PCR cho phép nhân rất nhanh (hàng triệu lần trong một hai giờ) và chính xác từng đoạn ADN riêng biệt. Đây thật sự là phương pháp khá hiện đại, kinh tế và thuận tiện cho việc xác định sự có mặt của một gen nào đó trong tế bào với độ chính xác tương dối cao. Sự có mặt của băng ADN với kích thước mong muốn khi điện di sản phẩm PCR chứng tỏ sự có mặt của gen ngoại lai trong hệ gen vật chủ. Tuy nhiên, đây là một phương pháp có độ nhạy cao, do đó kết quả có thể bị nhiễu vì PCR nhân các đoạn gen không phân biệt đó là ADN ngoài nhiễm sắc thể hay không hoặc có thể bị lây nhiễm ADN trong quá trình thao tác. Do tính phức tạp của hệ gen vật chủ, cặp mồi cũng có thể bắt cặp với những đoạn không đặc hiệu trong hệ gen vật chủ tạo nên kết quả dương tính không chính xác. Để nâng cao tính chính xác của việc xác định sự hội nhập của gen ngoại lai, người ta còn sử dụng phương pháp Southern blot. Đây là một phương pháp khá tốn kém nhưng là một phương pháp rất hữu hiệu để xác định sự có mặt của gen ngoại lai và có thể phát hiện số lượng bản sao của gen hội nhập. Trong phần lớn các phòng thí nghiệm, người ta sử dụng PCR để sàng lọc sơ bộ hàng trăm thậm chí hàng nghìn cá thể được chuyển gen sau đó sử dụng các phương pháp khác để xác nhận lại kết quả PCR mà cho dương tính. 3.5.2 Phương pháp Southern blot. Đây là phương pháp sử dụng để định vi những trình tự đặc biệt trên ADN hệ gen. ADN mẫu được cắt bằng các loại enzyme giới hạn sau đó được điện di trên gel (agarose hoặc polyacrylamide), tiếp theo mẫu được làm biến tính và 8 chuyển lên màng lai nitrocellulose, ở đó, ADN dò có đánh dấu phóng xạ (hoặc không phóng xạ) được sử dụng để lai ghép. Tiếp theo, kết quả được phân tích và đánh giá. 3.5.3 Phương pháp Dot blot và slot blot. Hai phương pháp này được áp dụng để định lượng tương đối một loại ADN đặc trưng nào đó cũng bằng phương pháp lai phân tử và đánh dấu phóng xạ hoặc không phóng xạ.Tuy gen chuyển có thể hội nhập vào hệ gen vật chủ nhưng có thể biểu hiện hoặc không. Các phương pháp trên cho phép kiểm tra sự có mặt của gen chuyển ở trong cơ thể vật chuyển gen, nhưng sự biểu hiện của gen là bước cuối cùng và quan trọng nhất để đánh giá động vật chuyển gen. Có hai cách đánh giá sự biểu hiện của gen ngoại lai trong cơ thể vật chủ là phát hiện sự có mặt của mARN hoặc sự có mặt của protein do gen đó qui định được tổng hợp. 3.5.4 Các phương pháp phát hiện mRNA. Để xác định gen chuyển có được hoạt động không, người ta có thể xác nhận sự biểu hiện của gen thông qua sự có mặt của mARN bằng Northem blot, ARN dot blot (kỹ thuật lai phân tử mà đối tượng là mARN), RT-PCR (PCR ngược) . . . Trong các phương pháp trên thì RT-PCR là phương pháp nhạy và nhanh hơn cả. Chỉ cần một lượng ARN khuôn rất nhỏ để tổng hợp nên sợi cDNA đầu tiên bằng enzyme phiên mã ngược. Sợi cDNA sau đó được khuếch đại lên nhờ PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen ngoại lai đó. 3.5.5 Các phương pháp phát hiện protein Một cách khác để theo dõi thế hệ sau của động vật chuyển gen có gen lạ xuất hiện không, tức là có tổng hợp ra protein mới hay không, trong trường hợp có sẵn kháng thể kháng protein, kỹ thuật lai thấm protein (Westem blotting) có thể được sử dụng để phát hiện sự biểu hiện của gen đó. Nội dung của phương pháp này có thể tóm tắt như sau: Điện di protein tổng số trên gel SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis) để tách các protein theo trọng lượng phân tử khác nhau. Chuyển protein sang màng lai (nitrocellulose). Lai với kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody) có đánh dấu phóng xạ. Phản ứng dương tính nói lên protein của gen lạ đã được tổng hợp. Người ta có thể sử dụng kỹ thuật miễn dịch enzyme (ELISA) hoặc kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA) để phát hiện protein lạ trong động vật. 3.6 Tạo dòng động vật chuyển gen Động vật chuyển gen có thể sử dụng làm nguồn nguyên liệu ban đầu để tạo dòng động vật chuyển gen. Con vật mới được tạo ra gọi là Fo (foundation animal) khi có những biểu hiện gen được chuyển. Lai ghép để nhân lên dòng chuyển gen có gen chuyển ở một vị trí (locus) nào đó) và là đồng hợp tử. Thông thường, khi chuyển gen thì kết quả ban đầu sẽ là gen được chuyển vào 9 nhiều vị trí trong hệ gen và ở trạng thái dị hợp tử và cũng không thể điều khiển được số lượng vị trí kết hợp. Các vị trí kết hợp khác nhau có những biểu hiện khác nhau, nhiều nghiên cứu cho thấy rằng, có sự khác biệt đáng kể giữa các con của thế hệ sau của động vật chuyển gen. Và hy vọng rằng, sự di truyền các gen đó tuân theo các định luật Menden. 4 Chuyển gen bằng kỹ thuật vi tiêm. Việc chuyển gen bằng vi tiêm vào phôi non của động vật được tiến hành nhờ sự trợ giúp của các máy móc và thiết bị vô cùng chính xác và chuyên dụng. Trong số các biện pháp chuyển gen, cho đến nay, vi tiêm là biện pháp hiệu quả nhất trong việc chuyển gen vào tế bào động vật đặc biệt là phôi của động vật có vú. Trường hợp vi tiêm và phôi non để tạo ra động vật chuyển gen thành công đầu tiên là của Gordon trên chuột. Tuy nhiên, gen đó đã không biểu hiện mặc dù tổ hợp gen được thiết kế trên cấu trúc tái tổ hợp của virus. Trường hợp quan sát thấy thay đổi về kiểu hình đầu tiên ở chuột chuyển gen hocmoon sinh trưởng được mô tả năm 1982 nhờ công trình của Palmiter và cộng sự và đến nay, hàng trăm bài báo liên quan đến việc chuyển gen bằng kỹ thuật vi tiêm được xuất bản hàng năm. Kỹ thuật vi tiêm lượng ADN thuần khiết vào phôi non của động vật tạo ra việc kết hợp đoạn gen đó vào trong bộ nhiễm sắc thể của trứng mới thụ tinh. Nếu nguyên liệu di truyền đó được dung hợp vào nhiễm sắc thể thì con non sinh ra sẽ có bản copy thông tin di truyền ở tất cả các tế bào. ADN ngoại lai cần phải được kết hợp vào bộ gen của tế bào chủ trước khi được phân bào lần đầu tiên, nếu không, ta sẽ thu được con vật chuyển gen thể khảm. Chính vì vậy, gen cần phải được chuyển vào ở giai đoạn sớm nhất có thể được ví dụ như giai đoạn nhân non, lý tưởng nhất là một vài giờ sau khi thụ tinh, khi đó nhân của tinh trùng và nhân của trứng có thể quan sát được dưới kính hiển vi. Gen chuyển có thể được tiêm vào bất cứ nhân nào, tuy nhiên, nhiễm sắc thể X và Y cũng có thể tiếp nhận gen chuyển và có thể cho kiểu hình khác nhau, như vậy chúng ta có thể lựa chọn tiền nhân thích hợp. Bình thường nhân đực to hơn và gần phía ngoài hơn là nhân cái. (hình ) 4.1 Điều kiện cơ bản để thực hiện vi tiêm. Brinster và các cộng sự (1985) đã thông báo về những thay đổi trong phương pháp luận đối với chuyển gen thông qua vi tiêm vào phôi chuột và kết quả cuối cùng chỉ ra rằng cần có những điều kiện cơ bản để tăng tần số hoà nhập của ADN ngoại lai vào tế bào thể nhận. Có một vài nhân tố quan trọng nhất, đó là: · Nồng độ ADN được tiêm: Nồng độ ADN được tiêm có thể là một nhân tố hạn chế đối với hiệu quả hoà nhập. Nồng độ tối ưu là 1-2 ng/ml, tức là khoảng 100-1000 bản sao của đoạn ADN. · Tạo đầu dính (non-blunt end): Một phân tử ADN mạch thẳng sẽ được tiêm vào hiệu quả hơn nếu được cắt bởi enzym endonuclease tạo ra hai đầu dính. · Vị trí tiêm ADN vào trong tế bào: Tiêm ADN ngoại lai vào nhân thường cho hiệu quả cao hơn vào tế bào chất. · Kiểu tế bào được tiêm: Tiêm ADN lạ vào nhân trứng hoặc nhân tinh trùng cũng làm thay đổi kiểu gen và kiểu hình của hợp tử do trứng hoặc tinh trùng này 10 [...]... rung, kính hiển vi soi nổi, dụng cụ phẫu thuật và vi phẫu thuật, 4.4 Các gen dùng để chuyển vào động vật Cho đến nay, người ta đã chuyển khá nhiều gen lạ có nguồn gốc từ người, động vật, thực vật và vi sinh vật vào các loại động vật như chuột, thỏ, cá và các loại vật nuôi như bò, cừ, dê, lợn , gà, chim thậm chí cả vào muỗi Động vật Gen và chức năng của chúng nhận Cá -Gen sinh trưởng và yếu tố sinh trưởng... những vấn đề về pháp luật và đạo đức Trong khi tạo động vật chuyển gen đã và sẽ mang lại rất nhiều lợi nhuận nhưng cũng có những quan điểm trái ngược, lo sợ rằng tạo động vật chuyển gen đe doạ phá vỡ sự cân bằng hệ sinh thái hoặc động vật chuyển gen có khả năng sinh sản thấp, nếu lai với động vật tự nhiên có thể làm giảm khả năng sinh sản, giảm số lượng, đe doạ sự tồn tại của loài Một số trường hợp động. .. cứu chuyển gen thực vật và động vật đã được tiến hành ở nhiều cơ sở nghiên cứu như Viện Di truyền nông nghiệp, Viện Công nghệ sinh học,Trung tâm công nghệ sinh học -Đại học quốc gia Hà nội….Ở động vật, những nghiên cứu chuyển gen mới được bắt đầu và chủ yếu thực hiện ở các hạch với tổ hợp gen hoc môn sinh trưởng bằng vi tiêm Chuyển gen trên cá có nhiều thuận lợi hơn rất nhiều so với chuyển gen vào động. .. khoa học, công nghệ thì việc chuyển gen vào động vật với hiệu quả cao; tổ hợp gen cần chuyển được chèn chính xác vào vị trí cần thiết và khống chế được những tác động tiêu cực của việc chuyển gen ở cơ thể tiếp nhận, thì việc chấp nhận và khả năng ứng dụng rộng rãi kỹ thuật chuyển gen để 17 phục vụ các nhu cầu của con người là vô cùng lớn Việc nghiên cứu và chuyển gen vào động vật ở Việt nam là yêu cầu... động vật chuyển gen Động vật Dược Sử dụng 13 chuyển gen phẩm/protein Máu và hệ tuần hoàn Lợn Hemoglobin ở Năm 1991, 3 lợn chuyển gen được tạo ra từ phôi 1 người ngày tuổi tại TTCNSH NewJersey Gen được chuyển la tạo hemoglobin của người, có khả năng vận chyển oxy như bình thường Cừu, Yếu tố chống Điều trị bệnh ưa chảy máu và giảm nguy cơ phản ứng Lợn, Bò đông máu VIII, truyền máu IX Cừu, Bò Fibrinogen... phôi từ ống dẫn trứng (3) Gen được đưa vào trứng được thụ tinh bằng kỹ thuật vi tiêm (4) Phôi chuyển gen được đưa vào con vật nhận mà có thể cho ra đời con non có gen đã chuyển (5) Kiểm tra con non đối với gen mới chuyển, lai tạo để tạo con non có tính ổn định di truyền về tính trạng mới 4.3 Những thiết bị yêu cầu cho thao tác vi tiêm 11 Gía thết bị cần thiết cho thao tác chuyển gen bằng vi tiêm khoảng... sự hoà nhập của ADN lạ vào hệ gen của động vật một cách có hiệu quả cao · Nguồn vật liệu di truyền được tạo phôi: Hiệu quả gắn kết ADN lạ vào genome của phôi lai giữa các nòi cho hiệu quả cao hơn vào genome của phôi đối với các dòng cận huyết 4.2 Quy trình tạo động vật chuyển gen (1) Gen có chức năng nào đó được lựa chọn và phân lập trong phòng thí nghiệm (2) Một con vật cho được gây siêu bài noãn... Do chuyển gen làm thay đổi cấu trúc vật chất di truyền nên có thể tạo ra bước nhảy vọt vế khả năng của vật nuôi mà trong tự nhiên không có được Những thành tựu và ứng dụng tạo động vật chuyển gen nhờ vi tiêm như sau: 12 5.1 Tăng cường khả năng sinh trưởng và thay đổi đặc tính cơ thể: Khả năng sinh trưởng và chất lượng sản phẩm động vật cao do sự kiểm soát bởi các gen tăng cường sinh trưởng Việc chuyển. .. hơn rất nhiều so với chuyển gen vào động vật có vú do số lượng trứng nhiều, kích thước trứng lớn, không cần cấy vào cơ thể mẹ sau khi vi tiêm, không đòi hỏi điều kiện chăm sóc quá nghiêm ngặt Ở động vật có vú, chưa có công trình nào công bố thực hiện việc chuyển gen vào động vật có vú ở Việt nam Tuy nhiên, các kỹ thuật liên quan đến việc tạo động vật chuyển gen thì đã được tiếp cận và thực hiện ở một... Mặc dù cá cứng dụng động vật chuyển gen trong nông nghiệp hiện tại còn chưa được khai thác, song trong tương lai nó cũng hứa hẹn sẽ mang lại lợi nhuận không nhỏ Mặc dầu những thành tựu của kỹ thuật chuyển gen rất to lớn và dễ nhận thấy nhưng những nguy hại từ nó cũng không nhỏ và thật khó nắm bắt và đề phòng Cũng nhìn lại dưới góc độ tiến hoá,việc chuyển gen nhân tạo làm đảo lộn dòng gen trong tự nhiên, . của động vật chuyển gen. Và hy vọng rằng, sự di truyền các gen đó tuân theo các định luật Menden. 4 Chuyển gen bằng kỹ thuật vi tiêm. Việc chuyển gen bằng vi tiêm vào phôi non của động vật được. thuật và vi phẫu thuật, 4.4 Các gen dùng để chuyển vào động vật. Cho đến nay, người ta đã chuyển khá nhiều gen lạ có nguồn gốc từ người, động vật, thực vật và vi sinh vật vào các loại động vật. lợi ích to lớn nhất của kỹ thuật di truyền. Động vật chuyển gen là những con vật mang những gen lạ (khác loài hoặc những gen tái tổ hợp) mà những gen này được đưa vào hệ gen của nó có chủ ý dưới