Giới thiệu một số kỹ thuật di truyền, nguyên lý và ứng dụng. Cách tạo ra cây trồng chuyển gen, một số hướng phát triển nông nghiệp hiện nay.Enzym giới hạn được Werner Arber tìm thấy ở vi khuẩn vào năm 1962.Ông cho rằng các RE có khả năng rất đặc biệt đó là khả năng nhận biết DNA chủ và DNA lạ. Enzim này hạn chế sự nhân lên của DNA lạ khi chúng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn bằng cách cắt chúng ra thành từng đoạn một cách đặc hiệu, vì thế ông gọi là restriction có nghĩa là hạn chế. Với phát minh này ông cùng các cộng sự (Daniel Nathans và Hamilton O. Smith) đã giành giải thưởng Nobel vào năm 1978.Khái niệm: RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) là kỹ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài của các phân đoạn DNA dựa trên điểm cắt các enzim giới hạn (Restriction Enzyme, RE).Nguyên tắc chung: dựa trên độ đặc hiệu của các enzim cắt giới hạn (restriction enzimRE) đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gen. Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau.1.4. PCR: Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp – phản ứng khuếch đại gen).Khái niệm: Phản ứng chuỗi trùng hợp là quá trình nhân (khuếch đại) một đoạn DNA đặc hiệu dưới sự xúc tác của enzyme DNA – polymerase chịu nhiệt độ cao (Taq polymerase), diễn ra theo chu kỳ nhiệt lặp lại liên tục.Giới thiệu chung: Được nhà khoa học người Mỹ – Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 tại công ty Cetus. Kỹ thuật này được thực hiện in vitro trong một ống nghiệm plastic nhỏ, được ứng dụng nhanh và có ý nghĩa cách mạng đối với sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA NÔNG HỌC BÁO CÁO MÔN DI TRUYỀN THỰC VẬT Chủ đề 9: KỸ THUẬT DI TRUYỀN – NGUYÊN LÝ VÀ ỨNG DỤNG GVHD: ThS Hồ Tấn Quốc 5/23/20 DANH SÁCH NHÓM Đào Thị Thanh Ngân Nguyễn Lê Hồi Thương Đỗ Hữu Tính 5/23/20 18113094 18113164 18113172 NỘI DUNG CHÍNH MỘT SỐ KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG CƠNG NGHỆ DI TRUYỀN • Enzyme giới hạn • Kỹ thuật RFLP • PCR CHUYỂN NẠP GEN Ở THỰC VẬT • • • • • • Mục đích tạo chuyển gen Những bước trình thực chuyển gen Thu nhận gen Tạo vector chuyển gene Phương pháp chuyển nạp gene thực vật Ứng dụng chiến lược phát triển • 5/23/20 I MỘT SỐ KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN 1.1 KHÁI NIỆM KỸ THUẬT DI TRUYỀN Kỹ thuật di truyền kỹ thuật tái tổ hợp DNA (Recombinant DNA technology) hệ thống kỹ thuật nhằm kết hợp hay vài gen loài vào gen loài khác chuyển DNA tái tổ hợp đến nơi tái biểu 5/23/20 I MỘT SỐ KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN 1.2 ENZYME GIỚI HẠN Khái niệm: enzym đặc biệt nằm bên tế bào vi khuẩn có khả nhận biết DNA “lạ” phage (thể thực khuẩn) thâm nhập vào làm phân hủy chúng làm hạn chế sinh sản phage Hình 1.1: Một phản ứng có tham gia RE 5/23/20 I MỘT SỐ KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN 1.2 ENZYME GIỚI HẠN Lịch sử: Enzyme giới hạn Werner Arber tìm thấy vi khuẩn vào năm 1962 Ơng cho RE có khả đặc biệt khả nhận biết DNA chủ DNA lạ 5/23/20 Hình 1.2: Werner, Daniel Nathans Hamilton O Smith I MỘT SỐ KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN 1.2 ENZYME GIỚI HẠN Tính chất: • Chỉ cắt DNA lạ xâm nhập vào tế bào vi khuẩn mà không cắt DNA • Các enzyme nhận biết nucleotit đặc hiệu phân tử DNA cắt vị trí 5/23/20 I MỘT SỐ KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN 1.3 RFLP Khái niệm: RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) kỹ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài phân đoạn DNA dựa điểm cắt enzyme giới hạn (Restriction Enzyme, RE) Nguyên tắc chung: dựa độ đặc hiệu enzyme cắt giới hạn (đối với vị trí nhận biết chúng DNA gen) Sự khác biệt vị trí cắt hai cá thể tạo phân đoạn cắt khác 5/23/20 I MỘT SỐ KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN 1.3 RFLP Hình 1.2: Phân tích RFLP cách lấy mẫu DNA từ vết máu 5/23/20 I MỘT SỐ KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN 1.3 RFLP Ưu điểm Khuyết điểm RFLP có ưu điểm marker đồng trội Qui trình thực phức tạp, nguy cho phép phân biệt cá thể đồng hiểm sức khoẻ người nghiên hợp dị hợp cứu (sử dụng phóng xạ đánh dấu) Do kích thước DNA khảo sát DNA yêu cầu có chất lượng cao RFLP lớn số lượng dấu phân làm hạn chế việc sử dụng kỹ thuật tử (marker) tạo nhiều đủ đáp ứng Hiện nay, nước ta chưa cho phép nhu cầu nghiên cứu nhập chất phóng xạ 5/23/20 10 II CHUYỂN NẠP GEN Ở THỰC VẬT 2.5 Tạo vector chuyển gen: 2.5.1 Vector chuyển gen plasmid: Hình 2.3: Cấu tạo plasmid pBR322 5/23/20 26 II CHUYỂN NẠP GEN Ở THỰC VẬT 2.5 Tạo vector chuyển gen: 2.5.2 Vector chuyển gen phage λ Những ưu điểm việc sử dụng vector phage so với vector plasmid: ◦ Dễ xâm nhập vào vi khuẩn ◦ Khả nhân lên nhanh tế bào chủ ◦ Khả tiếp nhận đoạn DNA lạ lớn plasmid Tuy nhiên có vài bất lợi: ◦ Thao tác ghép DNA lạ phức tạp ◦ DNA tái tổ hợp không tạo thành khuẩn lạc DNA tái tổ hợp plasmid, mà thành đĩa phân giải xuất mặt thạch phủ đầy vi khuẩn 5/23/20 27 II CHUYỂN NẠP GEN Ở THỰC VẬT 2.5 Tạo vector chuyển gen: 2.5.3 Các vector chuyển gen loại khác Prokaryotes: Cosmid: cấu tạo nên từ plasmid có gắn thêm gen cos phage λ Phage M13: dùng làm vector nhằm: ◦ Xác định trình tự nucleotide ◦ Sản xuất mẫu thử (dò) DNA ◦ Thực đột biết điểm định hướng Phagemid: cấu tạo từ plasmid gắn thêm đoạn DNA phage M13 5/23/20 28 II CHUYỂN NẠP GEN Ở THỰC VẬT Hình 2.4: Sơ đồ nhân DNA cosmid 5/23/20 Hình 2.5: Phage M13 29 II CHUYỂN NẠP GEN Ở THỰC VẬT 2.5 Tạo vector chuyển gen: 2.5.4 Tạo plasmid tái tổ hợp: Khái niệm: nối đoạn DNA vào vector chuyển gen để tạo plasmid có mang DNA lạ gọi plasmid tái tổ hợp (recombinant plasmid) Phản ứng nối thực enzyme DNA ligase Các phương pháp tạo plasmid tái tổ hợp: ◦ Phương pháp dùng đầu cố kết (đầu dính) ◦ Phương pháp dùng đoạn nối (linkers) ◦ Phương pháp dùng enzyme terminal transferase 5/23/20 30 II CHUYỂN NẠP GEN Ở THỰC VẬT 2.5 Tạo vector chuyển gen: 2.5.4 Tạo plasmid tái tổ hợp: Phương pháp dùng đầu cố kết (đầu dính): Hình 2.6: Tạo plasmid tái tổ hợp phương pháp dung đầu dính 5/23/20 31 II CHUYỂN NẠP GEN Ở THỰC VẬT 2.5 Tạo vector chuyển gen: 2.5.4 Tạo plasmid tái tổ hợp: Phương pháp dùng đoạn nối (linkers): Hình 2.7: Tạo plasmid tái tổ hợp phương pháp linkers 5/23/20 32 TẠO CÁC VECTOR CHUYỂN GEN 2.5 Tạo vector chuyển gen: Phương pháp dựa vào khả đặc biệt enzyme terminal transferase gắn loại nucleotide thành chuỗi (homopolymer) vào đầu 3’-OH mạch DNA 2.5.4 Tạo plasmid tái tổ hợp: Phương pháp dùng enzyme terminal transferase 5/23/20 / -GGGGG3’ 3’CCCCC - 33 II CHUYỂN NẠP GEN Ở THỰC VẬT 2.6 Phương pháp chuyển nạp gen thực vật: •Sử dụng vector chuyển gen plasmid Ti •Sử dụng vector chuyển gen virus •Chuyển gen trực tiếp vi bắn phương pháp chích điện •Chuyển nạp gen PEG ( poly - ethyleneglycol) 5/23/20 34 II CHUYỂN NẠP GEN Ở THỰC VẬT 2.7 Ứng dụng: •Tạo giống kháng sâu, bệnh hại (kháng virus, kháng sâu) •Tạo giống kháng thuốc trừ cỏ •Kháng nấm bệnh •Kháng vi khuẩn gây bệnh… 5/23/20 35 II CHUYỂN NẠP GEN Ở THỰC VẬT Hình 2.8: Giống ngơ kháng sâu 5/23/20 Hình 2.9: Cà chua kháng vật kí sinh 36 II CHUYỂN NẠP GEN Ở THỰC VẬT 2.8 Một số chiến lược cải tiến trồng: Cải tiến chất lượng thực phẩm Biến đổi màu • Sử dụng CRISPR CRISPR/Cas để chỉnh sửa sắc hoa theo ý gen, thay đổi màu sắc hoa muốn Sản xuất hợp chất quý 5/23/20 • Tạo giống khoai tây chứa amylose • Cải tiến protein thực vật, loại bỏ chất độc hại • Tạo giống thuốc có gen sản xuất kháng thể từ chuột • Tạo giống thuốc chuyển gen sản xuất chất dẻo PHB… 37 II CHUYỂN NẠP GEN Ở THỰC VẬT Hình 2.10: Hoa bìm bịp 5/23/20 Hình 2.11: Giống lúa chịu mặn 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO https://bitly.com.vn/TdPNy https://voer.edu.vn/m/cong-nghe-chuyen-gen-o-thuc-vat/2975250e http://bimetech.vn/cac-loai-taq-polymerase.html https://voer.edu.vn/m/vector-chuyen-gen/7d602ed9 https://bitly.com.vn/gjXFJ https://bitly.com.vn/rTiTT http ://iasvn.org/homepage/Su-dung-ky-thuat-CRISPR-de-thay-doi-mau -sac-hoa-10126.html 5/23/20 39 5/23/20 40 ... Phương pháp chuyển nạp gene thực vật Ứng dụng chiến lược phát triển • 5/23/20 I MỘT SỐ KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN 1.1 KHÁI NIỆM KỸ THUẬT DI TRUYỀN Kỹ thuật di truyền kỹ thuật tái tổ... 5/23/20 10 I MỘT SỐ KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN 1.3 RFLP Định vị gen chịu trách nhiệm cho rối loạn di truyền Lập sơ đồ di truyền (bản đồ hệ gen) Ứng dụng Xác định nguy mang bệnh... phân tử kỹ thuật di truyền 5/23/20 12 I MỘT SỐ KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG CƠNG NGHỆ DI TRUYỀN Hình 1.3: Máy real – time PCR 5/23/20 13 I MỘT SỐ KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN 1.4 PCR: