Đề cương ôn tập kĩ thuật di truyền nguyên lí và ứng dụng..

Hồ Thị Thương Trần Thị Huyền Trang Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh- Cắt đầu bằng: là enzyme cắt giới hạn cắt cả hai mạch AND cùng một vị trí, các đoạn cắt theo kiểu này không có khả năng tự

ĐỀ CƯƠNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN Câu 1: Trình bày định nghĩa genome?

Genome là một khái niệm dùng để chỉ toàn bộ các gen có trong một giao tử đơn bội, có nghĩa là trong giao tử của một loài, mỗi nhiễm sắc thể tương đương có mặt một chiếc

Câu 2: Gen là gì? Trình bày một cấu trúc của một gen điển hình ở Eukaryote.

 Gen là một đơn vị di truyền, mỗi gen là một đoạn của chuỗi DNA mang thông tin di truyền chophân tử RNA hoặc một chuỗi polypeptide nhất định

 cấu trúc của một gen điển hình ở sinh vật nhân chuẩn:

+ thành phần của gen ở sinh vật nhân chuẩn gồm:

+ vùng điều khiển ( promoter): điều khiển hoạt đôngj của gen promoter là trình tự nhận biết và

vị trí tiếp cận với gen của enzyme RNA polymerase và các nhân tố phiên mã, promoter có chức năng kiểm soát hoạt đọng của gen

Promoter của sinh vật eukaryote được chia làm 3 nhóm chủ yếu:

Promoter có vai trò quyết định:

- sợi DNA được làm khuôn

- Khi nào thì tổng hợp mRNA

- Vị trí bắt đầu phiên mã mRNA

- Khi nào thì dừng quá trình phiên mã.1

+ Exon: là vùng DNA được phiên mã thành mRNA, mỗi exon có chứa các trình tự mã hóa protein được gọi là khung đọc mở (ORF) Mỗi bộ 3 nu của khung đọc mở tương ứng với một codon mã hóa cho một aa Khung đọc mở được đọc từ đầu 5’ đến 3’dọc theo phân tử mRNA Khung đọc mở bắt đầu bằng một mã khởi động (AUG) và kết thúc bởi mã kết thúc ( UAA/UAG/UGA)

Exon gồm 3 phần - vùng mã hóa được phiên mã thành các mRNA, các mRNA có thể được dịch

mã tạo nên các sản phẩm protein

- Vùng không dịch mã 5’

- Vùng không dịch mã 3’

+ Intron: intron hay còn gọi là các trình tự xen kẽ không mang mã di truyền chúng sẽ được phiên mã nhưng không được dịch mã Các intron này sẽ bị cắt bỏ trong quá trình biến đổi

tiền ,RNA thành mRNA hoàn chỉnh

+ các vùng UTR: vùng không dịch mã 5’ có liên quan đến sự vận chuyển mRNA, khởi động sự dịch mã Vùng này không được dịch mã thành protein

Hồ Thị Thương Trần Thị Huyền Trang Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh

+ enhancer và silencer có thể nằm ở vị trí trong vùng promoter nằm trong vùng mang mã di truyền của gen hoặc nằm trong các đoạn intergenic ở phía trước hoặc ở phía sau gen

Hoạt động của các trình tự enhancer và silencer làm thay đổi cường độ hoạt động của gen, hoặc làm ngừng hoạt động phiên mã của gen

Câu3: Trình bày cấu trúc gen nhân của sinh vật eukaryote.

Độ lớn tùy thuộc vào sinh vật biến động từ 10Mb đến 100000Mb thường tương quan thuận với tính phức tạp của tổ chức cơ thể Genome của sinh vật bậc cao thường lớn hơn genome sinh vật bậc thấp về số lượng gen; lượng DNA lặp lại

Genome của nhân được cấu trúc nên từ một bộ cặp NST tương đồng, mỗi NST thường chỉ chứa mội phân tử DNA, trừ NST khổng lồ của ruồi dấmvaf mội số NST của vi khuẩn, genome nhân của các loài khác nhau chứa hàm lượng DNA khác nhau, bộ NST trong nhân có số lượng, kích thước và hình dạng xác định khác nhau đặc trưng cho từng loài

Các loại DNA trong genome nhân gồm:

- Loại DNA lặp lại ở mức độ cao: chiếm khoảng 10% DNA của tế bào là các trình tự ngắn dưới 10bp và có từ 105 đến 107 bản sao cho mỗi genome

- Loại DNA có trình tự lặp lại thấp hoặc trung bình: chiếm khoảng 20% là các đoạn lặp lại có kích thước lớn hơn100bp và thường xen kẽ với các trình tự lặp lại mội lần dọc theo NST

- Loại DNA chúa trình tự duy nhất: chiếm khoảng 70% và là loại chỉ có một bản sao và chỉ lặp lại đôi lần

Câu 4: Trình bày cấu trúc genome ty thể của eukaryote

Độ lớn rất biến động mà không tương ứng với tính phức tạp của sinh vật genome ty thể của động vật thường nhỏ với tổ chức di truyền được gói gọn, các gen sắp xếp sát nhau với ít khoảng trống ở giữa genome ty thể ở động vật thường lớn hơn genome ty thể của động vật có vú và nấmmen

Kích thước genome ty thể cũng khác nhau tùy thuộc từng loài VD: genome ty thể của brassica campestris có độ lớn 218kb còn của cucumis melo là 2400 kb, nhỏ hơn nhiều so với genome nhân

Tổ chức di truyền của genome cũng ít gói gọn, nhiều gen có chứa intron

Số lượng bản sao từ 5 đến 10 genome/ty thể

DNA ty thể tồn tại chủ yếu dưới dạng mạch vòng kép, đôi khi có xuất hiện mạch thẳng như: nấmmen, Pẩmecium

Thông tin di truyền trong genome ty thể: genome ty thể chứa các gen mã hóa cho rRNA của ty thể và một số enzyme tham ra vào chuỗi hô hấp

Ngoài ra ty thể còn chứa các gen mã hóa tRNA, protein ribosome và một số protein khác liên quan đến quá trình phiên mã Dịch mã và vận chuyển các protein khác vào ty thể từ tế bào chất

Câu 5: Trình bày cấu trúc genome lạp thể ở eukaryote?

Lục lạp cũng chứa DNA ở đạng các phân tử kép có cấu trúc vòng Mỗi lục lạp và ty thể đều chứanhiều DNA, tuy nhiên mỗi chúng đều chứa các gen giống nhau

Thong tin di truyền chứa trong genome lục lạp: genome lục lạp có khoảng 200 gen các gen này

mã hóa cho các rRNA và tRNA đồng thời mã hóa cho các protein của ribosome và các protein cần cho hoạt động quang hợp

Câu 6: Cấu trúc hệ gen của virus?

Virus thường có lượng thông tin di truyền it hơn nhiều so với sinh vật eukaryote Genome của virus có thể là DNA hoặc RNA DNA của virus có thể là chuỗi đơn( thực khuẩn thể) hay chuỗi kép DNA của virus có cấu trúc đặc biệt ở dạng vòng: hai chuỗi DNA nối cộng hóa trị với nhau tạo thành hình vong khép kín liên tục, không có đầu 3’ và 5’ DNA của virus gồm hàng ngàn đếnhàng chục ngàn nu

Câu 7: Trình bày cấu trúc genome của vi khuẩn?

DNA của vi khuẩn được nằm trong NST sơ khai Phần lớn các khuẩn chỉ có một NST/tế bào DNA của vi khuẩn cũng ở dạng vòng, chuỗi kép Trên DNA có chứa các gen mã hóa cho một protein đặc thù Ngoài NST chính vi khuẩn còn chứa dạng DNA khác gợi là plasmid có kích thước bé hơn, dạng vòng Có khả năng tự nhân bản, các plasmid thường có nhũng gen có tính đặc thù cao

- Degradative plasmid: là các plasmid phân rã mang các gen đặc hiệu có khả năng sử dụng các chất chao đổi bất thường

- Cryp plasmid là các plasmid tinh thể không mang gen mã hóa bất kì chức năng nào

Câu 8: Khái niệm về các enzyme giới hạn? Cách đặt tên? Các kiểu cắt, cơ chế hoạt động? Ứng dụng enzyme giới hạn trong công nghệ gen?

+ Enzym cắt giới hạn là enzyme có khả năng nhận biết những đoạn trình tự DNA nhất định và cắt AND ở ngay điểm này hay ở điểm kế cận

VD: Eco RI 5’ GAATTC 3’

3’ C TTAAG 5’

+ Cách đặt tên: tên enzyme cắt giới hạn được ghép bởi chữ cái đầu tiên viết hoa là tên chi vi

khuẩn mà enzyme được phát hiện tiếp theo là hai chữ đầu của loài không viết hoa, sau đó là mộtchữ hoa chỉ tên chủng vi khuẩn và cuối cùng là chữ sô la mã chỉ thứ tự enzyme giới hạn được phát hiện

VD: HpaI và HpaII là enzyme giới hạn thứ nhất và thứ hai cùng được tách ra từ Haemophilus parainflenzae

+ các kiểu cắt: gồm cắt đầu bằng và cắt đầu sole

Hồ Thị Thương Trần Thị Huyền Trang Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh

- Cắt đầu bằng: là enzyme cắt giới hạn cắt cả hai mạch AND cùng một vị trí, các đoạn cắt theo kiểu này không có khả năng tự kết hợp với nhau Để nối lại đòi hỏi các enzyme gắn ligase hoặc các adaptor đặc dụng

- Cắt tạo đầu sole: các enzyme giớ hạn cắt hai mạch của AND ở hai vị trí lệch nhau Kết quả tạo nên các đoạn AND có các đầu sole có trình tự nu hoàn toàn bổ sung cho nhau nên có thể tự nối với nhau, nên đầu so le này còn được gọi là đầu dính

+ ứng dụng: người ta thường sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt tạo đầu sole 5’ hoặc 3’ trong công nghệ di truyền do có khả năng tự nối lại với nhau hoặc các đoạn DNA khác có đầu tương tự, khi

sử dụng các enzyme cắt giới hạn cần có các điều kiện nhiệt độ, độ ph, dung môi thích hợp.VD: Eco RI 5’ GAATTC 3’ => 5’ G + AATTC 3’

3’ CTTAAG 5’ 3’ CTTAA G 5’

Câu 9: Vector nhân dòng là gì? Nêu tiêu chuẩn của một vector nhân dòng?

+ vecter nhân dòng là các phân tử được dung để mang các đoạn DNA/gen phục vụ cho việc nhân, tách dòng và biến nạp gen

+ tiêu chuẩn của một vecter nhân dòng:

- Có điểm khởi đầu sao chép ori để tự sao chép và tồn tại độc lập trong tế bào

- Có các đoạn trình tự nhật biết cho enzyme cắt giới hạn

- Có đoạn trình tự khởi điểm

- Có dấu chuẩn chọn lọc cho phép dễ dàng phát hiện chúng trong tế bào chủ nhận thông thường dấu chuẩn chọn lọc là các gen kháng chất kháng sinh, hoặc gen tổng hợp chất màu

Câu 10; Trình bày cấu trúc di truyền và nguyên tắc hoạt động của vector plasmid sử dụng trong công nghê gen?

+ plasmid là những phân tử nhỏ có cấu trúc mạch vòng, nằm ngoài NST của tế bào vi khuẩn và

có khả năng tự nhân bản

+ cấu trúc di truyền của một plamid gồm 3 phần chính:

- Vị trí nhận biết của các enzyme cắt giới hạn

- Có các gen chỉ thị chọn lọc

- Có gốc tái bản ori

+ một số plasmid thường dung trong công nghệ di truyền:

 Plasmid pBR 322

PBR 322 có mang 2 gen kháng kháng sinh Ampiciline và tetracycline, plasmid này có điểm cắt cho các enzyme giới hạn bam HI, Hin III, Sal I,nằm trong vùng kháng tetracycline, một điểm cắt cho enzyme Pst I ở vùng kháng Ampicilin và một điểm cắt cho Eco RI nămg ở vùng mã hóa của DNA Plasmid này có một gốc tái bản và chỉ hoạt động trong E.coli.

Khi nuôi cấy trong môi trường chọn lọc ampicillin và tetracycline thì những vi khuẩn có chứa plasmid sẽ sống còn các tế bào vi khuẩn ko chứa plasmid sẽ chết

 Plasmid PUC 19

Đây là nhóm plasmid được phát triển từ nhóm plasmid pBR 322 Phần chứa gen khang

tetracycline được cắt bỏ còn phần gen kháng Ampicillin và gốc tái bản của pBR322 được giữ lại,ngoài ra các vị trí nhân dòng và các vị trí cắt của enzyme cắt giới hạn được phân bố tập trung vàomột vị trí gọi là vị trí đa nhân dòng (MCS) Các plasmid này có gen αlacZ, gen này mã hóa cho lacZ, gen này mã hóa cho

sự hình thành enzyme β-glactosidase, là enzyme xúc tác cho phản ứng biến đổi màu của chất Xgal là một hợp chất không màu thành hợp chất X+glactose Chất X màu xanh chàm, nên khi bị chèn đoạn DNA ngoại lai vào vị trí nhân dòng làm ko sản sinh ra βgalactosidase nên chất Xgal trong môi trường nuôi cấy ko bị biến màu Và các vi khuẩn chứa plasmid này sẽ cho khuẩn lạc đơn màu trắng, trong khi các vi khuẩn chứa plasmid nguyên vẹn sẽ cho khuẩn lạc đơn màu xanh chàm

Hồ Thị Thương Trần Thị Huyền Trang Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh

Câu 11: Trình bày cấu trúc di truyền và nguyên tắc hoạt động của vector bacteriophage sử dụng trong công nghệ gene?

Cấu trúc di truyền của vector bacteriophage:

Phage là một virus mang AND sợi đôi có kích thước khoảng 50bp, DNA của nó có dạng phân tử mạch thẳng có 2 đầu bổ sung sợi đơn dài 12 nu( được dùng làm sợi cos) Sau khi xâm nhập vào

vi khuẩn vào vi khuẩn vật chủ, DNA tạo vòng ngay lập tức bằng cách ghép 2 đầu dính cos nhờ enzyme ligase của vật chủ Các giai đoạn tiếp đó có thể dẫn đến việc làm tan tế bào vật chủ hoặc gây ra hiện tượng tiềm tan( trong giai đoạn này λ AND hop nhất vào trong chromosome của tế bào vật chủ.)

Các phage có khả năng thực hiện tải nạp mang gen từ tế bào vi khuẩn cho sang tế bào vi khuẩn nhận Vector phage λ này được sử dụng rộng rãi để xây dựng thư viện genome vì nó mang được đoạn AND ngoại lai lớn hơn từ 15-23kp sp với plasmid, dễ bảo quản, dễ tách ra để phân tích Ưuđiểm nổi bật của là chúng có hệ thống tự động xâm nhập và nhân đôi trong tế bào vi khuẩn hiệu quả hơn so với việc biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn Tuy nhiên , những thao tác ban đầu cóphức tạp hơn

Đặc điểm của bacteriophage λ:

Ở giữa AND của phage λ có một vùng đệm hay vùng trung tâm có chiều dài bằng 1/3 chiều dài của phage , vùng này không quan trọng, nếu cắt vùng đi cũng không ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của phage trong tế bào vật chủ và khả năng làm tan tế bào chủ Vì thế có thể cắt bỏ đoạn

đó đi để chèn đoạn AND ngoại lai vào Do AND của phage có mạch thẳng nên khi bị cắt bỏ đoạn

ở giữa sẽ bị tách làm 2 nhánh: Trái Phải Đoạn gen ngoại lai được gắn vào sao cho đoạn AND tái tổ hop không lớn quá 105% hoặc nhỏ hơn 78% bộ gen bình thường của phage Khả năng có

thể mang một đoạn AND ngoại lai dài hơn là ưu thế của phage so với plasmid Điều đó có nghĩa rằng lấy đoạn đệm ra ( chiếm 60% chiều dài) thì đoạn còn lại quá ngắn để lắp ráp vào đầu, nó chỉđược lắp ráp khi có AND ngoại lai gắn vào Nhờ vậy dễ xác định AND ngoại lai đã được gắn vào phage hay chưa, loại ỏ những phage mà chưa có đoạn AND ngoại lai gắn vào.

Trên phage người ta đã chọn được vị trí cắt cho enzyme cắt hạn chế và xây dựng phương pháp đóng gói để đưa đoạn AND ngoại lai vào phage

Tạo dòng trong bacteriophage λ:

Bacteriophage λ có genome phức tạp và được dùng như một vector AND của nó chứa một số vị trí cần thiết cho enzyme cắt giới hạn cần thiết để tạo dòng Các bước tạo dòng được tóm tắt:-Tinh sạch AND vector bằng ly tâm gradien tốc độ hoặc điện di gel sau khi đã cắt bằng RE.-Các nhánh trái và phải sau đó được liên kết với AND ngoại lai có kích thước khoảng 20kbp có đầu kết thúc tương ứng với các đầu nhánh

-Kết quả các AND tái tổ hop được đóng gói trong các phageλ

-Các phage tái tổ hop mang các đoạn AND ngoại lai mong muốn được xác định bằng phương pháp lai acidnucleic

-Tinh sạch và chọn tế bào vật chủ để cho nó sinh sản để duy trì và phân tích các đoạn AND ngoại lai

Chọn lọc các vector λ thích hop:

Có 2 yếu tố ảnh hưởng đến sự chọn lọc là enzyme giới hạn được sử dụng và kích thước của AND ngoại lai Chỉ khoảng 60% genome nhánh trái và nhánh phải là cần thiết cho sự sinh tan của phage Khả năng sống sót của phage sẽ giảm khi kích thước AND tái tổ hợp dài hơn

105%genome phage và ngắn hơn 78%genome của phage Như vậy, điều quan trọng là chọn vector và AND ngoại lai thế nào để kích thước phage tái tổ hop nằm trong giới hạn cho phép

Hồ Thị Thương Trần Thị Huyền Trang Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh

Nó trở thành đoạn dây thẳng, hình thành các đoạn AND chồng lớp lên nhau với độ dài khoảng 50kb

Một số vector được thiết kế thuận lợi cho sự sinh trưởng thuận lợi của chúng trong E.coli mang prophage , phenotype này được Spi+ Các chủng λ thiếu 2 gen cần thiết trong tái tổ hợp được gọi

là Spi- sẽ sinh trưởng tốt trong các thể tiềm tan P2 chừng nào chúng còn mang chuỗi chi( chi là

cơ chất cho sự tái tổ hop xúc tác bởi recA.)

Tạo dòng ở các vector λ L47.1 , λ1059, BF101 đã tiến hành bằng cách loại bỏ các đoạn đệm giữarec và gram Kết quả thu được phage tái tổ hop Spi_ , chúng có thể nhận biết hoặc chọn lọc bằng khả năng sinh trưởng của chúng trên các thể tiềm tan P2 recA+ của E.coli

Hầu hết các vector thay thế mất gram khi đoạn đệm bị loại bỏ Các thể tái tổ hop được tạo thành bởi những vector như thế phải được sinh sản trong vi khuẩn rec A+ Phage1-sep6-lac5 mang red

và gram trong nhánh phải của nó và các thể tái tổ hop được tạo thành phenotype Spi+ có thể được nhân lên trong những vi khuẩn đột biến rec A-

Hồ Thị Thương Trần Thị Huyền Trang Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh

Câu 12: Trình bày cấu trúc di truyền và nguyên tắc hoạt động của vector YAC sử dụng trong công nghệ gene?

Một nghiên cứu cho thấy một NST muốn nhân đôi và phân ly tốt cần có:

Các NST này được đưa vào tế bào chủ, được nhân lên như các NST khác trong tế bào nấm men

và ta có được các gene mong muốn

Vector này tương đối ngắn và dễ thao tác Sở dĩ như vậy là do khởi điểm tái bản và tâm động ngắn Khởi điểm tái bản của nấm men Saccharomyces cerrevisae được tập trung trong một vùng genome ngắn trong khi ở Saccharomyces pombe khởi điểm tái bản dài đến trên vài nghìn base Vector YAC có thể mang các đoạn DNA dài 150- 1000kb và chúng có thể được thiết kế trong nấm men bằng tái tổ hợp tương đồng Hạn chế chủ yếu của vector YAC là không ổn định

Câu 13:Trình bày cấu trúc di truyền và nguyên tắc hoạt động của vector BAC sử dụng trong công nghệ gene.

Hệ thống NST nhân tạo của vi khuẩn( Bacterium Artifical Chromosome- BAC) dựa trên

Plasmid F-factor, nó có thể tái bản trong Ecloi với các đoạn chèn lên tới 300 kb Thể tái tổ hợp BAC được biến nạp vào trong tế bào vi khuẩn bằng xung điện Các BAC thuận lợi cho việc xây dựng thư viện, lập bản đồ gen, phân tích genome Chúng có hiệu suất tạo dòng cao, các đoạn AND được chèn vào dễ dàng thao tác, duy trì ổn định

Một plasmid F cơ bản gồm 4 vùng cần thiết, có chức năng ổn định plasmid, quyết định số lượng bản sao Đó là parA, parB, oriS, repF

Cả parA và parB đầu cần cho việc phân đoạn và ổn định plasmid, ngoài ra parB còn cần cho việckết hợp với các F-factor khác, oriS là gốc tái bản, repF mang tín hiệu protein E cần thiết cho sự tái bản từ oriS và kiểm soát số lượng bản sao Trên F-plasmid còn có vùng mang gen kháng kháng sinh chloramphenicol và gen L để làm maker chọn lọc các thể biến nạp Chủng E.coli được sử dụng cho việc tạo dòng BAC là DH10B, đặc điểm chính của nó là mang những đột biến ngăn cản:

-Sự phân cắt AND lạ bởi hệ enzyme nội sinh(hsd/RMS)

-Sự phân cắt AND có gốc methyl(mcrA, mcrB, mcrC, mcrR)

-Sự tái tổ hợp(recA1)

Nhìn chung BAC có những đặc điểm giống như các plasmid vector tiêu chuẩn của E.coli như:-Có vùng ori cần thiết cho sự tái bản plasmid

-Có nguồn gốc từ một plasmid lớn trong tự nhiên F-Plasmid

-Có số lượng bản sao thấp(1-2 bản sao/tế bào)

-Hiệu suất biến nạp thấp Đã khắc phục được bằng phương pháp xung điện để biến nạp AND tái

Hồ Thị Thương Trần Thị Huyền Trang Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh

Câu 14: Cloning gen là gì? Công thức tính số dòng cần tập hợp trong thư viện mẫu đã nhân dòng.

-Clonging gen(nhân dòng gen) là quá trình nhân bản từng dòng AND từ một hỗn hợp các đoạn AND vốn là sản phẩm của quá trình cắt bằng enzyme giới hạn Việc tập hợp các đoạn AND đã nhân bản được gọi là quá trình tạo thư viện mẫu đã nhân dòng

-Cấu trúc của thư viện AND đã nhân dòng:

Thư viện AND là tập hop các dòng AND trong vector

+ Thư viện AND genome

+ Thư viện cDNA

Thư viện genome có thể được thanh lọc để chứa các trình tự mong muốn

Thư viện AND genome:

- Công thức tính số dòng cần thiết tập hop đủ để đại diện cho 1 bộ Genome.

N=ln(1-P)/ln(1-a/b)

N: là số dòng cần thiết

P: là xác suất đại diện mong muốn của một đoạn trình tự cụ thể.(thường gặp bằng 0,95 hoặc 0,99)

a: kích thước trung bình của các đoạn cần tách

b: kích thước của genome

Câu 15: Trình bày kĩ thuật nhân dòng gen bằng plasmid.

Kỹ thuật nhân dòng gen bằng plasmid- vector trong E.coli(cho phép nhân các đoạn có kích thước<=10kb)

-Cắt AND bằng enzyme cắt hạn chế

-Chọn plasmid để gắn mẫu đã cắt Plasmid phải có những đặc tính sau:

+ Có gen chịu trách nhiệm kháng kháng sinh(ampicilin, tetracylin) và 1 gen khác chịu trách nhiệm sinh màu( mã hóa cho β- galoctosidase, enzyme này khi tác dụng với X-gal sẽ có màu xanh) thường dùng là plasmid pUC Cắt plasmid bằng enzyme cắt giới hạn cùng loại với

enzyme đã cắt AND nghiên cứu

-Gắn các đoạn cắt AND vào plasmid(vector nhân dòng):

Trộn các đoạn cắt AND với các plasmid đã chọn và đã được cắt bởi cùng loại enzyme cắt giới hạn.) theo một tỷ lệ nhất định Ủ hổn hợp nhiệt độ từ 10-150C trong 6h với sự có mặt của

enzyme ligase

-Chuyển nạp các plasmid đã gắn AND vào tế bào vi khuẩn E.coli:

+Xử lý vỏ ngoài của vi khuẩn bằng Cacl2 để tăng hoạt tính tiếp nhận plasmid

+Tạo hổn hop vi khuẩn với AND plasmid trong diều kiện lạnh(đặt trên nước đá 30phút) Sau đó đưa hỗn hop này vào tình trạng nhiệt độ cao 420C( trong bếp cách thủy) 90giây Sự phân chia tế bào vi khuẩn xảy ra, plasmid tự tiếp xúc với tế bào vi khuẩn Ngay lập tức đưa vào hỗn hop lạnh,

ở sốc lạnh các plasmid sẽ đi vào và cố định trong tế bào vi khuẩn

-Hỗn hợp trên sẽ được nuôi cấy trên các đĩa peptri có chứa mội trường LB cùng chất kháng kháng sinh và X-gal trong một đêm ở 370C Khi đó sẽ mọc lên các khuẩn lạc màu xanh và màu trắng

-Chọn các khuẩn lạc vi khuẩn có chứa ADN ngoại lai:

+Chỉ vi khuẩn nào có chứa Plasmid đã chuyển nạp mới có khả năng sống sót trên môi trường và sinh khuẩn lạc( vì plasmid chuyển nạp mới có gen kháng kháng sinh)

+Do cấu trúc của plasmid , vùng gen chịu trách nhiệm sinh màu (gen mã hóa cho β-

galactosidase) sẽ là vùng bị cắt để gắn AND ngoại bào, cho nên các khuẩn lạc có màu xanh là khuẩn lạc có chứa plasmid nhưng không gắn AND ngoại lai, còn khuẩn lạc có màu trắng là khuẩn lạc có chứa đoạn AND cần nhân dòng được ghép vào

-Nhân dòng:

+Nhân nhanh các khuẩn lạc thực chất là nhân nhanh các mẫu AND Mỗi khuẩn lạc đơn phát triển từ một tế bào vi khuẩn, chúng là một tập hop các tế bào đồng nhất chứa một đoạn AND đã gắn

+Từ một tập đoàn vi khuẩn chứa AND này, có thể chiết xuất ra một loại AND cần thiết từ một dòng

Khi cần tách đoạn AND nào đó, cần nhân dòng vi khuẩn chứa plasmid mang đoạn AND mong muốn sau đó tách chiết AND từ plasmid của dòng vi khuẩn này Một plasmid có thể tạo được từ 20-50 bản sao trong 1 tế bào vi khuẩn, như vậy số AND được nhân lên rất lởn mỗi khuẩn lạc đơn

Hồ Thị Thương Trần Thị Huyền Trang Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh

Câu 16:Trình bày kĩ thuật nhân dòng gen bằng vector BAC?

Hệ thống NST nhân tạo của vi khuẩn( Bacterium Artifical Chromosome- BAC) dựa trên

Plasmid F-factor, nó có thể tái bản trong Ecloi với các đoạn chèn lên tới 300 kb

Kỹ thuật nhân dòng gen bằng vector BAC gồm những bước cơ bản sau:

-Tách chiết AND từ mẫu nghiên cứu, cắt AND bằng enzyme cắt giới hạn để tạo ra AND làm nguyên liệu cho cho quá trình nhân dòng

-Chọn vector BAC để gắn mẫu đã cắt Vector phải có những đặc tính sau:

Một plasmid F cơ bản gồm 4 vùng cần thiết, có chức năng ổn định plasmid, quyết định số lượng bản sao Đó là parA, parB, oriS, repF

Cả parA và parB đầu cần cho việc phân đoạn và ổn định plasmid, ngoài ra parB còn cần cho việckết hợp với các F-factor khác, oriS là gốc tái bản, repF mang tín hiệu protein E cần thiết cho sự tái bản từ oriS và kiểm soát số lượng bản sao

Trên F-plasmid còn có vùng mang gen kháng kháng sinh chloramphenicol và gen L để làm maker chọn lọc các thể biến nạp

-Gắn các đoạn cắt vào vector BAC ( kích thước AND chèn vào có thể lên tới 300kb)

Trộn các đoạn cắt AND với vector BAC đã chọn và đã được cắt bởi cùng loại enzyme cắt giới hạn.) theo một tỷ lệ nhất định Ủ hổn hop nhiệt độ từ 10-150C trong 6h với sự có mặt của enzyme ligase

-Chuyển nạp các vector BAC sau phản ứng gắn vào vi khuẩn E.coli để nhân bản các đoạn AND

đã được gắn cùng với vector

+Xử lý vỏ ngoài của vi khuẩn bằng Cacl2 để tăng hoạt tính tiếp nhận vector BAC.

Do hiệu suất biến nạp thấp nên khắc phục bằng phương pháp xung điện để biến nạp AND tái tổhợp vào E.coli

-Hỗn hợp trên sẽ được nuôi cấy trên các đĩa peptri có chứa mội trường LB cùng chất kháng kháng sinhchloramphenicol và X-gal trong một đêm ở 370C Khi đó sẽ mọc lên các khuẩn lạc màu xanh và màu trắng

-Chọn các khuẩn lạc vi khuẩn có chứa ADN ngoại lai:

+Chỉ vi khuẩn nào có chứa BAC đã chuyển nạp mới có khả năng sống sót trên môi trường và sinh khuẩn lạc( vì plasmid chuyển nạp mới có gen kháng kháng sinh)

+Do cấu trúc của BAC , vùng gen chịu trách nhiệm sinh màu (gen mã hóa cho β- galactosidase)

sẽ là vùng bị cắt để gắn AND ngoại bào, cho nên các khuẩn lạc có màu xanh là khuẩn lạc có chứa plasmid nhưng không gắn AND ngoại lai, còn khuẩn lạc có màu trắng là khuẩn lạc có chứa đoạn AND cần nhân dòng được ghép vào

-Tập hợp các đoạn gắn thành từng dòng riêng hình thành thư viện mẫu đã nhân dòng.Từ đây có thể chọn lọc ra thư viện mẫu mà mình quan tâm

+Nhân nhanh các khuẩn lạc thực chất là nhân nhanh các mẫu AND Mỗi khuẩn lạc đơn phát triển từ một tế bào vi khuẩn, chúng là một tập hop các tế bào đồng nhất chứa một đoạn AND đã gắn

+Từ một tập đoàn vi khuẩn chứa AND này, có thể chiết xuất ra một loại AND cần thiết từ một dòng

Câu 17: Kĩ thuật RFLP và ứng dụng?

RFLP( Restriction Fragment Length Polymorphism)

Nguyên lý: Kỹ thuật RFLP dựa trên sự sai khác của phổ băng điện di và độ dài của các phân

đoạn bị cắt bởi enzyme giới hạn

+số đoạn cắt của một phân tử AND trên một enzyme cắt hạn chế là đặc hiệu cho từng phân tử AND

+Khi có sự thay đổi về trình tự nucleotide, sẽ làm thay đổi vị trí của enzyme giới hạn dẫn đến sự thay đổi độ dài của các đoạn

+Khi xử lý các mẫu AND bằng cùng một cặp enzyme giới hạn thì các hệ genome có cấu trúc khác nhau sẽ tạo nên các đoạn cắt có chiều dài khác nhau Ngược lại, nếu các hệ genome có cấu trúc giống nhau sẽ tạo nên các đoạn cắt giống nhau thể hiện giống nhau trên điện di đồ

Trong thực tế, điều này chỉ đúng với AND có kích thước nhỏ (AND lục lạp, AND ty thể ) 200kb.Đối với AND có kích thước lớn của nhân:

Số lượng tạo ra khi cắt bởi RE lớn nên việc đánh giá các băng điện di các sản phẩm cắt AND genome của các mẫu nghiên cứu khác nhau là không thể thực hiện được Dù các băng là tách biệt, nhưng hiện hình băng điện di bằng Ethidium Bromide cho kết quả là một dải màu, không phải các băng riêng biệt

Hồ Thị Thương Trần Thị Huyền Trang Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh

Sử dụng mẫu dò: Trình tự AND cụ thể ( ngẫu nhiên hoặc xác định) phát hiện ra sự hiện diện của một trình tự bổ sung tương ứng Từ đó có thể sử dụng kết quả hiện diện băng lai mà đánh giá sự

đa hình tương ứng bổ sung với mẫu dò

Quy trình chung gồm các bước:

-Thu mẫu nghiên cứu

-Tách chiết AND của mẫu nghiên cứu

-Cắt AND bằng enzyme cắt giới hạn

Do đó khi điện di, các đoạn AND sẽ chạy về cực dương trong điện trường với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào kích thước và trọng lượng

RFLP mở ra nhiều hướng ứng dụng mới cho nhiều lĩnh vực của di truyền và chọn giống +Sử dụng kỹ thuật RFLP nghiên cứu mối quan hệ họ hàng của nhiều nhóm loài thực vật, động vật +Kỹ thuật này cho phép phát hiện sự có mặt của gen cần tìm trong hệ genome nghiên cứu;+ phát hiện sự đa dạng AND qua các cá thể khác nhau của một loài; phát hiện các thể đột biến gene

-Kỹ thuật này còn cho phép phát hiện các thể lai soma, lập bản đồ giới hạn của một gene còn cónhiều ứng dụng:

+Dựa vào hoạt động của enzyme AND polymerase trong quá trình tổng hop AND

+ Enzyme này xúc tác gắn các Nu vào mạch đơn đang tổng hop ở vị trí 3’OH, khi gặp các nucleotide không có nhóm 3’OH , phản ứng bị dừng lại

-Nhân tố kết thúc đặc hiệu được sử dụng là các dideoxynucleotide( phương pháp

dideoxynucleotide)

Quy trình dideoxynucleotide để giải trình tự AND

Dideoxynucleotide là một phân tử nhân tạo, nó thiếu nhóm OH ở cả 2 vị trí 2’ và 3’ carbon của phân tử đường Nếu một dideoxynucleotide được gắn vào đầu chuỗi đang tổng hop, sự tổng hop AND sẽ dừng lại do không hình thành liên kết photphodieste với nucleotide đến tiếp theo Việc kết thúc tổng hợp AND là tính chất hoàn hảo của phương pháp giải trình tự AND

dideoxynucleotide , mặc dù các điều kiện thí nghiệm khác cần phải được thỏa mãn trước khi mộttrình tự AND có thể được xác định

Bước đầu tiên theo nguyên tắc là Ủ ghép một nucleotide tổng hợp ( 17-24nu: mồi) với một phân đoạn đã xác định một sợi của vector nhân dòng gần vị trí chèn của AND nhân dòng

Oligonucleotide hoạt động như một trình tự mồi bằng cách cung cấp một nhóm 3’OH cho sự khởi đầu tổng hợp AND

Mỗi ống chứa 4 deoxynucleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) , một trong 4 deoxynucleotide nàyđược đánh dấu phóng xạ và một trong bốn dideoxynucleotide(ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP).Nồng độ của mỗi dideoxynucleotide trong mỗi ống nghiệm được điều chỉnh thận trọng để đảm bảo sự gắn hỗn hop các chuỗi đang tổng hợp tại mỗi vị trí có thể và không gắn ở vị trí đầu tiên của nucleotide bổ trợ của khuôn Sự tổng hợp của chuỗi sẽ dừng lại khi một dideoxynucleotide được gắn vào, như vậy mỗi chuỗi đang tổng hop sẽ thật sự chứa một dideoxynucleotide ở đầu 3’.Điều kiện thí nghiệm này xảy ra trong cả 4 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm chứa một bộ duy nhất các oligonucleotide, mỗi một trong chúng chứa trình tự mồi

Các phản ứng tổng hợp bị dừng lại bằng cách bổ sung formamit , ngăn không cho các sơi AND bắt cặp bazo với nhau, và các phân tử AND mới tổng hợp được tách nhau bằng điện di trên gel polyacryamit Phương pháp này phân giải các đoạn AND khác biệt nhau về kích thước ít nhất một nucleotide đơn Phép tự chụp ảnh bằng phóng xạ của gel cho thấy chỉ các đoạn AND được đánh dấu phóng xạ được tổng hop trong bước tổng hop AND có enzyme xúc tác Mỗi một trong bốn làn trên gel và ảnh tự chụp bằng phóng xạ tương ứng với một ống nghiệm có chưa một trong

Ví dụ: Lấy ví dụ mà Thầy đã cho vào