Đề cương ôn tập kĩ thuật di truyền nguyên lí và ứng dụng..

Hồ Thị Thương Trần Thị Huyền Trang Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh ĐỀ CƯƠNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN Câu 1: Trình bày định nghĩa genome? Genome khái niệm dùng để toàn gen có giao tử đơn bội, có nghĩa giao tử loài, nhiễm sắc thể tương đương có mặt Câu 2: Gen gì? Trình bày cấu trúc gen điển hình Eukaryote • • - - - Gen đơn vị di truyền, gen đoạn chuỗi DNA mang thông tin di truyền cho phân tử RNA chuỗi polypeptide định cấu trúc gen điển hình sinh vật nhân chuẩn: + thành phần gen sinh vật nhân chuẩn gồm: + vùng điều khiển ( promoter): điều khiển hoạt đôngj gen promoter trình tự nhận biết vị trí tiếp cận với gen enzyme RNA polymerase nhân tố phiên mã, promoter có chức kiểm soát hoạt đọng gen Promoter sinh vật eukaryote chia làm nhóm chủ yếu: Promoter có vai trò định: sợi DNA làm khuôn Khi tổng hợp mRNA Vị trí bắt đầu phiên mã mRNA Khi dừng trình phiên mã.1 + Exon: vùng DNA phiên mã thành mRNA, exon có chứa trình tự mã hóa protein gọi khung đọc mở (ORF) Mỗi nu khung đọc mở tương ứng với codon mã hóa cho aa Khung đọc mở đọc từ đầu 5’ đến 3’dọc theo phân tử mRNA Khung đọc mở bắt đầu mã khởi động (AUG) kết thúc mã kết thúc ( UAA/UAG/UGA) Exon gồm phần - vùng mã hóa phiên mã thành mRNA, mRNA dịch mã tạo nên sản phẩm protein Vùng không dịch mã 5’ Vùng không dịch mã 3’ + Intron: intron hay gọi trình tự xen kẽ không mang mã di truyền chúng phiên mã không dịch mã Các intron bị cắt bỏ trình biến đổi tiền ,RNA thành mRNA hoàn chỉnh + vùng UTR: vùng không dịch mã 5’ có liên quan đến vận chuyển mRNA, khởi động dịch mã Vùng không dịch mã thành protein Vùng 3’ đầu cuối gồm phần: 3’ UTR không dịch mã Tuy nhiên có chức ổn định mRNA Đồng thời vị trí gắn đuôi polyA mRNA Trình tự kết thúc nằm phía sau chuỗi polyA môtj trình tự lặp ngắn chưa rõ chức Hồ Thị Thương Trần Thị Huyền Trang Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh + enhancer silencer nằm vị trí vùng promoter nằm vùng mang mã di truyền gen nằm đoạn intergenic phía trước phía sau gen Hoạt động trình tự enhancer silencer làm thay đổi cường độ hoạt động gen, làm ngừng hoạt động phiên mã gen - Câu3: Trình bày cấu trúc gen nhân sinh vật eukaryote Độ lớn tùy thuộc vào sinh vật biến động từ 10Mb đến 100000Mb thường tương quan thuận với tính phức tạp tổ chức thể Genome sinh vật bậc cao thường lớn genome sinh vật bậc thấp số lượng gen; lượng DNA lặp lại Genome nhân cấu trúc nên từ cặp NST tương đồng, NST thường chứa mội phân tử DNA, trừ NST khổng lồ ruồi dấmvaf mội số NST vi khuẩn, genome nhân loài khác chứa hàm lượng DNA khác nhau, NST nhân có số lượng, kích thước hình dạng xác định khác đặc trưng cho loài Các loại DNA genome nhân gồm: Loại DNA lặp lại mức độ cao: chiếm khoảng 10% DNA tế bào trình tự ngắn 10bp có từ 105 đến 107 cho genome Loại DNA có trình tự lặp lại thấp trung bình: chiếm khoảng 20% đoạn lặp lại có kích thước lớn hơn100bp thường xen kẽ với trình tự lặp lại mội lần dọc theo NST Loại DNA chúa trình tự nhất: chiếm khoảng 70% loại có lặp lại đôi lần Câu 4: Trình bày cấu trúc genome ty thể eukaryote Độ lớn biến động mà không tương ứng với tính phức tạp sinh vật genome ty thể động vật thường nhỏ với tổ chức di truyền gói gọn, gen xếp sát với khoảng trống genome ty thể động vật thường lớn genome ty thể động vật có vú nấm men Kích thước genome ty thể khác tùy thuộc loài VD: genome ty thể brassica campestris có độ lớn 218kb cucumis melo 2400 kb, nhỏ nhiều so với genome nhân Tổ chức di truyền genome gói gọn, nhiều gen có chứa intron Số lượng từ đến 10 genome/ty thể DNA ty thể tồn chủ yếu dạng mạch vòng kép, có xuất mạch thẳng như: nấm men, Pẩmecium Thông tin di truyền genome ty thể: genome ty thể chứa gen mã hóa cho rRNA ty thể số enzyme tham vào chuỗi hô hấp Ngoài ty thể chứa gen mã hóa tRNA, protein ribosome số protein khác liên quan đến trình phiên mã Dịch mã vận chuyển protein khác vào ty thể từ tế bào chất Câu 5: Trình bày cấu trúc genome lạp thể eukaryote? Lục lạp chứa DNA đạng phân tử kép có cấu trúc vòng Mỗi lục lạp ty thể chứa nhiều DNA, nhiên chúng chứa gen giống Hồ Thị Thương Trần Thị Huyền Trang Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh Thong tin di truyền chứa genome lục lạp: genome lục lạp có khoảng 200 gen gen mã hóa cho rRNA tRNA đồng thời mã hóa cho protein ribosome protein cần cho hoạt động quang hợp Câu 6: Cấu trúc hệ gen virus? Virus thường có lượng thông tin di truyền it nhiều so với sinh vật eukaryote Genome virus DNA RNA DNA virus chuỗi đơn( thực khuẩn thể) hay chuỗi kép DNA virus có cấu trúc đặc biệt dạng vòng: hai chuỗi DNA nối cộng hóa trị với tạo thành hình vong khép kín liên tục, đầu 3’ 5’ DNA virus gồm hàng ngàn đến hàng chục ngàn nu - - Câu 7: Trình bày cấu trúc genome vi khuẩn? DNA vi khuẩn nằm NST sơ khai Phần lớn khuẩn có NST/tế bào DNA vi khuẩn dạng vòng, chuỗi kép Trên DNA có chứa gen mã hóa cho protein đặc thù Ngoài NST vi khuẩn chứa dạng DNA khác gợi plasmid có kích thước bé hơn, dạng vòng Có khả tự nhân bản, plasmid thường có nhũng gen có tính đặc thù cao + dạng plasmid F- plasmidmang thong tin di truyền giới tính vi khuẩn, chuyển từ tb VK nà sang tb VK khác qua tiếp hợp R plasmid: plamid mang đặc tính chống chịu nhiều kháng sinh Chúng bao gồm thành phần: yếu tố tính kháng: cần để chuyển plasmid VK yếu tố sác định r: gen quy định tính kháng kháng sinh Degradative plasmid: plasmid phân rã mang gen đặc hiệu có khả sử dụng chất chao đổi bất thường Cryp plasmid plasmid tinh thể không mang gen mã hóa chức Câu 8: Khái niệm enzyme giới hạn? Cách đặt tên? Các kiểu cắt, chế hoạt động? Ứng dụng enzyme giới hạn công nghệ gen? + Enzym cắt giới hạn enzyme có khả nhận biết đoạn trình tự DNA định cắt AND điểm hay điểm kế cận VD: Eco RI 5’ GAATTC 3’ 3’ C TTAAG 5’ + Cách đặt tên: tên enzyme cắt giới hạn ghép chữ viết hoa tên chi vi khuẩn mà enzyme phát hai chữ đầu loài không viết hoa, sau chữ hoa tên chủng vi khuẩn cuối chữ sô la mã thứ tự enzyme giới hạn phát VD: HpaI HpaII enzyme giới hạn thứ thứ hai tách từ Haemophilus parainflenzae + kiểu cắt: gồm cắt đầu cắt đầu sole Hồ Thị Thương Trần Thị Huyền Trang Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh - - - - Cắt đầu bằng: enzyme cắt giới hạn cắt hai mạch AND vị trí, đoạn cắt theo kiểu khả tự kết hợp với Để nối lại đòi hỏi enzyme gắn ligase adaptor đặc dụng Cắt tạo đầu sole: enzyme giớ hạn cắt hai mạch AND hai vị trí lệch Kết tạo nên đoạn AND có đầu sole có trình tự nu hoàn toàn bổ sung cho nên tự nối với nhau, nên đầu so le gọi đầu dính + ứng dụng: người ta thường sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt tạo đầu sole 5’ 3’ công nghệ di truyền có khả tự nối lại với đoạn DNA khác có đầu tương tự, sử dụng enzyme cắt giới hạn cần có điều kiện nhiệt độ, độ ph, dung môi thích hợp VD: Eco RI 5’ GAATTC 3’ => 5’ G + AATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ 3’ CTTAA G 5’ Câu 9: Vector nhân dòng gì? Nêu tiêu chuẩn vector nhân dòng? + vecter nhân dòng phân tử dung để mang đoạn DNA/gen phục vụ cho việc nhân, tách dòng biến nạp gen + tiêu chuẩn vecter nhân dòng: Có điểm khởi đầu chép ori để tự chép tồn độc lập tế bào Có đoạn trình tự nhật biết cho enzyme cắt giới hạn Có đoạn trình tự khởi điểm Có dấu chuẩn chọn lọc cho phép dễ dàng phát chúng tế bào chủ nhận thông thường dấu chuẩn chọn lọc gen kháng chất kháng sinh, gen tổng hợp chất màu Câu 10; Trình bày cấu trúc di truyền nguyên tắc hoạt động vector plasmid sử dụng công nghê gen? + plasmid phân tử nhỏ có cấu trúc mạch vòng, nằm NST tế bào vi khuẩn có khả tự nhân + cấu trúc di truyền plamid gồm phần chính: Vị trí nhận biết enzyme cắt giới hạn Có gen thị chọn lọc Có gốc tái ori + số plasmid thường dung công nghệ di truyền:  Plasmid pBR 322 Hồ Thị Thương Trần Thị Huyền Trang Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh PBR 322 có mang gen kháng kháng sinh Ampiciline tetracycline, plasmid có điểm cắt cho enzyme giới hạn bam HI, Hin III, Sal I,nằm vùng kháng tetracycline, điểm cắt cho enzyme Pst I vùng kháng Ampicilin điểm cắt cho Eco RI nămg vùng mã hóa DNA Plasmid có gốc tái hoạt động E.coli Khi nuôi cấy môi trường chọn lọc ampicillin tetracycline vi khuẩn có chứa plasmid sống tế bào vi khuẩn ko chứa plasmid chết  Plasmid PUC 19 Đây nhóm plasmid phát triển từ nhóm plasmid pBR 322 Phần chứa gen khang tetracycline cắt bỏ phần gen kháng Ampicillin gốc tái pBR322 giữ lại, vị trí nhân dòng vị trí cắt enzyme cắt giới hạn phân bố tập trung vào vị trí gọi vị trí đa nhân dòng (MCS) Các plasmid có gen αlacZ, gen mã hóa cho hình thành enzyme β-glactosidase, enzyme xúc tác cho phản ứng biến đổi màu chất Xgal hợp chất không màu thành hợp chất X+glactose Chất X màu xanh chàm, nên bị chèn đoạn DNA ngoại lai vào vị trí nhân dòng làm ko sản sinh βgalactosidase nên chất Xgal môi trường nuôi cấy ko bị biến màu Và vi khuẩn chứa plasmid cho khuẩn lạc đơn màu trắng, vi khuẩn chứa plasmid nguyên vẹn cho khuẩn lạc đơn màu xanh chàm Hồ Thị Thương Trần Thị Huyền Trang Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh Câu 11: Trình bày cấu trúc di truyền nguyên tắc hoạt động vector bacteriophage sử dụng công nghệ gene? Cấu trúc di truyền vector bacteriophage: Phage virus mang AND sợi đôi có kích thước khoảng 50bp, DNA có dạng phân tử mạch thẳng có đầu bổ sung sợi đơn dài 12 nu( dùng làm sợi cos) Sau xâm nhập vào vi khuẩn vào vi khuẩn vật chủ, DNA tạo vòng cách ghép đầu dính cos nhờ enzyme ligase vật chủ Các giai đoạn tiếp dẫn đến việc làm tan tế bào vật chủ gây tượng tiềm tan( giai đoạn λ AND hop vào chromosome tế bào vật chủ.) Các phage có khả thực tải nạp mang gen từ tế bào vi khuẩn cho sang tế bào vi khuẩn nhận Vector phage λ sử dụng rộng rãi để xây dựng thư viện genome mang đoạn AND ngoại lai lớn từ 15-23kp sp với plasmid, dễ bảo quản, dễ tách để phân tích Ưu điểm bật chúng có hệ thống tự động xâm nhập nhân đôi tế bào vi khuẩn hiệu so với việc biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn Tuy nhiên , thao tác ban đầu có phức tạp Đặc điểm bacteriophage λ: Ở AND phage λ có vùng đệm hay vùng trung tâm có chiều dài 1/3 chiều dài phage , vùng không quan trọng, cắt vùng không ảnh hưởng đến khả sinh sản phage tế bào vật chủ khả làm tan tế bào chủ Vì cắt bỏ đoạn để chèn đoạn AND ngoại lai vào Do AND phage có mạch thẳng nên bị cắt bỏ đoạn bị tách làm nhánh: Trái Phải Đoạn gen ngoại lai gắn vào cho đoạn AND tái tổ hop không lớn 105% nhỏ 78% gen bình thường phage Khả mang đoạn AND ngoại lai dài ưu phage so với plasmid Điều có nghĩa Hồ Thị Thương Trần Thị Huyền Trang Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh lấy đoạn đệm ( chiếm 60% chiều dài) đoạn lại ngắn để lắp ráp vào đầu, lắp ráp có AND ngoại lai gắn vào Nhờ dễ xác định AND ngoại lai gắn vào phage hay chưa, loại ỏ phage mà chưa có đoạn AND ngoại lai gắn vào Trên phage người ta chọn vị trí cắt cho enzyme cắt hạn chế xây dựng phương pháp đóng gói để đưa đoạn AND ngoại lai vào phage Tạo dòng bacteriophage λ: Bacteriophage λ có genome phức tạp dùng vector AND chứa số vị trí cần thiết cho enzyme cắt giới hạn cần thiết để tạo dòng Các bước tạo dòng tóm tắt: -Tinh AND vector ly tâm gradien tốc độ điện di gel sau cắt RE -Các nhánh trái phải sau liên kết với AND ngoại lai có kích thước khoảng 20kbp có đầu kết thúc tương ứng với đầu nhánh -Kết AND tái tổ hop đóng gói phageλ -Các phage tái tổ hop mang đoạn AND ngoại lai mong muốn xác định phương pháp lai acidnucleic -Tinh chọn tế bào vật chủ sinh sản để trì phân tích đoạn AND ngoại lai Chọn lọc vector λ thích hop: Có yếu tố ảnh hưởng đến chọn lọc enzyme giới hạn sử dụng kích thước AND ngoại lai Chỉ khoảng 60% genome nhánh trái nhánh phải cần thiết cho sinh tan phage Khả sống sót phage giảm kích thước AND tái tổ hợp dài 105%genome phage ngắn 78%genome phage Như vậy, điều quan trọng chọn vector AND ngoại lai để kích thước phage tái tổ hop nằm giới hạn cho phép Hồ Thị Thương Trần Thị Huyền Trang Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh Nó trở thành đoạn dây thẳng, hình thành đoạn AND chồng lớp lên với độ dài khoảng 50kb Một số vector thiết kế thuận lợi cho sinh trưởng thuận lợi chúng E.coli mang prophage , phenotype Spi+ Các chủng λ thiếu gen cần thiết tái tổ hợp gọi Hồ Thị Thương Trần Thị Huyền Trang Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh Spi- sinh trưởng tốt thể tiềm tan P2 chừng chúng mang chuỗi chi( chi chất cho tái tổ hop xúc tác recA.) Tạo dòng vector λ L47.1 , λ1059, BF101 tiến hành cách loại bỏ đoạn đệm rec gram Kết thu phage tái tổ hop Spi_ , chúng nhận biết chọn lọc khả sinh trưởng chúng thể tiềm tan P2 recA+ E.coli Hầu hết vector thay gram đoạn đệm bị loại bỏ Các thể tái tổ hop tạo thành vector phải sinh sản vi khuẩn rec A+ Phage1-sep6-lac5 mang red gram nhánh phải thể tái tổ hop tạo thành phenotype Spi+ nhân lên vi khuẩn đột biến rec A- Hồ Thị Thương Trần Thị Huyền Trang Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh Câu 12: Trình bày cấu trúc di truyền nguyên tắc hoạt động vector YAC sử dụng công nghệ gene? Một nghiên cứu cho thấy NST muốn nhân đôi phân ly tốt cần có: - telomere: - khởi điểm tái (ARS 1), -một tâm động (CEN 4), Dựa vào người ta cấu tạo NST nhân tạo có đủ trình tự nói với cấu tạo gồm cánh tay, cánh tay, người ta cài đoạn AND cần tách dòng với kích thươc khoảng từ 150-1000kp Trên cánh tay , gồm gene đánh dấu di truyền để chọn lọc tế bào nấm men có chứa YAC chuỗi tận có chức telomer đoạn cuối NST Một cánh tay mang mảnh AND hoạt động tâm động gốc tái Ori Việc cài AND lạ vào gene mã hóa ức chế tRNA chuyển tyrsine làm biến đổi màu sắc khuẩn lạc từ màu đỏ sang trắng Đây dấu tái tổ hop YAC tế bào nấm men Các NST đưa vào tế bào chủ, nhân lên NST khác tế bào nấm men ta có gene mong muốn Vector tương đối ngắn dễ thao tác Sở dĩ khởi điểm tái tâm động ngắn Khởi điểm tái nấm men Saccharomyces cerrevisae tập trung vùng genome ngắn Saccharomyces pombe khởi điểm tái dài đến vài nghìn base Vector YAC mang đoạn DNA dài 150- 1000kb chúng thiết kế nấm men tái tổ hợp tương đồng Hạn chế chủ yếu vector YAC không ổn định Hồ Thị Thương Trần Thị Huyền Trang Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh + Phải có bổ sung mồi xuôi ngược mồi xuôi bắt cặp gắn đầu 3’ mạch khuôn 5’-3’, mồi ngược bắt cặp mạch khuôn 3’-5’ + Để nâng cao hiệu gắn mồi tính đặc hiệu phản ứng, đuôi 3’ mồi G C để bắt cặp với LK H Tỷ lệ G/C trung bình khoảng từ 50-60% cho ta nhiệt độ lai thích hợp + Nhiệt độ gắn mồi có ý nghĩa quan trọng: nhiệt độ bao nhiêu, thời gian phụ thuộc vào trình tự đoạn cần nhân Công thức tính nhiệt độ gắn mồi cho mồi có kích thước khác nhau: Đối với mồi ≤ base nhiệt độ gắn mồi là: Tm = [2 (tổng số A+T) + (tổng số C+G)] oC Đối với mồi ≥ 20 – 35 base nhiệt độ gắn mồi là: Tm = 22+ 1,46 [ (tổng số G+C) + (tổng số A+T)] Đối với mồi > 35 – 70 base nhiệt độ gắn mồi là: Tm = 81,5 + 16,6 LgC + 0,41 (% tổng số G+C) – 600/ l C: Nồng độ cation hóa trị (Na+) tính theo M l: chiều dài mồi Cần xác định Tm lý thuyết thử nghiệm tìm Tm tối ưu + Nồng độ mồi: khoảng 100-500nM Nếu nồng độ mồi thấp không đủ cho phản ứng PCR Nếu nồng độ cao ức chế phản ứng gây sai lệch phản ứng + Thời gian gắn mồi: tứ 30-60s, thời gian dài gây sai lệch phản ứng, suy giảm hoạt động enzyme taq polymerase - dNTP: Nồng độ nguyên liệu thường dung 200MM Nồng độ cao lien kết với Mg2+ ảnh hưởng tới PƯ Sau 35 chu kỳ, dNTP bị suy giảm, môi trường acid làm dNTP biến đổi thành dNDP dNMP - Enzyme taq polymerase: Hồ Thị Thương Trần Thị Huyền Trang Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh + Thể tích PCR 25Ml cần 1-2 đơn vị enzyme Nồng độ enzyme nhiều hay ảnh hưởng đến chất lượng PCR + Dung dịch đệm PCR: KCl: tăng hiệu phản ứng Mồi lớn cần nồng độ muối thấp ngược lại MgCl: cần cho hoạt động taqpolymerase Tris: giúp ổn định PH - Thể tích phản ứng: từ 5-100Ml Cùng lượng DNA khuôn, thể tích PCR nhỏ cho nồng độ sản phẩm cao Chu kỳ phản ứng: 25-30 đủ, kéo dài them sản phẩm không tăng đáng kể mà dễ xảy sai sót Câu 22 Phương pháp Real time PCR Vì dùng phương pháp xác định lượng sản phẩm PCR sau thời gian phản ứng Phương pháp PCR định lượng (RT-PCR) khắc phục số hạn chế phương pháp PCR thông thường như: - Không cần chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR Có thể định lượng xác sản phẩm mà không cần điện di sản phẩm Độ đặc hiệu độ nhạy cao hơn, Thời gian phát kết phản ứng ngắn Có thể tiến hành với nhiều đoạn DNA lúc ống nghiệm nên giảm khả nhiễm mẫu Có thể dùng phương pháp xác định lượng sản phẩm PCR sau thời gian phản ứng dựa vào cường độ huỳnh quang bình phản ứng: - - Hàm lượng chất phát huỳnh quang tăng dẫn đến chu kỳ PCR tỉ lệ thuận với sản phẩm nhân Cường độ phát huỳnh quang phụ thuộc vào hàm lượng chất phát huỳnh quang, qua theo dõi trình PCR định lượng sản phẩm RT-PCR sử dụng mẫu dò phát huỳnh quang Mẫu dò oligonucleotide, đầu gắn với chất nhuộm phát huỳnh quang (R), đầu gắn với chất nhuộm có vai trò làm tắt phát huỳnh quang(Q) Khi có mặt đoạn DNA cần nhân, mẫu dò gắn vào DNA khuôn vùng mồi theo hướng 5’ Ở trạng thái này, tượng phát huỳnh quang Khi bắt đầu tiến hành trình với hoạt động enzyme taq polymerase, mồi kéo dài gặp mẫu dò mẫu dò mẫu dò bị phân giải hoạt tính 5’nuclease taq-DNA polymerase không ngăn cản trình PCR Sự phân giải mẫu dò giải phóng chất nhuộm màu có khả phát huỳnh quang (R) khỏi ảnh hưởng kìm hãm Q Sự phát huỳnh quang nhận biết Hồ Thị Thương Trần Thị Huyền Trang Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh Các phân tử chất mẫu bổ sung vào sẽ giải phóng khỏi mẫu dò chu kỳ PCR Như hàm lượng chất phát huỳnh quang tăng dần theo chu kỳ PCR tỉ lệ thuận với sản phẩm nhân Cường độ chất phát huỳnh quang phụ thuộc vào hàm lượng chất mẫu, qua hoàn toàn theo dõi trình PCR định lượng sản phẩm Câu 23 Chỉ thị RAPD Nguyên lý ứng dụng Phương pháp RAPD: (Randomly Amplified Polymorphic ò DNA) trình nhân đoạn DNA kĩ thuật PCR có sử dụng mồi thiết kế ngẫu nhiên Các mồi có kích thước khoảng 10 nu bắt cặp cách ngẫu nhiên vào DNA khuôn vị trí mà có trình tự bổ sung Quá trình nhân đoạn DNA xảy mồi bắt cặp chiều vào đầu 3’ sợi khoảng cách mồi không 1-3kb Quá trình nhân xảy đồng thời nhiều vị trí cho đoạn DNA có kích thước khác Đem điện di cho kết băng khác biệt, từ dánh giá đa hình (khác biệt) DNA mẫu nghiên cứu đồng thời cho thấy đồng dạng DNA cá thể phân tích Đây phương pháp đánh giá độ đồng dạng di truyền sở sử dụng nhiều mồi chạy nhiều lần, có phần mềm để đánh giá Nguyên tắc chung dựa theo công thức: Sij = Nij/ (Ni + Nj) Sij : Độ đồng dạng cá i, j Nij : Số băng DNA trùng lặp Ni : số băng giống i Nj : số băng giống j Nguyên lý chung giống tạo ưu lai: Sự khác biệt di truyền bố mẹ: từ 40-60% Nếu < 40% ưu lai; > 60% không hữu thụ Nhược điểm: Độ lặp lại thấp Đây thị trội, không phân biệt thể đồng hợp tử dị hợp tử Có thể kích thước băng có trình tự khác Cần phải lặp lại thí nghiệm nhiều lần thiết bị Câu 24 Chỉ thị AFLP Nguyên lý ứng dụng Hồ Thị Thương Trần Thị Huyền Trang Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh - Bản chất phương pháp: Sử dụng kỹ thuật PCR đề nhân lên đoạn DNA cắt enzyme giới hạn Khâu then chốt kỹ thuật việc thiết kế mồi đặc trưng Để thiết kế mồi đặc trưng, trước hết DNA mẫu nghiên cứu cắt enzyme giới hạn, thường dùng đồng thời enzyme giới hạn là: EcoRI có trình tự nhận biết -G,AATT C-C TTAA,GMseI có trình tự nhận biết -A’AT T-T TA’ASau xử lý với enzyme, dựa vào trình tự biết đầu đoạn cắt thiết kế đoạn gắn (adaptor) gắn chúng vào đầu cắt Trình tự adaptor phải có vùng trình tự bổ sung với đầu cắt vùng trình tự tùy ý để thiết kế mồi Mồi thiết kế dựa trình tự adaptor, từ ta nhân đoạn gen đầu đoạn cắt Thiết kế mồi trình tự mồi cũ bổ sung 1-3 nu ngẫu nhiên (bổ sung phía bên đầu adaptor) Quy trình : +Chiết tách AND +Cắt đoạn AND enzyme giới hạn ( Phức hệ enzyme giới hạn) +Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi thiết kế dựa vào trình tự adaptor gắn vào đầu dính đoạn cắt +Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi dò thiết kế sở bổ sung vào mồi nu mới( A, T, G, C) +Tương tự bước với mồi bổ sung nu, thứ 2, thứ +Chạy điện di sản phẩm hình + Băng đa hình lơn, thuận lợi - Ưu điểm: + Đơn giản + Ổn định + Dễ thiết kế + Khả ứng dụng cao Câu 25 Chỉ thị STS Nguyên lý ứng dụng - - STS đoạn DNA ngắn khoảng 200-500 bp phát kỹ thuật PCR Kỹ thuật STS cho phép xác định vị trí cần biết trình tự DNA biết trước Nguyên lý: Nhân trực tiếp đoạn locus biết (gen, cDNA) mồi PCR thiết kế từ trình tự đầu cuối locus đặc trưng Tiến hành: Xác định trình tự nu đầu đoạn sử dụng mẫu dò kỹ thật RFLP sản phẩm RAPD Sau dựa vào trình tự xác định thiết kế mồi PCR có chiều dài 18-20 nu Kết chạy PCR cho đoạn DNA nằm sản phẩm RAPD RFLP Các dòng cDNA xác định trình tự sử dụng mẫu dò RFLP để tạo lượng lớn STS Ứng dụng: Các STS thường xác định rõ rệt vị trí biết NST Điều kiện để thực thị STS: Phải biết trình tự nu đoạn cần tìm để thiết kế mồi Hồ Thị Thương Trần Thị Huyền Trang Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh Câu 26 Giới thiệu thị SSR, STR, VNTR - - - SSR (simple sequence repeat) - microsatellite: DNA vệ tinh có đơn vị lặp lại ngắn< 25bp, thường 4bp, chiều dài đoạn DNA < 150 bp Do có sai khác kích thước đoạn lặp lại nên kỹ thuật SSR thích hợp cho nghiên cứu đa hình, lập đồ phân lập gen Dùng để phân biệt cá thể người, động vật, giống trồng vật nuôi KT SRR đơn giản, không tốn kém,là thị đồng trội nên dùng để phát cá thể dị hợp tử Các bước tiến hành: Tách chiết, tinh DNA nghiên cứu Thực PCR với mồi đặc trưng cho đoạn lặp Điện di sản phẩm PCR, tính toán số liệu, so sánh sai khác Xử lý số liệu phần mềm chuyên dụng STR (short tandem repeat) - minisatellite: DNA vệ tinh có đơn vị lặp lại < 25 bp, chiều dài < 20 kb Dùng để phân biệt nhóm cá thể VNTR (variable number tandem repeat): Số lần lặp lại liền kề khác Mỗi đơn vị lặp lại lên tới hàng trăm bp Câu 27 cDNA Nguyên lý thiết lập ngân hàng cDNA - cDNA phân tử DNA tổng hợp từ khuôn mRNA qua trình chép ngược cDNA thu thập lưu trữ ngân hàng cDNA Nguyên lý thiết lập ngân hàng gen cDNA: +Để tạo cDNA trước hết cần tách mRNA Do mRNA chứa đầu 3’ chuối polyA, người ta tách riêng m RNA nhờ tổ hợp oligonucleotide chứa deoxythimine (oligodT) Người ta gắn oligodT với cellulose đặt phễu chiết Sau chiết xuất toàn RNA tế bào gồm rRNA, tRNA, mRNA cho hốn hợp chảy qua phễu có gắn cellulose-oligodT + Các mRNA bị giữ lại phễu hình thành lien kết bổ sung A-T + Dùng dung dịch muối NaCl để đẩy tRNA rRNA khỏi phễu + Dùng dung dịch đệm Tris EDTA cho chảy qua phễu giải phóng mRNA lien kết A-T bị phân giải Dùng mRNA làm khuôn với có mặt Enzyme chép ngược với nguyên liệu dNTP, trình tổng hơp DNA xảy ra, kết thu cDNA +Các cDNA tiếp tục nhân dòng tập hợp thành thư viện cDNA Để tìm cDNA cần thiết, người ta sử dụng phương pháp lai DNA PƯ protein kháng thể Câu 28 Sơ đồ tạo cDNA cải tiến: - Gắn vào chuỗi poly A trình tự cho enzyme RE( gọi chung vùng primer Adaptot_ Hồ Thị Thương Trần Thị Huyền Trang Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh - - - Bổ sung đường disacatit để làm bền enzyme reverse transcriptase cho phép enzyme làm việc nhiệt độ cao Ở nhiệt độ cao, cấu trúc mRNA bị phá hủy có sợi mRNA hoàn chỉnh tổng hợp dNTP có trộn tỷ lệ methyl dCTP góp phần làm sợi DNA khó phân giải Sau tạo sợi đầu tiên, người ta gắn biotin vào đường ribose nu đầu cuối phân tử mRNA Ở deoxynucleotit không xảy phản ứng gắn biotin Phức hợp AND: ARN xử lý với ARNase I Enzyme phân giải chuỗi ARN không công vào cặp base liên kết với AND sợi AND Kết vùng 5’ sợi đơn mRNA với cDNA không hoàn toàn vùng polyA không cặp đôi bị phân giải Sợi mARN cDNA tổng hop hoàn toàn không bị enzyme tác động Mẫu sau trộn với hạt nam châm từ - phức hop strepavidin Biotin có lực cao với strepavidin, sau xử lý với ARNase lai ARN : AND biotin hóa hay nói cách khác có cDNA toàn phần biotin hóa Sau sử dụng RNAase để bắt cặp base gắn phức RNA : DNA để giải phóng cDNA toàn phần (Sơ đồ tự vẽ.) Câu 29 Ý nghĩa phương pháp chọn lọc gen Khi thu nhập mẫu DNA nhân dòng, có ngân hàng mẫu, tập hợp tế bào có chứa loại DNA ý nghĩa mặt di truyền Trong tập hợp chứa loại DNA ý nghĩa mặt di truyền: khả chép, biểu Việc tìm gen xác định từ tổng thể vật chất di truyền thể việc khó khăn, tốn Để giải vấn đề này, người ta phát đoạn DNA cần tìm cách: Trực tiếp pp lai DNA Gián tiếp thông qua PƯ protein (kháng nguyên- kháng thể) • • - Phương pháp lai DNA: DNA-probe công cụ phát Các vi khuẩn có chứa đoạn DNA cloning mọc thành khuẩn lạc đĩa petri Các khuẩn lạc chuyển lên đĩa dự trữ tương ứng lên giấy lọc vị trí tương ứng Xử lý tờ giấy lọc để làm vỡ tế bào, giải phóng DNA khuẩn lạc Các DNA tách thành sợi đơn lai với DNA-probe có đánh dấu phóng xạ Đặt phim Rơnghen lên giấy lọc phát vết đen tương ứng với nơi có DNA-probe đính vào Khuẩn lạc tìm vị trí vết đen khuẩn lạc cần nhân tiếp chứa khuẩn lạc cần tìm Phương pháp nhận biết qua protein: Theo lý thuyết, gen đoạn DNA cần tìm mã hóa cho protein đặc hiệu, hoạt động gen dòng tế bào sản sinh protein đặc trưng Người ta sử dụng đầu dò Hồ Thị Thương Trần Thị Huyền Trang Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh - protein kháng thể dánh dấu phóng xạ để phát protein cần tìm Từ suy clon sản sinh protein có phản ứng với probe Protein-probe công cụ phát vi khuẩn chứa đoạn DNA lạ cloning clon chứa gen cần tìm trình tự nucleotide gen dịch sang ngôn ngữ khác hoàn toàn protein Câu 30 Phương pháp microarray: Mcroarray kỹ thuật đại, cho phép lúc xác định diện biểu gen mô, tế bào đặc trưng • Nguyên lý: - Gen gắn vào lam kính hiển vi (đĩa microarray) dạng sợi đơn Mỗi đĩa gắn hàng nghìn đến hàng chục nghìn gen - Tách mRNA mô tế bào đặc thù - Tiến hành phản ứng lai hỗn hợp mRNA đánh dấu chất nhuộm màu có khả phát quang với gen đĩa microarray - Sau phản ứng lai, rửa sợi mRNA không lai quan sát qua phát màu điểm lai kính hiển vi - Dựa vào kết phản ứng lai ta biết mRNA gen xuất điều kiện thí nghiệm Kết phát gen hoạt động, gen không hoạt động (ở mô tế bào khác tác động môi trường khác nhau) • - • Phương pháp tiến hành: Gắn gen đĩa microarray có lớp phủ polysine để gắn chặt gen Tách mRNA mẫu nghiên cứu khác Đánh dấu chất phát màu riêng cho mRNA loại mẫu( mẫu loại màu) Trộn chung mRNA của loại mẫu cho tiến hành lai đĩa Phát PƯ phát quang màu tối ghi lại qua hình ảnh Sử dụng chương trình máy tính chuyên dụng xác định tính trạng thể gen mẫu phân tích Khả ứng dụng: Microarray công cụ hữu hiệu phục vụ lĩnh vực genome học chức năng, nghiên cứu chức gen genome, cho biết tính trạng quan tâm gen kiểm soát chức gen VD: Để xác định gen kiểm soát tính chống chịu đó, phải thiết lập thư viện cDNA đối tượng xử lý điều kiện bình thường điều kiện stress nhiễm bệnh đem đối chiếu với để tìm khác biệt Số lượng cDNA khác biệt lớn nên phải sử dụng công cụ microarray Hồ Thị Thương Trần Thị Huyền Trang Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh Câu 32: Cơ chế gen gây U thực vật vi khuẩn Agrobacherium tumefacien? - - - - Agrobacterium vi khuẩn đất nhuộm gram (-) gây triệu chứng bệnh xâm nhiễm qua vết thương Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có chứa plasmid lớn kích thước khoảng 200 kb gọi Ti – plasmid (tumor inducing plasmid) tác nhân gây bệnh cho Khi bị nhiễm A - tumefaciens qua vết thương biểu bệnh rõ khối u hình thành chỗ lây nhiễm Sự hình thành khối u sau tiếp tục mà không cần phải có diện vi khuẩn Khả có A.tumefaciens chuyển đoạn DNA Ti – plasmid ( T – DNA ) xâm nhập vào hệ gen bị bệnh Trên Ti _ plasmid có đoạn T – DNA giới hạn bờ phải ( right bardes ) bờ trái ( left border) Trình tự bờ phải bờ trái tương tự T – DNA đoạn có kích thước 25kb chứa gen tổng hợp auxin, tổng hợp cytokinin gen gây khối u (oncogens) gen tổng hợp opine Đoạn gọi T – DNA ( tumor DNA ) đoạn chuyển vào tế bào thực vật gắn vào NST gây bệnh U Ngoài T – DNA Ti – plasmid có vùng vir (chịu trách nhiệm hoạt động lây nhiễm, chuyển nạp tiêu hóa opine ( opine catabclism ) Vùng vir chịu trách nhiệm cắt vận chuyển DNA vào ) Quá trình chuyển nạp gen vi khuẩn sau: Khi bị thương tiết chất độc vết thương thường chất có chất phenol ; acetosyringore ( As ) Hydroxy acetosyringore ( OH – As ) Các chất thu hút vi khuẩn tập trung vào vùng vết thương đồng thời chúng hoạt hóa gen vùng vir plasmid hoạt động Gen vir có nhiều loại E, D, C,G,B,A tạo Protein enzym tương ứng Các Protein có chức chính: - cắt đứt bờ phải, bờ trái để giải phóng T – DNA; - Bao bọc vận chuyển T – DNA vào TB thực vật tiếp cận vào gen ký chủ cách an toàn Câu 33 : Thiết kế vector chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens? • Có vector chuyển gen là: -Hệ thống vector đồng liên hợp: Hệ thống vector liên hợp ( co- intergrate vector ) kết liên hợp hai loại plasmid : + Ti- plasmid loại trừ vùng gen gây khối u gen tạo hợp chất opine giữ lại vùng vir vùng bờ trái,bờ phải + Thay vào gen bị cắt bỏ đoạn tương đồng với đoạn plasmid thứ hai (plasmid trung gian) để phục vụ cho việc liên hợp hai loại plasmid Hồ Thị Thương Trần Thị Huyền Trang Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh +Plasmid trung gian plasmid tách dòng từ VK E.coli tái sinh Agrobacterium +Plasmid có chứa vùng gắn gen cần chuyển nạp,các gen thị phục vụ việc chọn lọc có mặt đoạn tương đồng +Khi cho tương tác hai loại plasmid với chúng liên hợp qua trao đổi chéo hai đoạn tương đồng hình thành nên vector liên hợp +Vector liên hợp nằm VK A tumefaciens hoạt động theo chế chuyển gen thông thường VK đất -Hệ thống vector kép : Hệ thống vector kép khác với vector liên hợp chúng có hai vector (plasmid) có mặt hoạt động Agrobacterium +Một plasmid tách dòng từ e.coli có thiết kế vùng bờ trái bờ phải,nằm chúng gen thị vùng gắn gen cần chuyển +Plasmid thứ hai Ti- plasmid cải tiến : toàn vùng T-DNA vùng bờ trái bờ phải bị cắt bỏ giữ lại vùng vir,plasmid gọi plasmid hỗ trợ + Hệ thống vector hoạt động theo chế chuyển gen vi khuẩn đất Agrobacterium cách hữu hiệu Câu 34: Quá trình chuyển gen nhờ VK Agrobacterium Tumefaciens? (Phương pháp đĩa lá) -Đầu tiên dùng kim châm để tạo đĩa -Nuôi cấy đĩa dung dịch vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang plasmid chứa gen mong muốn thiết kế lại vài chục phút,trong dung dịch có bổ sung acetoxyringone để tăng cường khả hoạt hóa gen vùng vir qua thúc đẩy thêm trình chuyển gen -Sau rửa dd kháng sinh Cefotaxime để diệt hết khuẩn Hồ Thị Thương Trần Thị Huyền Trang Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh -Nuôi cấy đĩa môi trường tái sinh tạo → Chọn lọc cá mang gen chuyển vào qua phát gen thị Phát gen chuyển vào qua phân tích AND đánh giá thể gen qua biotest Câu 35: Các phương pháp chuyển gen trực tiếp vào thực vật a/ Chuyển gen nhờ kĩ thuật siêu âm: - Sauk hi tách tb trần, tạo huyền phù tb trần với plasmid tái tổ hợp mang gen mong muốn gen chọn lọc Cắm đầu siêu âm máy phát siêu âm ngập huyền phù tế bào trần sâu 3mm Cho máy phát siêu âm với tần số 20khz theo nhịp ngắn 110 mili giây Tổng thời gian tác đông khoảng 500-900 mili giây Sau đem tế bào trần nuôi môi trường thích hợp môi trường chọn lọc để tách tb trần nhận AND Nuôi cấy tái sinh b/ Chuyển gen nhờ kĩ thuật điện xung( electroporation) -Ở điện cao thời gian ngắn tạo nên lỗ màng tb trần làm cho ADN bên xâm nhập vào gen tế bào Người ta chuẩn bị huyền phù tế bào trần với plasmid tái tổ hợp mang gen mong muốn gen chọn lọc Dùng thiết bị điện xung tạo điện cao 200-600 V/am khoảng thời gian 4-5 phần nghìn giây.Kết làm cho màng tế bào trần xuất lỗ thủng tạm thời giúp cho AND ngoại lai xâm nhập Quá trình thường thực cu vét chuyên dụng “ buồng xung điện” có cực kim loại đặt cách khoảng 1-4 mm Sau trình điện xung đem tb trần nuôi môi trường thích hợp môi trường chọn lọc để tách tb trần nhận AND Nuôi cấy tái sinh tiếp tục chọn lọc c/ Kỹ thuật chuyển gen nhờ silicon carbide -Silicon carbide vật liệu dạng sợi hãng Arcometals sản xuất Sợi silicon carbide có đường kính nhỏ khoảng 0,6μm dài khoảng 10-80µm Khi lắc hỗn hợp huyền phù tế bào đơn plasmid tái tổ hợp mang gen mong muốn,gen chọn lọc với silicon carbide máy lắc vortex khoảng giây,các tb bị thủng ADN ngoại lai xâm nhập Nuôi cấy tb tái sinh thành mô sẹo cây,chọn lọc để tách chuyển gen Thường huyền phù tb đơn thu hoạch vào ngày thứ thứ sau cấy chuyển giai đoạn tốt để thực quy trình chuyển gen d/ Chuyển gen sung bắn gen -Các hạt cấu tạo từ vàng hình cầu có đường kính 1-1,5μm bao bọc vector tái tổ hợp chứa AND cần chuyển nạp (đã ngưng kết trước với CaCl2,Spermidine polyethylene glycol) Hồ Thị Thương Trần Thị Huyền Trang Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh -Các hạt đẩy với tốc độ cao (300-600m/s) nhờ thiết bị đặc biệt gọi súng bắn gen sử dụng không khí nén,hoặc helium để cung cấp lực đẩy -Ở tốc độ trên,các hạt xân nhập qua thành tế bào màng -Mật độ sử dụng hạt không gây hư hại nghiêm trọng đến tb -Mục tiêu : chọn lọc cá thể có mặt gen chuyển vào nằm gen tb e/ Phương pháp trực tiếp chuyển gen thông qua ống phấn -Dựa vào thụ tinh thực vật: sau hạt phấn nảy mầm ,ống phấn mọc qua vòi nhị để đưa tinh tử vào vào thụ tinh với tb trứng noãn -Các AND cần chuyển nạp đưa qua đường ống phấn để vào bầu nhụy tạo nên chuyển gen thụ tinh -Kỹ thuật chuyển gen không cần đến hỗ trợ nuôi cấy invitro thực thành công vải Câu 36 : Cơ sở phương pháp tạp chuyển gen mang đặc tính kháng sâu?cho ví dụ cụ thể? A.Chuyển gen cry bt _ Vi khuẩn bt sản sinh bốn loại độc tố hại côn trùng khác nhau: ngoại độc tố α ,β, γ toxin nội độc tố δ toxin Trong nội độc tố δ toxin quan trọng : tinh thể protein sau xâm nhập vào côn trùng bị protease ruột côn trùng phân giải thành đoạn nhỏ có đoạn mang khối lượng phân tử 68000 dalton có hoạt tính độc tố gây hỏng ruột côn trùng -từ năm 1987 nhà nghiên cứu Bỉ tách gen mã hoá cho protein (bt toxin) Các gen thường định vị plasmid vi khuẩn gọi tên chung gen IPC (Insecticidal crystal protein) - Các gen tách, xác định trình tự tổng hợp, thiết kế vào vector chuyển gen chuyển vào nhiều loại trồng khác đặc biệt bông, ngô, đậu tương, lúa… - Các nhà nghiên cứu tiếp tục cải tiến gen cry để nâng cao hoạt tính độc gen chuyển vào cách tinh giảm đoạn gen chuyển vào ( mã hóa cho protein độc ) thay codon cho phù hợp với trình phiên mã dịch mã thực vật làm tăng hoạt tính độc lên hàng trăm lần B Chuyển gen Vip ( vegetative insecticidal potein) - Các gen Vip1, Vip2, Vip3 mã hóa protein giai đoạn sinh dưỡng bt bc có hoạt tính diệt sâu cao VD: protein Vip kháng sâu xám cao gấp 260 lần protein cry IA diệt sâu hại ngô sâu hại thuốc -Đã chuyển gen Vip để tạo chuyển gen (Vip- cotton syngenta, ngô cokes 310 –Vip, lúa thơm – Vip ICGEB lab India) Hồ Thị Thương Trần Thị Huyền Trang Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh -Chuyển đồng thời gen cry Vip vào thực vật làm tăng hoạt tính phổ diệt sâu , đồng thời trì đặc tính kháng sâu qua nhiều hệ( ngô chuyển đồng thời gen Cry IAb Vip kansas university) - - Câu 37: Cơ sở phương pháp tạo chuyển gen mang đặc tính kháng bệnh nấm , vi khuẩn , virus ? cho VD cụ thể? 1.Cây chuyển gen mang đặc tính kháng virus : Có nhiều đường hướng tạo câu kháng bệnh virus kĩ thuật chuyển gen : chuyển gen mã hoá protein vỏ, chuyển gen tạo ribozyme ( enzyme phân giải ARN virus) chuyển gen đối ( antisens) với ARN virus Các đối khoá lại chép phiên mã ARN virus , làm câm gen sau phiên mã nhờ RNAi (RNA interference) Trong đó, việc chuyển gen mã hoá protein vỏ virus tương đối phổ biến Virus có cấu tạo gồm phần lõi axit nucleic( AND, ARN) phần vỏ protein Khi có mặt gen mã hoá protein vỏ sẵn tế bào gây hiệu ứng kìm hãm nhân virus nhiếm vào Bằng cách này, người ta chuyển gen mã hoá protein vỏ nhiều loại virus vào đối tượng trồng khác giống kháng virus như: đu đủ kháng bệnh virus đốm vòng PRSV ( Yeh cộng ,1988; viện công nghệ sinh học , 2003), chống chịu virus khảm dưa chuột (CMV)… 2.Cây chuyển gen mang đặc tính kháng bệnh nấm : -Nấm bệnh tác nhân gây hại trồng nặng, nước nhiệt đới có độ ẩm cao - enzyme làm thoái hoá thành phần tb nấm chitin β-1,3 glucan loại đực ý - Khi chuyển gen chitinase vào thuốc tăng hoạt tính kháng nấm gây hại Sự biểu đồng thời hai gen chitinase glucanase thuốc làm cho có tính kháng nấm gây hại cao có gen độc lập - Protein ức chế ribosome (ribosomal inhibition protein-RIP) biểu tính kháng nấm tốt thuốc cho tính kháng nấm cao , chuyển gen đồng thời gen RIP chitinase Cây chuyển gen mang đặc tính kháng bệnh vi khuẩn : * Có ba hướng: - Dùng gen mã hoá enzyme làm thoái hoá thành tb VK Chẳng hạn, gen lysozyme từ nguồn tb động vật từ thực khuẩn thể T4 ( bacteriophage T4) đưa vào thuốc khoai tây Các gen biểu hoạt tính lysozyme mạnh tế bào có khả phòng trừ VK erwina carotovora tốt -Gen mã hoá α-thomin- cystein chuyển giao sang thuốc phòng ngừa Vk Pseudomonas syringae - Chuyển gen sản xuất protein làm giảm độc tố VK hướng có nhiều hứa hẹn Gen chủ yếu gen sản xuất loại enzyme phân huỷ độc tố VK, vô hiệu hoá tác hại chúng Câu 38: Cơ sở phương pháp tạo mang đặc tính kháng thuốc trừ cỏ ? cho VD cụ thể? *Nền nông nghiệp đại ,công nghiệp hóa gắn liền với việc sử dụng thuốc trừ cỏ Vấn đề đặt phun thuốc trừ cỏ diệt cỏ mà không diệt trồng Muốn vậy,người ta phải tạo giống có đặc tính kháng thuốc trừ cỏ Để làm việc này, hiệu sử dụng kỹ thuật chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ vào Nguyên tắc chung phải tìm gen kháng lại chế gây hại trừ cỏ Hồ Thị Thương Trần Thị Huyền Trang Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh VD: + Nâng cao hoạt tính enzyme bị hại thuốc trừ cỏ +Tạo enzyme đột biến không bị ảnh hưởng thuốc trừ cỏ +Tạo enzyme làm tính độc thuốc trừ cỏ *Ví dụ cụ thể : Chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ glyphosate -Thuốc trừ cỏ glyphosate loại thuốc trừ cỏ phổ biến thương trường có tác dụng diệt cỏ cao dễ phân giải gây ô nhiễm môi trường - Cơ chế hại thuốc kìm hãm hoạt động enzyme enol pyruvate sikimat phosphate synthetase(EPSPS) biến đổi sản phẩm quang hợp thành axit mang mạch vòng sikimic Khi axit không hình thành gây rối loạn toàn trình trao đổi chất làm thực vật chết - Đã tìm gen mã hóa EPSPS từ vsv từ số thực vật có hoạt tính cao đồng thời tiếp tục cải biến chúng chuyển nạp cho trồng - Kết tạo có hàm lượng hoạt tính enzyme EPSPS cao gấp lần so với bình thường hoàn toàn chống chịu với thuốc trừ cỏ glyphosate Câu 39 Cơ sở phương pháp tạo chuyển gen mang đặc tính kháng steess, kháng mặn, kháng héo, già hóa? Cơ sở phương pháp tạo chuyển gen mang đặc tính kháng stress: Hậu stress gây hình thành gốc superoxyt , kích thích hình thành khoang oxygen phản ứng tế bào gây hỏng membrane, protein, AND , ARN ty thể, lục lạp ( gây hại amonisuperoxyt) Enzyme superoxytase làm giãm độc -Chuyển gen superoxyt dismutase để loại bỏ superoxyt : Peroxyhydro O2 + H2O chuyển kết hợp với gen mã hóa cho glutation transferase kích thích phản ứng superoxyt -Như chuyển gen superoxydimutase làm giảm stress -Tương tự , hoa héo lúc vận chuyển có gốc gây hại Cơ sở phương pháp chuyển gen chụi mặn: -Để bảo vệ khỏi mặn có sản sinh chất ‘ bảo vệ thẩm thấu osmoprotectants’ giúp hấp thu H2O để bảo vệ protein là: dùng rượu prolin chuyển gen tăng cường tích lũy chất này, tăng tính chụi mặn -Đưa gen tổng hop betain từ cholin -Cây A,Thaliana tích lũy muối vào không bào thông qua chế bơm Na+ /H+ antiport chuyển gen mang protein Na+/H+ antiport Cơ sở phương pháp chuyển gen chín chậm , chống héo già: Chín chậm: - Tế bào thực vật gắn pectin= xi măng thực vật Trong trình chín, enzyme pectinase phân giải pectin làm lớp tế bào tách rời ra,quả mềm - Chuyển gen antisen- polygalacturonase tạo giống cà chua flavor save chín chậm , không mềm , dễ vận chuyển Chống héo già: Ở hoa : Methyonine - > SAM > Ethylen( gây héo, chín sớm) SAM synthetase oxydase Hồ Thị Thương Trần Thị Huyền Trang Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh - Chuyển gen kháng việc tạo ethylen:Chuyển gen đối kháng với SAM synthetase gen oxydase Câu 40 : Cơ sở phương pháp tạo lúa golden rice cho giàu vitamin A? Chuyển gen mã hóa cho enzyme Phytoene synthesa( Psy), Phytoene desaturase( Pds),ζ-carotene desaturase ( Zds), Lycopene cytase (Cyc) để xúc tác cho trình chuyển hóa từ IPP thành caroten- tiền vitamin A IPP c5 DMAPP c50 ↓ GGPP c20 Phytoene synthesa↓ Phytoene c40 Phytoene desaturase ↓ ζ- carotene c40 ζ-carotene desaturase↓ Lycopene c40 Lycopene cytase (Cyc)↓ β- caroten c40 ↓ 2Vitamin A Câu 41:Cơ sở phương pháp tạo bất dục đực cho chuyển gen -Nguyên lý chung phương pháp :chuyển gen mã hóa enzyme phân giải RNA tên barnase chiết tách từ VK bacillus amyloliquefaciens gắn với promoter (TA29) vào mẹ Promoter Ta29 hoạt động vùng hạt phấn Do toàn RNA hạt phấn bị phá hủy vùng hạt phấn không bị ảnh hưởng Kết tạo dòng bất dục đực - Để khắc phục tượng bất dục xảy hạt F1 người ta lại phải chuyển gen barstor ức chế điều hòa hoạt động barnase vào bố tổ hợp tạo hạt lai F1 Gen barstor gắn với promoter TA29 kết hạt lai F1 hữu thụ Câu 42 Cơ sở phương pháp tạo chuyển gen mang đặc tính chín đậm chống già hóa? Cho vd cụ thể? -Chín đậm: liên quan đến màu sắc: Sự biến đổi màu sắc thường bắt nguồn từ hợp chất antocyanin  bước khác nhau dacamvàng đỏ Như vậy, phải thiết kế gen tương ứng để điều khiển độ chín đậm -Chống già hóa: Sự già hóa liên quan đến tích lũy ethylen Methyonin-> SAM-> ethylen Hồ Thị Thương Trần Thị Huyền Trang Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh Chuyển gen đối kháng với hoạt động enzyme SAM synthease xúc tác cho trỉnh chuyển từ methyonin -> chuyển gen enzyme oxydase xúc tác cho trình chuyển từ SAM sang ethylen Chuyển gen antisen –polygalacturonase tạo giống cà chua chín chậm FLAVOR Câu 44 Cơ sở phương pháp tạo chuyển gen tạo có sản phẩm chứa nhiều aa thay thế? Cho vd cụ thể? Trong sản phẩm cây, thiếu số aa thay Các acid amin mã hóa gen này, sang khác Ví dụ: Chuyển gen tổng hop albumin hạt hướng dương vào cỏ lupin làm tăng hàm lượng methyonin , cystein [...]... loại DNA không có ý nghĩa về mặt di truyền Trong tập hợp này chỉ chứa cả loại DNA không có ý nghĩa về mặt di truyền: không có khả năng sao chép, biểu hiện Việc tìm ra được một gen xác định từ 1 tổng thể vật chất di truyền của 1 cơ thể là việc hết sức khó khăn, tốn kém Để giải quyết vấn đề này, người ta có thể phát hiện đoạn DNA cần tìm bằng 2 cách: Trực tiếp bằng pp lai DNA Gián tiếp thông qua PƯ protein... tính của enzyme và có thể gây biến tính sợi khuôn -Mg2+ là yếu tố cần bổ sung vào phản ứng PCR + Việc bổ sung Mg2+ vào phản ứng PCR giúp làm ổn định mối tương tác giữa oligonucleotit và sợi AND khuôn AND polymerase và sợi khuôn +Nhiệt độ cao gây biến tính phan tử AND và giãn xoắn sợi đơn *Giai đoạn 2: Gắn primer -Nhiệt độ giảm đi 15-250C -Các đoạn mồi gắn vào đầu 5’ của sợi đơn AND -Quá trình kéo dài... của giống j Nguyên lý chung 2 giống tạo ưu thế lai: Sự khác biệt di truyền bố mẹ: từ 40-60% Nếu < 40% không có ưu thế lai; > 60% sẽ không hữu thụ Nhược điểm: Độ lặp lại thấp Đây là chỉ thị trội, không phân biệt được thể đồng hợp tử và dị hợp tử Có thể cùng kích thước băng nhưng có trình tự khác nhau Cần phải lặp lại thí nghiệm nhiều lần trên cùng 1 thiết bị Câu 24 Chỉ thị AFLP Nguyên lý và ứng dụng Hồ... Nu vào mạch đơn đang tổng hop ở vị trí 3’OH, khi gặp các nucleotide không có nhóm 3’OH , phản ứng bị dừng lại -Nhân tố kết thúc đặc hiệu được sử dụng là các dideoxynucleotide( phương pháp dideoxynucleotide) Quy trình dideoxynucleotide để giải trình tự AND Dideoxynucleotide là một phân tử nhân tạo, nó thiếu nhóm OH ở cả 2 vị trí 2’ và 3’ carbon của phân tử đường Nếu một dideoxynucleotide được gắn vào... sau khi hạt phấn nảy mầm ,ống phấn mọc qua vòi nhị để đưa tinh tử vào vào thụ tinh với tb trứng trong noãn -Các AND cần chuyển nạp được đưa qua đường ống phấn để vào bầu nhụy cái và tạo nên sự chuyển gen ngay khi thụ tinh -Kỹ thuật chuyển gen này không cần đến sự hỗ trợ của nuôi cấy invitro và đã được thực hiện rất thành công trên cây bông vải Câu 36 : Cơ sở phương pháp tạp cây chuyển gen mang đặc tính... phản ứng gắn biotin Phức hợp AND: ARN được xử lý với ARNase I Enzyme này phân giải chuỗi ARN nhưng không tấn công vào cặp base liên kết với AND hoặc sợi AND Kết quả là cả vùng 5’ của sợi đơn mRNA với các cDNA không hoàn toàn và vùng polyA không cặp đôi sẽ bị phân giải Sợi mARN của cDNA tổng hop hoàn toàn không bị enzyme này tác động Mẫu sau đó trộn với các hạt nam châm từ - phức hop strepavidin Biotin... trung tính, chúng sẽ mang điện tích âm Do đó khi điện di, các đoạn AND sẽ chạy về cực dương trong điện trường với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào kích thước và trọng lượng RFLP mở ra nhiều hướng ứng dụng mới cho nhiều lĩnh vực của di truyền và chọn giống +Sử dụng kỹ thuật RFLP nghiên cứu mối quan hệ họ hàng của nhiều nhóm loài thực vật, động vật +Kỹ thuật này cho phép phát hiện sự có mặt của gen cần tìm... ) và Hydroxy acetosyringore ( OH – As ) Các chất này sẽ thu hút vi khuẩn tập trung vào vùng vết thương đồng thời chúng cũng hoạt hóa các gen ở vùng vir của plasmid hoạt động Gen của vir có nhiều loại E, D, C,G,B,A và tạo ra các Protein enzym tương ứng Các Protein này có 2 chức năng chính: - cắt đứt bờ phải, bờ trái để giải phóng T – DNA; - Bao bọc và vận chuyển T – DNA vào TB thực vật và tiếp cận vào... khuẩn, chúng là một tập hop các tế bào đồng nhất chứa một đoạn AND đã gắn +Từ một tập đoàn vi khuẩn chứa AND này, có thể chiết xuất ra một loại AND cần thiết từ một dòng Câu 17: Kĩ thuật RFLP và ứng dụng? RFLP( Restriction Fragment Length Polymorphism) Nguyên lý: Kỹ thuật RFLP dựa trên sự sai khác của phổ băng điện di và độ dài của các phân đoạn bị cắt bởi enzyme giới hạn +số đoạn cắt của một phân tử... kháng thuốc trừ cỏ ? cho VD cụ thể? *Nền nông nghiệp hiện đại ,công nghiệp hóa gắn liền với việc sử dụng thuốc trừ cỏ Vấn đề đặt ra là khi phun thuốc trừ cỏ sẽ chỉ di t cỏ mà không di t cây trồng Muốn vậy,người ta phải tạo ra các giống có đặc tính kháng thuốc trừ cỏ Để làm được việc này, hiệu quả nhất là sử dụng kỹ thuật chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ vào cây Nguyên tắc chung là phải tìm được gen kháng ... ngân hàng mẫu, tập hợp tế bào có chứa loại DNA ý nghĩa mặt di truyền Trong tập hợp chứa loại DNA ý nghĩa mặt di truyền: khả chép, biểu Việc tìm gen xác định từ tổng thể vật chất di truyền thể việc... giới hạn -Chạy điện di sản phẩm cắt -Thực phản ứng Sourthern Blot( Chuyển băng điện di vào giấy lọc, lai mẫu dò đánh dấu từ phát sản phẩm lai) Đây kỹ thuật kinh điển , xác Ứng dụng: RFLP cho phép... thuộc vào kích thước trọng lượng RFLP mở nhiều hướng ứng dụng cho nhiều lĩnh vực di truyền chọn giống +Sử dụng kỹ thuật RFLP nghiên cứu mối quan hệ họ hàng nhiều nhóm loài thực vật, động vật +Kỹ thuật