chuyển gen và các phương pháp chuyển gen ở thực vật

KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬTKHÁI NIỆM CHUNG MỤC ĐÍCH BIẾN NẠP GEN Ở THỰC VẬT CÁC PHƯƠNG PHÁP BIẾN NẠP GEN Ở THỰC VẬT XU HƯỚNG ÁP DỤNG VÀ MỘT SỐ THÀNH TỰU

Trang 1

CHUYỂN GEN

VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN

Ở THỰC VẬT

Trang 2

KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT

KHÁI NIỆM CHUNG

MỤC ĐÍCH BIẾN NẠP GEN Ở THỰC VẬT

CÁC PHƯƠNG PHÁP BIẾN NẠP GEN Ở THỰC VẬT

XU HƯỚNG ÁP DỤNG VÀ MỘT SỐ THÀNH TỰU BIẾN NẠP GEN Ở THỰC VẬT

CÁC ĐẶC ĐIỂM ƯU VIỆT CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP BIẾN NẠP GEN SO VỚI CÁC PHƯƠNG PHÁP TẠO GIỐNG TRUYỀN THỐNG

Trang 3

Kỹ thuật di truyền

Là kỹ thuật chuyển gen để tạo

ra giống cây trồng, vật nuôi

hay vi sinh vật như ý muốn của con người

Trang 4

Một phân đoạn ADN trên nhiễm sắc thể chịu trách nhiệm về một đặc tính

của sinh vật

Gene

Trang 5

Khái niệm chung

Gen là gì?

Gen là một đơn vị của vật chất di truyền Bản thân nó

hoặc kết hợp với các gen khác quy định một tính trạng của cơ thể.

Về mặt phân tử, một gen là một đoạn ADN (ở một số

virút là ARN) mã hoá hoặc trực tiếp hoặc tham gia vào việc tổng hợp nên một phân tử protein, hay trong một số trường hợp là các phân tử ARN ribosom (rARN), hoặc ARN vận chuyển (tARN), hoặc một số các phân tử ARN cấu trúc khác.

Gen (ADN) -> ARN -> Protein -> Tính trạng

Trang 6

Biến nạp gen (chuyển gen / kỹ thuật di truyền)

ở thực vật là khái niệm dùng mô tả quá trình

chuyển một hoặc một số gen ngoại lai vào trong

tế bào thực vật nhằm tạo ra một tính trạng mới

mà trước đó cơ thể thực vật đó không có.

Khái niệm chung

Nguồn gốc của gen biến nạp

Quá trình biến nạp gen được coi là thành công khi

gen biến nạp sau quá trình chuyển gen kết hợp ổn

định với ADN của hệ gen nhân của tế bào biến nạp

Tế bào biến nạp này sau đó được tái sinh thành cây

hoàn chỉnh với sự biểu hiện của gen biến nạp, và duy

trì ổn định trong các thế hệ sau nhờ quá trình thụ

tinh bình thường

Trang 7

MỤC ĐÍCH BIẾN NẠP GEN Ở THỰC VẬT

1 Nghiên cứu và làm sáng tỏ chức năng của một gen được quan tâm hay

từng phần của gen đó

2 Làm thay đổi mức độ biểu hiện của một gen nội bào

3 Chuyển các gen quy định các tính trạng mong muốn vào tế bào để thu

nhận được các tính trạng mới ở tế bào và cây chuyển gen.

Trong đó, các gen quy định các tính trạng mong muốn được quan tâm

nghiên cứu nhiều hơn cả, gồm:

+ Các gen kháng bệnh (virus, nấm, vi khuẩn, sâu bệnh, giun tròn…)

+ Gen chịu hạn, lạnh, và các diều kiện bất lợi khác của môi trường

+ Gen kháng thuốc diệt cỏ

+ Gen cải tạo các đặc tính về chất lượng (thay đổi thành phần axít béo, tăng cường thành phần axít không no, tăng cường thành phần các axít amin không thay thế, gen chín chậm, v.v…)

Trang 8

QUÁ TRÌNH BIẾN NẠP GEN Ở THỰC VẬT ĐƯỢC THỰC HIỆN NHƯ THẾ NÀO?

Giai đoạn 1 Giai đoạn chuyển gen (giai đoạn biến nạp)

Trong giai đoạn này, gen mong muốn thường được chuyển vào tế bào hoặc

mô thực vật

Giai đoạn 2 Giai đoạn tái sinh cây

Trong giai đoạn này, các mô tế bào được chuyển gen được chọn lọc ra và cho tái sinh để phát triển thành cây.

Hai giai đoạn biến nạp và tái sinh cùng có ý nghĩa quan trọng và quyết định thành công của một thí nghiệm biến nạp Nếu sự biến nạp xảy ra mà không

có sự tái sinh kèm theo, hoặc sự tái sinh diễn ra mà không kèm theo sự biến nạp thì thí nghiệm biến nạp chưa thành công

Trang 9

CÁC YÊU CẦU CƠ BẢN ĐỐI VỚI HỆ THỐNG TÁI SINH

- Các mẫu tế bào, mô dùng cho quá trình chuyển gen cần phải có khả năng phân chia

in vitro nhanh

- Các mô, tế bào này phải có khả năng tiếp nhận gen mới

- Quy trình tái sinh cây phải có hiệu quả cao, không hoặc ít phụ thuộc vào kiểu gen.

- Cây tái sinh phải có tỷ lệ sống (khi đưa

ra ngoài đất trồng) cao, tần số biến dị

thấp (tối thiểu), và khả năng hữu thụ cao

để có thể sử dụng làm nguồn nguyên liệu

ban đầu để tiếp tục tiến hành chuyển gen

trong điều kiện in-vivo sau này.

- Các phương pháp chuyển gen (biến nạp gen) đều chuyển gen vào các tế bào, hay mô – nói cách khác tế bào và mô là đơn vị tiếp nhận gen mới.

hệ thống tái sinh là điều kiện tiên quyết để thực hiện thành

công biến nạp gen

Trang 10

Các loại mô sử dụng làm hệ thống tái sinh:

► Phải có khả năng tái sinh cao và thuận lợi cho việc chuyển gen.

●Mô sẹo có nguồn gốc

khác nhau.

●Mô lá, thân mầm

● Phôi non,

phôi trưởng thành

Trang 11

VÍ DỤ VỀ PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN CÁC CÂY BIẾN NẠP TỪ CÁC TẾ BÀO KHÁC NHAU

Dạng tế bào / mô đích PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN CÂY BIẾN NẠP

Tế bào hoặc mô nuôi cấy in vitro

(cultured cells / tissues) Thông qua quá trình phát sinh cơ quan (organogenesis), hoặc phát sinh phôi (embryogenesis)

Phôi non (immature embryos), hoặc

các tế bào đang phát sinh cơ quan

(organogenic cells)

Tái sinh cây in vitro từ các dòng tế bào biến nạp

Các tế bào ở phôi non, và mô phân

Hạt phấn có nguồn gốc từ các dòng tế

bào biến nạp được sử dụng cho việc

tạo ra các hạt cây được biến nạp

thông qua quá trình thụ tinh bình

thường

Tạo các cây biến nạp trực tiếp qua con đường thụ tinh với hạt phấn chín (mature pollens) đang phát triển mà ADN của

nó đã được xử lý biến nạp

hạt phấn chín (mature pollens) đang phát triển mà ADN của

nó đã được xử lý biến nạp

Trang 12

GIAI ĐOẠN CHUYỂN GEN

Các véctơ chuyển gen

Các véctơ chuyển gen là các phân tử ADN mang đoạn gen cần biến nạp

Ngoài ra chúng còn có các đoạn ADN có cấu trúc đặc thù nhằm tăng hiệu quả các các quá trình biến nạp giúp quá trình biến nạp có thể thực hiện được

Trang 13

Cấu trúc của

véctơ chuyển gen

1 Có một đoạn ADN khởi động (promoter) Đây là một đoạn ADN có liên quan và cần thiết cho sự khởi đầu phiên mã Nó thường có một vị trí bám cho enzym ARN polymeraza, một điểm khởi đầu phiên mã, và một số vị trí bám khác của các protein điều khiển / điều hoà quá trình phiên mã (CaMV- 35S-promoter, nos-promoter …)

Vùng gắn enzyme giới hạn (MCS)

Gen kháng kháng sinh

Vi khuẩn

Điểm tái bản

Vi khuẩn

Prokaryote Promoter

Gen đượ c bi n n p ế ạ

Eukaryote Promoter

Vùng 3’ chứa tín hiệu polyadenine hoá

Gen chỉ thị chọn lọc

Eukaryote Promoter 3’- PolyA

SƠ ĐỒ CHUNG CHO VÉCTƠ CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT

ATG TAG

Trang 14

Cấu trúc của véctơ

chuyển gen Vùng gắn enzyme giới hạn (MCS)

Vi khuẩn

ATG TAG

2 Có một đoạn ADN kết thúc (terminator) Đây là đoạn ADN cần thiết cho

sự kết thúc của quá trình phiên mã và giải phóng phân tử mARN khỏi sợi khuôn ADN Đoạn kết này thường có một trật tự tín hiệu polyadenin, như AATTAA hoặc AACCAA, giúp cho phân tử mARN bền vững hơn

Trang 15

4 Một đoạn ADN chứa các trật tự nucleotid đặc trưng cho sự nhận biết của các enzyme giới hạn, thường ký hiệu là MCS (multi-cloning sites) Nhờ đoạn ADN người ta có thể dùng enzym giới hạn đặc hiệu để cắt và tái tổ hợp phân tử ADN của véctơ với đoạn ADN mang gen cần biến nạp

3 Một đoạn ADN chịu

trách nhiệm cho quá trình

tái bản (replication; Điểm

tái bản) thường có nguồn

gốc vi khuẩn, như ColE1

chuyển gen

Vi khuẩn

ATG TAG

Trang 16

5 Các gen chọn lọc (selectable marker genes) và gen chỉ thị (reporter genes) Các gen này thường tổng hợp nên các phân tử protein giúp phân biệt các tế bào đã được biến nạp khỏi các tế bào không được biến nạp (gen chọn lọc), hoặc ghi nhận sự hoạt động của gen biến nạp (gen chỉ thị)

chuyển gen

Vi khuẩn

ATG TAG

Trang 17

Các gen chọn lọc thường có tính trội, thông thường có nguồn gốc từ vi

khuẩn nhưng hoạt động của chúng được kiểm soát bởi các promoter kiểu Eukaryote

Các gen chọn lọc phổ biến gồm:

۞

۞ Các gen kháng kháng sinh như kanamycin (neomycin

phosphotransferase- nptII ), hygromycin (hygromycin

phosphostransferase-hpt ), streptomycin (streptomycin phosphotransferaza),

۞ Các gen kháng chất diệt cỏ, như glyphosate hoặc bialaphos

(phosphinothricin, BASTA): gen bar có nguồn gốc vi khuẩn mã hoá cho

enzyme làm bất hoạt BASTA là phosphinothricin acetyltransferaza (PAT).

۞ Các gen khác (gen pmi – phosphate manose isomerase- chuyển hoá manose thành glucose Nhờ vậy, cây có thể sống trên môi trường không có glucose (manose là nhân tố chọn lọc)

GIỚI THIỆU VỀ GEN CHỌN LỌC (selectable marker gene)

Trang 19

GEN CHỈ THỊ (reporter gene)

♣ Các gen gen chỉ thị là các gen có trách nhiệm thông báo là gen cần biến nạp đã gắn vào hệ gen thực vật và bắt đầu hoạt động hay chưa

+ Protein phát huỳnh quang xanh lục GFP *

(green fluorescence protein) và các dẫn xuất của nó.

+ Protein chuyển trạng thái năng lượng cộng hưởng phát huỳnh quang FRET (fluorescent resonance energy transfer)

Trang 20

Lactose Galactose + Glucose β - galactosidase

β-D-glucuronide + H2O Axit glucuronic + Glucose β - glucuronidase

Trang 21

Sử dụng gen chỉ thị gus

Vector chuyển gen

NGUYÊN TẮC

Sự biểu hiện

của gen gus ở

mô hoa, mô lá

và phôi ngô non được chuyển gen

Trang 22

Sử dụng gen chỉ thị Luciferase Nguyên tắc

Luciferase là một loại protein

Trang 23

Sử dụng gen chỉ thị Luciferase

Trang 24

Sử dụng gen chỉ thị GFP (green fluorescene protein)

GFP là một loại protein có

trọng lượng 32 kDa phát ra

ánh sáng ở bước sóng 509 nm

(màu xanh lục sáng).

Là gen được phát hiện và

tách ra từ loài sứa Aequorea

victoria.

Trang 25

Sử dụng gen chỉ thị GFP (green fluorescene protein)

Ở thực vật

Ở CHUỘT THÍ NGHIỆM

Trang 26

CÁC VÉCTƠ MANG GEN BIẾN NẠP ĐƯỢC CHUYỂN VÀO TẾ BÀO

THỰC VẬT NHƯ THẾ NÀO?

1 Phương pháp chuyển gen gián tiếp

- Thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens / A rhizogens

2 Các phương pháp chuyển gen trực tiếp

- Phương pháp dùng súng bắn gen (particle inflow gun /

bombardment)

- Phương pháp chuyển gen nhờ xung điện (electroporation)

- Phương pháp chuyển gen nhờ PEG (polyethylene glycol)

- Phương pháp vi tiêm (microinjection)

Trang 27

Các bước thực hiện phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium

1 Thiết kế véctơ mang gen biến nạp

2 Nhân (tách dòng – cloning) véctơ nhờ vi khuẩn E coli

3 Chuyển véctơ mang gen biến nạp từ vi khuẩn E coli sang Agrobacterium

4 Lây nhiễm Agrobacterium mang véctơ chứa gen biến nạp với tế bào / mô thực vật để tiến hành quá trình chuyển gen biến nạp sang mô / tế bào đích

5 Chọn lọc các tế bào / mô đã được biến nạp thành công

6 Tái sinh mô / tế bào đã được biến nạp thành công thành cây biến nạp

hoàn chỉnh (và đánh giá sự biểu hiện của gen biến nạp)

Trang 28

Phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium

- Vi khuẩn A tumefaciens không sản xuất được một số acid

amin như octopin, nopaline

Để tồn tại, nó chuyển gen của nó vào thực vật, thực vật sản

xuất các chất cần thiết, vi khuẩn phân huỷ các chất này để

lấy năng lượng.

Trong quá trinh cộng sinh này, vi khuẩn cũng chuyển các

gen tổng hợp các chất kích thích sinh trưởng làm các tế bào

nhiễm vi khuẩn phân chia vô tổ chức, gây phát sinh khối u

ở thực vật

Vi khuẩn A tumefaciens và hiện tượng khối u ở thực vật

Bản chất phân tử của quá trình phát sinh khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens gây

ra ở thực vật: trong quá trình nhiễm khuẩn ở vùng tế bào bị thương của cây các tế bào bị

thương tiết ra hợp chất thu hút các tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens Các tế bào vi

khuẩn không thâm nhập vào tế bào thực vật mà chỉ chuyển nạp vào chúng một loại plasmid

đặc hiệu gây nên tình trạng khối u - Đó là plasmid Ti (tumor inducing).

Ti plasmid mang các gen tổng hợp IAA, các amino acide như octopine hay nopalin để giúp cho vi khuẩn phát triển

Con người lợi dụng tính chất này của Agrgobacterium để chuyển gen vào tế bào thực vật

Trang 30

Giới thiệu về vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

A tumefaciens

Ti plasmid T-ADN nhân VK Hệ gen

Sự lây nhiễm tế bào thực vật

và truyền T-ADN

ADN nhân TBTV

T-ADN

Có 3 nhân tố liên quan đến sự tạo khối u của Ti-plasmid

+ T-DNA được chuyển vào tế bào chủ ở dạng một nhân tố di động

+ Các gen vùng vir (virulence) là nơi có các gen sản xuất các protein cần cho

sự biến dạng tế bào thực vật để Ti-plasmid có thể thâm nhập.

+ Các gen khác có trong nhiễm sắc thể của Agrobacterrium chịu trách nhiệm

liên kết tế bào vi khuẩn với mô thực vật

Trang 31

Cấu trúc của Ti-plasmid và T-ADN

A tumefaciens

Ti plasmid

ADN nhân VK

Vùng gây khối u (Onc)

T-ADN Vùng phân giải nopaline

Vùng tái bản

Vùng tiếp hợp plasmid

Vùng gây độc vir

Ti plasmid là một phân tử ADN vòng tương đối lớn, gồm 150.000-200.000 cặp nucleotit Tuy

nhiên chỉ có một đoạn gồm 20.000-30.000 cặp nucleotit có khả năng thâm nhập vào bộ genom của

tế bào chủ, đó là đoạn T-ADN T-ADN có chứa các gen gây ra sự sinh trưởng vô điều khiển của các tế bào thực vật đó là các gen mã hoá auxin và cytokinin gây ra sự sinh sản vô tổ chức của tế bào bị nhiễm.

Những enzym chịu trách nhiệm chuyển nạp đoạn T-ADN từ plasmid vào trong genom của tế bào

chủ được mã hoá bởi các đoạn vir (virulence)

Trang 32

Cấu trúc của Ti-plasmid và T-ADN

Vùng gây khối u (Onc)

Các Ti - plasmid cải biên được cắt bỏ các đoạn gen gây phát triển khối u, chỉ để lại đoạn vir và phần T-ADN tối thiểu mang điểm ghép gen Loại vector này đang được

sử dụng rất hiệu quả cho việc đưa ADN lạ vào tế bào thực vật ở cả các loài cây một

và hai lá mầm.

Người ta đưa gen cần chuyển vào Ti plasmid, sau đó đưa vào Agrobacterium

Dùng agrobacterium lây nhiễm mô thực vật Theo đặc tính của mình, vi khuẩn

chuyển các gen vào tế bào thực vật

Như vậy việc chuyển gen đã được hoàn thành

Nhiệm vụ của người thực nghiệm là tái sinh tế bào hay mô thành cây, sau đó kiểm tra sự có mặt của gen chuyển ở cây tái sinh

Trang 33

Đầu tiên, là sự hình thành một vết đứt (nick) tại vị trí vùng biên phải RB của đoạn ADN Đoạn gen này sau đó được tách ra khỏi plasmid nhờ sự hình thành một đoạn đứt thứ hai Đoạn đứt này thường không cố định đối với các plasmid khác nhau Trong khi các axít nucleic trống tạo ra trên plasmid được lấp đầy theo nguyên tắc bổ trợ của các axít nucleic thì đoạn T-ADN được tách ra được bám bởi một protein bám sợi đơn (SSBP - single strand binding protein) Nhờ phức hợp với SSBP này mà đoạn gen T-ADN được chuyển vào nhiễm sắc thể cây chủ theo một cơ chế đến nay chưa biết rõ

T-Ti plasmid Vùng Vir

T-ADN

SSPB

Chuyển vào tế bào thực vật

Sự kết hợp của gen biến nạp với gen nhân thực vật

Quá trình chuyển T-ADN vào tế bào thực vật

Trang 34

Thiết kế véctơ Ti plasmid mang gen biến nạp

Phương pháp biến nạp nhờ vi khuẩn

Phương pháp biến nạp nhờ vi khuẩn Agrobacterium

ADN nhân VK

Enzym

Tế bào cho gen biến nạp

Hệ ADN gen nhân

mang gen

biến nạp

Gen biến nạp

Plasmid trống (đã được loại

bỏ các gen gây khối u - Onc)

Ti plasmid mang gen biến nạp

Trang 35

Quá trình chuyển gen vào tế bào thực vật và tái sinh cây

Ti plasmid mang gen biến nạp

Tế bào thực vật

ADN nhân

Gen chuyển nạp

QUÁ TRÌNH BIẾN NẠP

Tế bào mang gen chuyển nạp phân chia

Cây chuyển gen

Trang 36

1 Số bản sao của gen biến nạp được

chuyển vào tế bào thực vật thấp Do vậy,

giảm tối thiểu sự không biểu hiện của gen

được chuyển, tăng khả năng chuyển gen

bền vững, hiệu quả chuyển gen cao.

2 Tránh được sự hình thành của các cây

chuyển gen khảm.

3 Kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện

4 Không đòi hỏi thiết bị đắt tiền

Nhược điểm

Ưu điểm

Phương pháp này được sử dụng thành công ở nhiều cây hai lá mầm Nhưng hiệu quả chuyển gen ở các cây một lá mầm còn thấp

Trong khi nhiều cây một lá mầm là những cây lương thực quan trọng như lúa, ngô, lúa mỳ

Trang 37

Phương pháp biến nạp gen bằng súng bắn gen

LUỒNG KHÍ

Màng nổ Màng mang

Hạt mang ADN Màng dừng Buồng chân không

Mô th c v t ự ậ Môi trường nuôi cấy

mô TV

Trang 38

Vacuum chamber

Trang 39

Nhược điểm

Ưu điểm

1 Có thể áp dụng với hầu hết các loại mô, tế bào.

Quá trình chuyển gen nhanh, đơn giản về mặt kỹ

thuật.

2 Có thể xử lý một lượng mẫu lớn trong thời gian

ngắn.

3 Các véctơ mang gen tái tổ hợp có cấu tạo đơn

giản Không đòi hỏi cấu trúc gen kiểu T-ADN như

trường hợp chuyển gen bằng Agrobacterium.

4 Chỉ cần một lượng nhỏ plasmid ADN.

5 Biểu hiện tạm thời của gen biến nạp có thể quan

sát thấy trong vòng vài ngày sau biến nạp

1 Nhiều bản sao của gen biến nạp

có thể được chuyển vào tế bào cùng lúc, gây khó khăn cho việc phân tích biểu hiện của gen, dẫn đến sự biểu hiện của các gen không bền vững.

2 Hiệu quả chuyển gen thấp.

3 Đòi hỏi thiết bị đắt tiền (không phải PTN nào cũng có thể đầu tư) Chi phí vật tư đắt (hạt vàng,

volfram, )

Trang 40

Phương pháp biến nạp gen bằng xung điện

Phương pháp chuyển gen nhờ xung điện thường được sử

dụng cho việc chuyển gen vào các tế bào trần

(protoplast)

Tế bào trần là tế bào đã được loại bỏ thành tế bào bằng

việc xử lý với các enzym (cellulase, pectinase) để thu

được cấu trúc tế bào chỉ còn chất nguyên sinh và màng

nguyên sinh chất

Người ta thường sử dụng dòng điện có hiệu điện thế cao

phát xung trong thời gian cực ngắn (khoảng 5 - 6/1000

giây) để tạo ra trên bề mặt tế bào trần tạm thời các lỗ có

đường kính khoảng 30 ηm, mà qua đó các ADN biến

nạp có thể thâm nhập vào tế bào

Tế bào thực vật có vỏ xenlulo giữ cho tế bào có hình

Định dạng
Số trang	82
Dung lượng	21,37 MB