Nghiên cứu quy trình sản xuất trà túi lọc từ lá Gai (Boehmeria nivea).

Matsuura et at., 1973 công b các ch t axit boehnic, axit palmatic, axit stearic, axit ursolic, acid 19 -hydroxyursolic, -sitosterol, -sitosteryl- -D-glucoside, vv[14]... Nhi u lo i enzym

Tp H Chí Minh, Tháng 06 n m 2014

L I C M N

Trên th c t không có s thành công nào mà không g n li n v i nh ng s

h tr , giúp đ c a ng i khác Trong su t th i gian t khi h c t p gi ng

đ ng đ i h c cho đ n nay, em đã nh n đ c r t nhi u s quan tâm, giúp đ c a quý Th y Cô, gia đình và b n bè

hoàn thành đ tài th c t p t t nghi p này, l i đ u tiên em xin g i l i

c m n chân thành đ n t t c các th y, cô giáo khoa công ngh sinh h c tr ng

đ i h c M Tp.HCM đã d y b o và trang b cho em nh ng ki n th c b ích làm

n n t ng cho em th c hi n đ tài

Em xin bày t lòng bi t n sâu s c nh t t i th y Th.S T ng Khoa,

ng i đã t n tình h ng d n, ch b o em trong su t th i gian th c t p

Và nhân d p này em xin g i l i c m n đ n ba m ng i đã sinh thành

d ng d c và nuôi d y em nên ng i đ em có đ c ngày hôm nay

Cu i cùng em xin c m n gia đình và b n bè nh ng ng i đã h tr , c v

đ ng viên em th c hi n đ tài th c t p t t nghi p này

Em xin chân thành c m n !

M C L C

DANH M C HÌNH v

DANH M C B NG vii

T V N 1

PH N 1: T NG QUAN TÀI LI U 4

1.1 Tình hình s n su t và tiêu th trà túi l c 5

1.2 T ng quan nguyên li u 6

1.2.1 Lá gai (Boehmeria nivea) 6

1.2.1.1 c đi m th c v t 7

1.2.1.2 Thành ph n hóa h c 9

1.2.1.3 Tác d ng d c lý 10

1.2.2 C ng t (Stevia rebaudiana) 11

1.2.2.1 c đi m th c v t 11

1.2.2.2 Thành ph n hóa h c 13

1.2.2.3 Ho t ch t sinh h c 14

1.2.2.4 Tác d ng d c lý 15

1.3 Quá trình ch ng oxy hóa 15

1.3.1 G c t do 15

1.3.2 C ch ch ng oxy hóa 17

1.3.3 Ch t ch ng oxy hóa 19

1.3.4 Các ph ng pháp xác đ nh ho t tính ch ng oxy hóa 24

1.3.4.1 Ph ng pháp TEAC 25

1.3.4.2 Ph ng pháp DPPH 25

1.3.4.3 Ph ng pháp ORAC 25

1.3.4.4 Ph ng pháp TRAC 26

1.3.4.5 Ph ng pháp FRAP 26

1.4 Quá trình kháng khu n 26

1.4.1 Tính ch t 26

1.4.2 Các ph ng pháp th ho t tính kháng khu n 27

1.4.2.1 Ph ng pháp s d ng ch t n n bán r n 27

1.4.2.2 Ph ng pháp s d ng ch t n n l ng 28

1.4.2.3 Thin-Layer Chromatography (TLC)–Bioautography (S c kí l p m ng) 29

1.5 Các ph ng pháp s d ng 29

1.5.1 Ph ng pháp trích ly 29

1.5.1.1 Các ph ng pháp trích ly 29

1.5.1.2 Các dung môi trích ly 30

1.5.1.3 Các y u t nh h ng quá trình trích ly 31

1.5.2 Ph ng pháp s y 32

PH N 2: V T LI U VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN C U 34

2.1 V t li u nghiên c u 35

2.1.1 a đi m thí nghi m 35

2.1.2 i t ng thí nghi m 35

2.1.3 D ng c - thi t b 35

2.1.4 Các ph ng pháp phân tích 36

2.2 Ph ng pháp nghiên c u 37

2.2.1 Quy trình s n xu t d ki n 37

2.2.2 Thuy t minh quy trình 37

2.2.2.1 Chu n b nguyên li u 37

2.2.2.2 R a s ch 38

2.2.2.3 S y khô 38

2.2.2.4 Xay 38

2.2.2.5 Ph i tr n 38

2.2.2.6 Sao 38

2.2.2.7 óng gói 39

2.2.3 S đ nghiên c u 39

2.2.4 B trí thí nghi m 41

2.2.4.1 Thí nghi m 1: Kh o sát nguyên li u ban đ u 41

2.2.4.2 Thí nghi m 2: Kh o sát các đ c tính sinh h c đ c tr ng c a nguyên li u 41

2.2.4.3 Thí nghi m 3: Nghiên c u t l ph i tr n trà lá gai, c ng t đ n ch t l ng c m quan s n ph m cu i 50

2.2.4.4 Thí nghi m 4: Kh o sát nhi t đ và th i gian sao trà đ n ch t l ng c m quan s n ph m cu i 52

2.2.4.5 Thí nghi m 5: Thí nghi m kh o sát nh h ng c a nhi t đ trích ly đ n ch t l ng c m quan s n ph m cu i 55

2.2.4.6 Thí nghi m 6: Thí nghi m kh o sát nh h ng c a th i gian trích ly đ n ch t l ng c m quan s n ph m cu i 56

2.2.4.7 Thí nghi m 7: Thí nghi m đánh giá các ch tiêu ch t l ng s n ph m cu i 58

PH N 3: K T QU THÍ NGHI M 61

3.1 K t qu các thí nghi m 62

3.1.1 Thí nghi m 1: Kh o sát nguyên li u ban đ u 62

3.1.2 Thí nghi m 2: Kh o sát các đ c tính sinh h c đ c tr ng c a

nguyên li u 63

3.1.3 Thí nghi m 3: Nghiên c u t l ph i tr n trà lá gai, c ng t đ n ch t l ng c m quan s n ph m cu i 73

3.1.4 Thí nghi m 4: Thí nghi m kh o sát nh h ng c a nhi t đ và th i gian sao trà đ n ch t l ng c m quan s n ph m cu i 74

3.1.5 Thí nghi m 5: Kh o sát nhi t đ trích ly gói trà thành ph m đ n ch t l ng c m quan s n ph m 77

3.1.6 Thí nghi m 6: Thí nghi m kh o sát nh h ng c a th i gian trích ly đ n ch t l ng c m quan s n ph m cu i 79

3.1.7 Thí nghi m 7: Thí nghi m đánh giá các ch tiêu ch t l ng s n ph m cu i 80

PH N 4: K T LU N VÀ KI N NGH 84

4.1 K t lu n 85

4.2 Ki n ngh 87

TÀI LI U THAM KH O 88

PH L C 90

DANH M C HÌNH

Hình 1.1 Trà túi l c 5

Hình 1.2: Cây lá gai (Boehmeria nivea) 7

Hình 1.3: M t vài loài thu c chi gai 7

Hình 1.4: Thân cây lá gai lúc non, lúc già 8

Hình 1.5: Hoa cây gai (hoa cái, hoa đ c) 9

Hình 1.6: C ng t (Stevia rebaudiana) 11

Hình 1.7: Công th c c u t o m t s h p ch t sinh h c có trong c ng t 15

Hình 1.9: C ch ho t đ ng c a ch t ch ng oxy hóa 18

Hình 1.11: – Tocopherol 21

Hình 1.10: Vitamin C 22

Hình 1.12: Ph n ng c a quercetin v i g c t do superoxid 24

Hình 1.13: Ph n ng trung hòa g c DPPH 25

Hình 2.1: S đ quy trình s n xu t trà túi l c lá gai d ki n 37

Hình 2.2: S đ nghiên c u 40

Hình 2.3: S đ b trí thí nghi m kh o sát n ng đ dung môi trích ly 43

Hình 2.4: S đ b trí thí nghi m kh o sát t l nguyên li u : dung môi trích ly 45

Hình 2.5: S đ b trí thí nghi m kh o sát nhi t đ - th i gian trích ly 47

Hình 2.7: S đ b trí thí nghi m kh o sát nhi t đ và th i gian sao trà 53

Hình 3.1: K t qu xác đ nh ho t ch t sinh h c Flavonoid 62

Hình 3.2: th th hi n nh h ng c a n ng đ dung môi ethanol đ n quá trình trích ly 64

Hình 3.3: th th th hi n nh h ng c a t l nguyên li u – dung môi đ n quá trình trích ly 65

Hình 3.4: th th hi n s nh h ng c a nhi t đ và th i gian đ n quá trình trích ly 68Hình 3.5: K t qu ch ng oxy hóa 69Hình 3.6: M i t ng quan gi a n ng đ và ho t tính ch ng oxy hóa c a cao chi t lá gai và vitamin C 70Hình 3.7: Kh n ng kháng khu n gây b nh c a d ch chi t lá gai 72Hình 3.8: th th hi n đi m c m quan c a các t l ph i tr n s n ph m khác nhau 74Hình 3.9: Hình nh trà lá gai các th i gian sao khác nhau 76Hình 3.10: th bi u hi n s t ng quan gi a nhi t đ và th i gian sao trà đ n đi m

ch t l ng c m quan 76Hình 3.11: nh h ng c a nhi t đ trích ly đ n ch t l ng c m quan c a s n ph m 78Hình 3.11: nh h ng c a th i gian trích ly đ n ch t l ng c m quan c a s n ph m 80Hình 3.12: K t qu đ nh tính trà lá gai và túi trà túi l c lá gai 80Hình 3.13: Hình nh túi trà lá gai và d ch chi t trà lá gai s n ph m cu i 81Hình 4.1: Quy trình s n xu t trà túi l c lá gai hoàn ch nh 86

DANH M C B NG

B ng 2.1: B ng giá tr dinh d ng cây lá gai 10

B ng 2.2: Thành ph n d ch chi t C ng t th hi n qua m u phân tích s c ký l p m ng 13

B ng 2.1: B ng các ph ng pháp phân tích 36

B ng 2.2: Ph ng pháp phân tích các ch tiêu nguyên li u ban đ u 41

B ng 2.3: B ng b trí thí nghi m kh o n ng đ dung môi trích ly 42

B ng 2.4: B ng b trí thí nghi m kh o sát t l nguyên li u : dung môi 44

B ng 2.5: B ng b trí thí nghi m kh o sát nhi t đ - th i gian trích ly 46

B ng 2.6: B trí thí nghi m th ho t tính ch ng oxy hóa c a lá gai 48

B ng 2.7: B ng hàm l ng c ng t ph i tr n 50

B ng 2.8: B ng đi m đánh giá c m quan mùi v s n ph m trà 52

B ng 2.9: B ng b trí thí nghi m nhi t đ , th i gian sao trà 53

B ng 2.10: B ng đi m đánh giá c m quan màu, mùi, v s n ph m trà 54

B ng 2.11: B trí thí nghi m nhi t đ trích ly gói trà thành ph m 55

B ng 2.12: B trí thí nghi m nhi t đ trích ly gói trà thành ph m 57

B ng 3.13: B ng đi m đánh giá c m quan màu, mùi, v s n ph m trà 56

B ng 3.14: B ng các ph ng pháp đánh giá các ch tiêu ch t l ng s n ph m cu i 58

B ng 3.15: B ng đi m đánh giá c m quan t ng ch tiêu màu, mùi, v s n ph m trà 59

B ng 3.1: K t qu kh o sát nguyên li u ban đ u 62

B ng 3.2: nh h ng c a n ng đ dung môi đ n quá trình trích ly 63

B ng 3.3: nh h ng c a t l nguyên li u – dung môi đ n quá trình trích ly 65

B ng 3.4: nh h ng c a th i gian và nhi t đ đ n quá trình trích ly 66

B ng 3.5: Giá tr OD và HTCO (%) c a cao chi t lá gai và vitamin C 69

B ng 3.6: Kh n ng kháng khu n c a d ch chi t lá gai b ng ethanol 72

T V N

Lão hóa và b nh t t là nh ng quá trình t nhiên c a cu c s ng mà t t c m i loài sinh v t đ u ph i tr i qua và con ng i c ng không thoát kh i quy lu t này N m

1954, bác s Denham Harman thu c đ i h c Berkeley đã nh n ra s hi n h u c a các

g c t do trong c th c ng chính là nguyên nhân gây ra các t n th ng cho t bào d n

đ n lão hóa và b nh t t Các nghiên c u ngày nay cho th y, c th con ng i có th t

t o ra các ch t ch ng oxy hóa là các ch t có kh n ng ng n ng a, ch ng l i và lo i b các tác d ng đ c h i c a g c t do Tuy nhiên, khi tu i tác t ng lên ho c ti p xúc v i môi tr ng đ c h i, các g c t do sinh ra quá nhi u và c th không đáp ng đ các

ch t ch ng oxy hóa do đó c n ph i b sung thêm cho c th Có nhi u ngu n b sung

ch t ch ng oxy hóa khác nhau và các ch t ch ng oxy hóa có ngu n g c t nhiên ngày càng đ c quan tâm nghiên c u b i nh ng l i ích mà nó mang l i cho s c kh e con

ng i Do đó, vi c tìm ra ngu n nguyên li u m i, r , d i dào và ch a nhi u ho t ch t sinh h c có kh n ng ch ng oxy hóa cao là m t trong nh ng m i quan tâm hàng đ u

c a các nhà nghiên c u c ng nh các nhà s n xu t d c, th c ph m Qua quá trình tìm

hi u, có th th y đ c r ng lá gai là m t loài th c v t ph bi n n c ta và nhi u

n c trên th gi i, đ c bi t là các n c nhi t đ i và c n nhi t Nh ng nghiên c u ngày nay cho th y lá gai ngoài vi c ch a nhi u ch t dinh d ng nh trong 100g lá gai có kho ng 22% protein, 9 – 29 g ch t x , 15 – 17 g ch t tro, trong lá gai còn có r t nhi u

ho t ch t sinh h c có l i cho s c kh e nh chlorogenic acid, rhoifolin, acid palmitic, acid stearic, vitamin E… Tuy nhiên, hi n nay lá gai h u nh ch đ c s d ng đ làm các lo i bánh c truy n nh Bánh Ít lá gai v i ch t l ng c m quan t t mà nh ng nghiên c u sâu v lá gai còn r t h n ch

Chính vì nh ng lí do đó, nh m kh ng đ nh các ho t ch t quý giá có trong lá gai

đ ng th i t n d ng ngu n nguyên li u d i dào đang b b phí, chúng tôi quy t đ nh

th c hi n đ tài “Nghiên c u quy trình s n xu t trà túi l c t lá gai (Boehmeria

nivea)”

Trong đ tài này, chúng tôi ti n hành kh o sát quá trình trích ly lá gai đ xác

đ nh các thông s t i u K ti p chúng tôi th c hi n đ nh tính ho t ch t flavonoid,

đ nh l ng hàm l ng polyphenol t ng b ng ph ng pháp dùng thu c th Folin – ciocalteu Ti p theo, chúng tôi ti n hành kh o sát ho t tính ch ng oxy hóa c a cao

hóa c a d ch chi t và kh o sát kh n ng kháng khu n c a cao chi t ethanol lá gai Cu i cùng, chúng tôi s kh o sát các y u t nh h ng đ n quy trình s n xu t trà túi l c t

lá gai đ thu đ c các thông s t i u

V i đ tài này, chúng tôi hi v ng b c đ u kh o sát ho t tính ch ng oxy hóa, kháng khu n c a lá gai và xây d ng đ c quy trình s n xu t trà túi l c t lá gai (Boehmeria nivea), t o ra m t s n ph m trà m i l , th m ngon, ch a các ho t ch t sinh

h c t t cho s c kh e mà giá c v a ph i và phù h p v i m i l a tu i c ng nh v i

cu c s ng hi n đ i

PH N 1:

T NG QUAN TÀI LI U

1.1 Tình hình s n su t và tiêu th trà túi l c

Toàn th gi i có kho ng 40 n c tr ng trà và kho d li u trà c a Trung Qu c

đã khi n ng i ta cho r ng đó là quê h ng c a cây trà Nh ng các t li u c và nh ng

k t qu nghiên c u g n đây c a các nhà khoa h c n c ngoài cùng Hi p h i Chè Vi t Nam đã ch ra r ng trà không xu t x t Trung Hoa Quê h ng c a cây trà t n

ph ng Nam Theo truy n thuy t thì chính Vua Th n Nông khi tu n thú ph ng nam,

vô tình u ng đ c m t th lá cây r i trong n i n c đang sôi, làm cho tinh th n ph n

ch n s ng khoái nên ông g i đó là Trà

Vào đ u th k XIX, m t doanh nhân có tên Thomas Sullivan t i New York đã tìm cách c i thi n kh n ng marketing c a doanh nghi p s n xu t trà c a mình Ông đã

g i cho khách hàng các túi l a nh có ch a trà đ khách hàng u ng th và nh n đ c nhi u l i khen ng i Ý t ng này đ c Sullivan ti p t c phát tri n và hoàn thi n cho

đ n ngày nay và con ng i đã thay túi l a b ng m t lo i gi y l c đ phù h p v i nhu

c u c a th tr ng Trà túi l c m i đã đ c công chúng ch p nh n r ng rãi, đ c bi t là sau th chi n th II

Hình 1.1 Trà túi l c

Ngày nay, đ đáp ng nhu c u c a cu c s ng hi n đ i, trà túi l c đã tr thành

m t lo i n c gi i khát không nh ng mang l i s s ng khoái cho tinh th n mà còn là

m t lo i th c ph m ch c n ng có công d ng t t cho s c kh e và c ng r t ti n d ng Chính vì th , trà túi l c đang d n tr thành m t h ng đi m i đ y h a h n trong nh ng

n m g n đây V i các h ng v khác nhau và ngày càng đa d ng, trà túi l c đã và đang

đ c a chu ng th ng th c kh p n i trên th gi i và c nh tranh đáng k v i trà pha

m theo cách bình th ng

1.2 T ng quan nguyên li u

1.2.1 Lá gai (Boehmeria nivea)

Cây lá gai (Boehmeria nivea) hay còn có tên g i là Ramie T “gai-Ramie” b t

ngu n t đ t n c Mã Lai c đ i và đ c Anh hóa n lá gai còn đ c g i b ng

nh ng cái tên khác nh Rhea, Popah, KhunKoora, Kurkunda (Kirby, 1963; Manersberger, 1954) Cây gai đã đ c s d ng nh m t lo i cây cho s i d t ph ng ông th i c đ i Cây gai đã phát tri n Trung Qu c tr c c khi bông v i du nh p vào đ t n c này hàng th k vào nh ng n m 1300 sau công nguyên Nh t B n đã

s n xu t các lo i v i làm b ng s i gai đ c g i là “Echigojfu” và “Satsumjofu” t th i

c đ i Theo ghi chép c a Nester (900 n m tr c công nguyên), các tàu involga (Nga)

đã s d ng s i gai đ chu n b các cánh bu m c a h

Giai đo n l ch s hi n đ i c a cây gai đ c cho là đ c b t đ u t nh ng n m

1960 khi George Eberhard Rumph tìm th y chúng phía ông n và g i chúng là Ramium majus Ch đ n nh ng n m cu i th k 19, h t gi ng và cây c a loài cây này

m i đ c chuy n đ n h u h t các n c khác trên th gi i và có đ c s phát tri n nh ngày hôm nay (Monotogomery, 1954)

Chi gai có h n 100 loài ch y u là nhi t đ i và c n nhi t đ i trong đó có m t s

là cây b i, các lo i th o m c và cây g Lawrence (1963) báo cáo có kho ng 80 loài

c a chi này, trong khi Berger (1954) đã đ c p đ n 50 loài Các thông tin báo cáo ti p theo c ng ghi nh n Tây bán c u (Anon, 1948) có ít nh t 13 loài, Nh t B n 40 loài (Kirby 1963), n 45 loài (Hooker, 1885), kho ng 45 loài t Ceylon (Triman, 1974)

và 50 loài t ông Á (Ridley, 1967)

Boehmeria bullata Boehmeria caudata Boehmeria ulmifolia

Hình 1.3: M t vài loài thu c chi gai

Chi Boehmeria có hai loài h u ích nh t, m t trong s đó loài B nivea còn đ c

g i là loài gai tr ng vì l p màu tr ng bên d i b m t lá là m t loài có giá tr th ng

Hình 1.2: Cây lá gai (Boehmeria nivea)

t nh phía B c Vi t Nam, bao g m các tnh nh Lào Cai, L ng S n, Qu ng Ninh, Hà

N i… Ngoài ra, cây gai c ng phân b nhi u n i n c ta d i d ng cây tr ng

ho c bán hoang dã t b c vào nam

Cây gai là cây lâu n m, đ ng th ng, th ng m c thành b i, cao kho ng 1,5m - 2m, thân th ng không phân cành, có đ ng kính t 12mm - 20mm, lúc non màu xanh

và có lông m m, sau màu nâu nh t và hóa g

Hình 1.4: Thân cây lá gai lúc non và già

Lá đ n m c cách, cu ng lá dài 6cm - 12 cm có lông và xu t hi n ph n trên

c a thân cây Phi n lá có hình tr ng r ng, hình tam giác đ n g n tròn, có chi u r ng

g n 5 - 13 cm và đ dài kho ng 10 - 15 cm G c lá hình nêm đ n g n trái tim, đ u lá

th ng có hình m i nh n, mép có nhi u r ng c a M t trên lá có màu xanh l c s m và

nh n, m t d i nh n và có các lông nh màu tr ng

C m hoa hình chùy hay hình c m m c nách lá, dài 3 - 8 cm, m i nhánh mang các c m hoa ch m l i hay tách xa nhau Các c m hoa đ c th ng nh v i 3 - 10 hoa,

c m hoa cái l n h n và th ng mang 10 - 30 hoa Hoa đ c có cu ng ng n, bao hoa 3 -

5 thùy, s nh b ng s thùy, th ng là 5 thùy Hoa cái không có cu ng, bao hoa hình

ng, 2 - 4 thùy, màu xanh nh t, b u ch a 1 noãn, vòi m nh và có lông m t phía, núm hình s i Hoa đ c n tr c và hoa th ph n nh gió

Hình 1.5: Hoa cây gai (hoa cái, h oa đ c)

Qu b , hình c u đ n hình tr ng, đ ng kính kho ng 1 mm, bao b c b i bao hoa, có lông, màu vàng nâu H t có kích th c r t nh kho ng 7000 h t/g và có màu nâu đen

Cây gai phát tri n t t các khu v c có l ng m a t t và khí h u m áp Các

đi u ki n đ t và khí h u:

t: đ t thích h p cho tr ng cây gai là đ t cát pha sét ho c mùn ho c r t cát, đ t sét và đ t s i thì không phù h p t ph i cung c p đ đ m, thoát n c t t, không

ng p úng hay l l t pH c a đ t cho cây sinh tr ng t t kho ng 5,5 - 5,6

Khí h u: cây gai phát tri n và sinh tr ng t t nh t khí h u m áp, m t, nhi t đ kho ng 25 - 300

C trong su t màu hè và l ng m a trung bình h ng n m t

1500 - 3000 mm Cây th ng tr ng d i đ cao 300 m trên m c n c bi n Cây gai khá nh y c m v i s ng giá, gió m nh m t ng đ i kho ng 80% là t t nh t cho giai đo n phát tri n c a cây

1.2.1.2 Thành ph n hóa h c

B ng 2.1: B ng giá tr dinh d ng cây lá gai

Các ph n trên m t đ t c a lá gai có hàm l ng dinh d ng khá cao: trong 100g

ch a 11-28g protein, lá protein chi m kho ng 20-24%, 9-29g ch t x , 15-17g ch t tro Ngoài ra trong lá gai còn ch a nhi u ho t ch t sinh h c

Matsuura et at., (1973) công b các ch t axit boehnic, axit palmatic, axit stearic, axit ursolic, acid 19 -hydroxyursolic, -sitosterol, -sitosteryl- -D-glucoside, vv[14] Laranjinha et at., (1992) công b hai ch t Chlorogenic acid và rhoifolin phân l p t lá cây gai[15] Liu C et at., (2010) nghiên c u thành ph n lá gai và công b trong lá có

ch a các h p ch t: eugenyl beta-rutinoside, uracil, beta-sitosterol glucoside, hydroxy-4-methoxybenzoic acid, cholesterol, alpha-amyrin và nonacosanol

3-1.2.1.3 Tác d ng d c lý

Cây gai đ c coi là m t cây thu c c truy n c a nhi u n c châu Á Theo Huy Bích và c ng s (2004) r gai có v ng t, tính hàn, không đ c, có tác d ng an thai,

c m máu, l i ti u Lá gai c ng có v ng t, tính hàn, không đ c, có tác d ng làm mát máu, tr ho, an thai…

Trong h th ng y d c c truy n c a Trung Qu c, cây gai đ c s d ng nh

m t v thu c ch ng viêm, gi m đau, l i ti u, gi i nhi t, c m máu, ch t làm se, thu c tiêu đ c, ng n ng a s y thai c s d ng trong đi u tr đe d a s y thai, đau b ng khi mang thai, b nh tr , ch c l … G n đây, ài Loan ng i ta còn dùng lá gai nh m t

ph ng thu c cho b nh viêm gan

R gai giã nát v i r vông vang đ p làm cho m n nh t chóng m ng m Lá gai dùng riêng ho c giã đ p v i cây c t l n có tác d ng c m máu, làm lành v t th ng

Lá gai ph i h p v i lá vông, l c tiên, rau má, n u thành cao, cho thêm đ ng u ng làm thu c an th n gây ng

Lá gai còn đ c nhi u n c châu Á trong đó có Vi t Nam s d ng đ s n

xu t các lo i th c ph m c truy n nh Bánh Ít lá gai Lá gai c ng có th s d ng đ

n u canh vì thành ph n cây gai có khá nhi u ch t dinh d ng

1.2.2 C ng t (Stevia rebaudiana)

Cây C ng t (Stevia rebaudiana Bertoni) thu c h Cúc (Asteraceae), có ngu n

g c t Paragoay (Nam M ) đã đ c th dân Garani b c Paraguay dùng làm ng t

th c ph m và tr các b nh v tim, huy t áp cao, béo phì t nhi u th k tr c, đ c Bertoni mô t n m 1899, đ c Rasenack phát hi n vào n m 1908 nh ng mãi đ n n m

1931 hai ng i Pháp là Bridel và Lavieille m i xác đ nh đ c stevioside là ch t ng t

c b n t o nên đ ng t c a nó và dùng làm ch t thay th đ ng

Hình 1.6: C ng t (Stevia rebaudiana) 1.2.2.1 c đi m th c v t

C ng t là cây thân th o, đa niên, có thân r kh e, m c c n t 0 - 30 cm (tùy thu c vào đ phì nhiêu, t i x p và m c n c ng m c a đ t) Trong thiên nhiên có nhi u lo i cây ch a đ ng n ng l ng th p, v i đ ng t cao g p hàng tr m l n đ ng mía Chúng đ c dùng làm ch t thay th đ ng cho nh ng ng i ph i kiêng lo i th c

ph m này C ng t (còn g i là c m t, c đ ng, cúc ng t, tr ch lan) là m t lo i cây

nh th

Ph n gân lá: Gân phía d i l i, phía trên g n ph ng h i lõm xu ng Bi u bì trên

và d i là m t hàng t bào nh , hình tr ng, x p liên t c, đ u đ n, mang lông che ch

đa bào c u t o b i 4 - 6 t bào x p th ng hàng, đ u lông nh n Mô dày c u t o b i 2 -

3 l p t bào hình tròn, có màng dày góc, x p sát d i bi u bì Mô m m là nh ng t bào hình đa giác hay tròn, màng m ng, có kích th c không đ u gi a gân th ng

có các s l bó libe-g hình tròn, có th là 1, 3, 5 bó có c u t o t ng t nhau Bó

libe-g libe-gi a th ng có kích th c l n nh t, có libe bao quanh bó g , g c u t o b i các

m ch g l n, x p thành hàng, t p trung thành bó Mô m m c u t o b i các t bào hình tròn, có màng m ng

Ph n phi n lá: Bi u bì trên và d i là m t hàng t bào hình ch nh t, to h n so

v i bi u bì gân lá, mang lông che ch đa bào t ng t ph n gân lá Mô gi u c u t o

b i 2 hàng t bào hình ch nh t, x p khít nhau và th ng góc v i bi u bì trên Trong phi n lá có th có m t vài bó libe - g nh c a gân ph Mô khuy t là nh ng t bào to

tr ng, thành m ng, có m t s t bào b ép l i Trong mô m m v , phía trên m i bó libe

có nh ng đám mô c ng, hình cung l n, x p liên t c thành vòng Libe c u t o b i các

t bào nh , x p thành bó nh , liên t c c ng t o thành vòng G có các m ch g to, x p thành hàng, t p trung thành đám l n, liên t c t o thành vòng Mô m m ru t là nh ng

t bào hình tròn, thành m ng, có kích th c l n

c tính quan tr ng c a các glucozit này là có th làm ng t các lo i th c n và

đ u ng mà không gây đ c h i cho ng i, không đòi h i k thu t s n xu t ph c t p,

n ng su t cao, công ngh thu hái ch bi n đ n gi n Kh i l ng thân, lá và ch t l ng

c ng t đ t cao nh t th i k tr c khi n hoa, ngh a là nên thu ho ch giai đo n hình thành n

Rf Value

1 Glycoside MeOH:chloroform:water

(25, 65,4)

Sodium nitroprusside

0.32

3 Terpenoides Benzene: Ethyl acetate Vanillin –

sulphuric acid

i)d Pink ii) Light pink

iii) Violet

i) 0.66 ii) 0.77 iii) 0.88

4 Carbohydrates Benzene: GAA: MeOH

(20:20:50)

Anisaldehyde – sulphuric acid

Trong cây có ch a ch t ng t có tên là stevioside, là m t heteroside tan trong

n c và có v ng t g p h n 200 l n đ ng mía Ph n đ ng có 2 m ch: m t m ch là sophorose [=2-O(b-D-gluco-pyranosyl)-D-glucose] n i theo dây n i acetal v i nhóm

OH C-13 và m ch còn l i là m t glucopyranose n i theo dây n i ester v i nhóm carboxyl v trí C-19 n nay, nhi u d n ch t diterpenoid glycosid khác đ c phân

l p ti p và đã xác đ nh đ c c u trúc stevioside, steviolbioside, rebaudioside A, rebaudioside B, rebaudioside C (Dulcosid), rebaudioside D, rebaudioside E, Dulcoside

1.2.2.3 Ho t ch t sinh h c

Stevioside sau khi th y phân s cho các phân t steviol và isosteviol Ch t steviol ng t g p 300 l n đ ng saccarozo, ít n ng l ng, không lên men, không b phân h y mà h ng v th m ngon, có th dùng đ thay th đ ng trong ch đ n kiêng V i lo i đ ng này khi b sung c ng t vào s n ph m trà cam g ng, chúng tôi ti n hành kh o sát t l ph i tr n thích h p nh m t o cho s n ph m có đ ng t thanh đ t ch tiêu ch t l ng đ ra

Hình 1.7: Công th c c u t o m t s h p ch t sinh h c có trong c ng t 1.2.2.4 Tác d ng d c lý

C ng t c ng đ c dùng nh m t lo i trà dành cho nh ng ng i b b nh ti u

đ ng, béo phì ho c cao huy t áp M t thí nghi m đ c ti n hành trên 40 b nh nhân cao huy t áp đ tu i 50, cho th y, lo i trà này có tác d ng l i ti u, ng i b nh th y d

ch u, ít đau đ u, huy t áp t ng đ i n đ nh

Trong công nghi p th c ph m, c ng t đ c dùng đ pha ch làm t ng đ ng t

mà không làm t ng n ng l ng c a th c ph m Ngoài ra, lo i cây này còn đ c dùng trong ch bi n m ph m, ch ng h n s a làm m t tóc, kem làm m m da Nó v a có tác d ng nuôi d ng t t c các mô, tái t o làn da m i v a ch ng nhi m khu n, tr

n m M t s nghiên c u cho r ng c ng t có tác d ng ng n s th tinh trên chu t, s n

ph m chuy n hoá c a steviol có gây bi n d gen Tuy nhiên các tác d ng này ch a

đ c xác nh n.Cao c ng t và steviosid đ c dùng r ng rãi làm ch t ng t Nh t và

m t s n c khác, ch riêng Nh t m i n m tiêu th đ n 700 t n c ng t và ch a th y

có các ph n ng đ c h i

1.3.1 G c t do

Trong hóa h c, g c t do đ c khái ni m là nh ng nguyên t , nhóm nguyên t

ho c phân t l p ngoài cùng có nh ng electron không ghép đôi G c t do có th t n

t i đ c l p, tuy nhiên th i gian t n t i c a các g c t do th ng r t ng n (kho ng m t

ph n tri u đ n m t ph n nghìn giây) Các electron này có n ng l ng cao, r t kém b n nên d dàng tham gia vào nhi u ph n ng hóa h c nh ph n ng oxy hóa – kh , ph n

ng polymer hóa… Các g c t do hình thành khi có s đ t n i đ ng ly các liên k t

c ng hóa tr Quá trình này c n n ng l ng Quá trình ph n ng oxy hóa kh m t đi n

t c ng t o thành g c t do Ví d nh ph n ng Fenton t o g c t do HO• t H2O2

d i s xúc tác c a ion s t là m t ví d đi n hình c a ph n ng oxy hóa kh m t đi n

tr thành m t g c t do, v i s đi n t l Các g c t do luôn tìm cách chi m đo t các electron c a các phân t khác đ đ t tr ng thái cân b ng Quá trình này hình thành nên

m t chu i các g c t do liên ti p nhau, gây r i lo n ho t đ ng c a t bào

Các g c t do trong c th sinh v t sinh ra có 2 ngu n g c, đó là ngu n n i sinh

và ngu n ngo i sinh G c t do có ngu n n i sinh là các g c t do đ c chính c th

t o ra G c t do có ngu n ngo i sinh đ c hình thành trong c th do các y u t ngo i lai nh ô nhi m môi tr ng, tác đ ng c a tia t ngo i trong ánh n ng m t tr i, thu c lá, r u, thu c ch a b nh

T rong quá trình trao đ i ch t và trong chu i hô h p t bào: H u h t các d ng

s ng đ u c n đ n g c t do cho các quá trình s ng di n ra trong c th m c đ vi

mô Trong t bào, hàng tri u ph n ng hóa h c x y ra hàng ngày đ cung c p n ng

l ng cho ho t đ ng s ng c ng nh t o nên các ch t c n thi t đ xây d ng c th Trong đó, các ph n ng đòi h i s di chuy n đi n t là r t nhi u và nh t là trong chu i

hô h p t bào Quá trình hô h p t bào nh m t o ra n ng l ng cho ho t đ ng s ng là

m t quá trình oxy hóa – kh và g c t do là m t s n ph m trung gian đ c sinh ra

Trong h th ng mi n d ch: Khi c th b các v t l ho c vi sinh v t t n công,

m t h mi n d ch ch ng l i các tác nhân này là r t c n thi t óng vai trò chính đây

là t bào lympho T và các g c t do, ph n l n là các ROS đ c t o b i s ho t đ ng

c a các đ i th c bào góp ph n tiêu di t vi sinh v t Bên c nh đó, các g c t do còn giúp quét d n các t bào già, ch t trong c th , t o đi u ki n cho các t bào m i phát tri n ng th i, các g c t do còn góp ph n tiêu di t các t bào b t th ng nh t bào ung th

Vai trò khác: Ngoài hai vai trò chính trên, g c t do còn tham gia các quá trình

khác nh đóng vai trò truy n tín hi u t bào, là ch t d n th n kinh (NO) và c n thi t cho vi c hình thành m t s hormon nh thyroxin

Tác h i c a g c t do:

Stress oxy hóa (oxidative stress): là k t qu c a s hình thành g c t do v t quá m c ki m soát c a các h th ng ch ng oxy hóa trong c th Stress oxy hóa d n

đ n h u qu là phát sinh nhi u lo i b nh c a tu i già nh Parkinson, Alzheimer và m t

s b nh v th n kinh khác; x v a đ ng m ch, b nh đái tháo đ ng, b nh ph i, b nh ung th , viêm kh p, thoái hóa võng m c, đ c th y tinh th , suy gi m h th ng mi n

d ch

Quá trình peroxid hóa lipid: S oxy hóa đ c bi t đ n nhi u nh t là nh h ng

c a các g c t do và ROS đ n s peroxid hóa lipid Màng t bào giàu acid béo ch a bão hòa nên đ b t n công b i tác nhân oxy hóa, quá trình này g i là s peroxid hóa lipid Vi c làm h h i lipid th ng đ c xúc tác b i các ion kim lo i chuy n ti p làm

nh h ng đ n tính linh đ ng c a màng d n đ n m t s b nh nh đái tháo đ ng,

b nh trên h tim m ch

Làm h h ng protein: Protein b peroxid hóa có th i gian t n t i dài h n, do đó

chúng có th khuy ch tán trong t bào và mô trong th i gian dài, vì th chúng có th

ph n ng v i các phân t protein khác và kh i mào cho ph n ng dây chuy n

Phá h y DNA: Các g c t do d dàng t n công ADN thông qua vi c t n công

vào nhóm đ ng deoxyribose và base nit c a nhóm purin và pirimidin hình thành th

đ t bi n

Quá trình lão hóa: Lão hóa là m t quá trình ph c t p trong đó các t n h i do

oxy hóa đóng vai trò r t quan tr ng Các ph n ng sinh hóa bên trong t bào t o ra các

g c t do ho t đ ng, các g c này nhanh chóng ph n ng v i các phân t quanh nó là nguyên nhân chính gây xáo tr n ho t đ ng c a các ty l p th , bám vào các ADN gây

đ t bi n bên trong các t bào Vì th , các g c t do là nguyên nhân c a s t h y ho i

và lão hóa c p t bào

1.3.2 C ch ch ng oxy hóa

Ch t ch ng oxy hóa là nh ng ch t có kh n ng ng n ng a, ch ng l i và lo i b tác d ng đ c h i c a các g c t do m t cách tr c ti p ho c gián ti p Ch t ch ng oxy hóa có th tr c ti p ph n ng v i các g c t do ho t đ ng đ t o ra nh ng g c t do

m i kém ho t đ ng h n, t đó có th ng n c n chu i ph n ng dây chuy n đ c kh i mào b i các g c t do

Ch t ch ng oxy hóa c ng có th gián ti p t o ph c v i các ion kim lo i chuy n

ti p trong ph n ng Fenton ho c c ch các enzym xúc tác cho các quá trình sinh ra

g c t do nh m ng n c n s hình thành g c t do trong c th Có nhi u cách phân

lo i ch t ch ng oxy hóa d a trên ngu n g c, c u trúc c a ch t ch ng oxy hóa M t trong nh ng cách đó là d a trên b n ch t enzym ho c không enzym c a ch t ch ng oxy hóa

1.3.3 Ch t ch ng oxy hóa

Ch t ch ng oxy hóa có b n ch t là enzyme:

ây là h th ng ch ng oxy hóa n i sinh t n t i trong t bào và gi vai trò quan

tr ng trong vi c duy trì s s ng T bào sinh ra và l n lên luôn b t n h i b i các g c

t do sinh ra trong các quá trình sinh lý nh hô h p và các b nh lý Chính vì th , m t

h th ng ch ng oxy hóa n i sinh đ b o v t bào là c n thi t H th ng đó bao g m các enzyme sau:

Superoxid dismutase (SOD):

Hi n di n trong t bào, SOD hi n di n trong ti th có cofactor là mangan (Mn – SOD), SOD hi n di n trong bào t ng có cofactor là k m (Zn – SOD) SOD trong

d ch t bào ch có đ ng tham gia vào quá trình xúc tác, k m ch tham gia vào s n

đ nh enzyme SOD có n ng đ cao nh t gan, th n và h ng c u, xúc tác superoxid thành H2O2

Glutathion peroxydase (GSH-Px)

Enzyme phân h y H2O2 các t bào c a đ ng v t có vú ch y u là GSH-Px Glutathion (GSH) là cofactor c a enzym GSH-Px GSH là m t tripeptid ch a 3 lo i acid amin là acid glutamic, cystein và glycin GSH-Px là enzyme có selen, enzyme này

là m t nhân t ch ng oxy hóa m nh g p ch y u trong bào t ng, nó ng n c n vi c hình thành các g c t do t o thành trong các quá trình t ng h p di n ra trong c th , xúc tác s kh hóa c a H O , các hydro peroxid và peroxid h u c

SOD

H2O2+ 2GSH 2 H2O + GSSG ROOH + 2GSH ROH + H2O + GSSG

V i:

GSH: Glutathion d ng kh

GSSG (glutathiondisulfide): Glutathion d ng oxy hóa

D ng oxy hóa ph c h i nh glutathion reductase (GR) :

GSSG + NADPH + H+ 2 GSH + NADPH

GSH-Px ho t đ ng khi khi H2O2 n ng đ th p, khi H2O2 n ng đ cao catalase s ho t đ ng Khi H2O2 còn l i r t ít, catalase không còn tác d ng thì GSH-Px

đ c ho t hóa và xúc tác ph n ng phân h y H2O2 i u này r t quan tr ng vì ph n

ng v i GSH-Px đòi h i ph i có c ch t là GSH, còn ph n ng v i catalase thì không

Ch t ch ng oxy hóa không có b n ch t enzyme

Ch t ch ng oxy hóa không có b n ch t enzyme là nh ng h p ch t do c th sinh ra (ngu n g c n i sinh) nh vitamin A, glutathion, glycin, methionin, ho c các

ch t ch ng oxy hóa ngo i sinh có nhi u trong th c v t g m có các nhóm vitamin C, vitamin E, flavonoid, lignan, alkaloid, courmarin, terpen, carotenoid… Các ch t này

đ c x p vào nhóm các ch t ch ng oxy hóa không có b n ch t là enzyme

Vitamin E

Catalase Catalase

Vitamin E là m t ch t ch ng oxy hóa hòa tan trong lipid, phân ph i r ng kh p trong t bào và đ c coi nh là hàng phòng th tr c tiên ch ng l i quá trình peroxyd hóa lipid Vitamin E b o v các acid béo ch a bão hòa và cholesterol trong màng t bào

Vitamin E giúp ti t ki m selenium c a enzyme GSH-Px và b o v nh ng ch t

t ng t ch t béo khác nh vitamin A kh i b phân h y Trong s hi n di n c a ion FC1+/ascorbat, vitamin E không ng n ch n đ c s kh i phát quá trình peroxid hóa lipid nh ng góp ph n làm ch m l i ti n trình này Vitamin E là m t t p h p 8 ch t, trong đó – tocopherol là h p ch t th hi n ho t tính ch ng oxy hóa m nh nh t Tính

ch t ch ng oxy hóa c a -tocopherol th hi n qua vi c ng n ch n ph n ng c a các

g c t do b ng cách nh ng 1 hydro (H) c a g c phenol cho g c lipoperoxyl (LOO•)

đ bi n g c t do này thành hydroperoxyd (LOOH):

LOO• + Tocopherol-OH —› LOOH + Tocopherol-O•

Trong quá trình ph n ng, tocopherol (tocopherol-OH) b chuy n hóa thành g c tocopheryl (tocopherol-O•) b n do đó ch m d t nh ng ph n ng dây chuy n theo c

ch g c

Hình 1.11 : – Tocopherol Vitamin C

Vitamin C (acid ascorbic) đ c tìm th y nhi u trong th c ph m t i, rau qu và trái cây Nó đóng m t vai trò h t s c quan tr ng trong nhi u ho t đ ng c a c th

Hình 1.10: Vitamin C

Vitamin C là giúp cho c u trúc collagen n đ nh, c n thi t cho s lành v t

th ng, t ng s c đ kháng cho c th Vitamin C c ng là m t ch t ch ng oxy hóa r t quan tr ng Vitamin C ho t đ ng nh m t ch t ch ng oxy hóa trong môi tr ng n c

c a c th – c n i bào l n ngo i bào Vitamin C c ng ho t đ ng cùng v i các enzym

ch ng oxy hóa khác nh GSH-Px, catalase và SOD H n n a, vì vitamin C ph c h i

và tái t o vitamin E t d ng b oxy hóa trong c th , nên nó t ng c ng hi u l c ch ng oxy hóa c a vitamin E:

G c tocopherol (TO ) + Vitamin C (AscH ฀ ) tocopherol (TOH) + g c ascorbyl (Asc ฀ )

Các t n th ng oxy hóa c a LDL-cholesterol đóng vai trò trung tâm trong s hình thành x v a đ ng m ch Vitamin C ng n ch n h u hi u s oxy hóa LDL ngay c

đ i v i ng i hút thu c lá Tuy nhiên, trong vài tr ng h p, vitamin C gây h i cho c

th vì nó có th đóng vai trò là m t ch t ti n oxy hóa c bi t là khi nó n ng đ cao

và có s hi n di n c a các ion kim lo i chuy n ti p (FC3+, Cu2+) Khi đó, vitamin C s đóng vai trò là ch t ti n oxy hóa xúc tác ph n ng Fenton t o các g c t do O2 ฀

, HO

và H2O2

Glutathion

Glutathion (GSH) là m t ch t ch ng oxy hóa n i sinh ph bi n có phân t

l ng th p GSH là m t tripeptid g m các acid amin nh acid L– –glutamic, L–cystein và L–glycin Ho t tính ch ng oxy hóa c a GSH đ c th hi n theo 2 cách:

GSH có hydrogen linh đ ng nên có th kh các g c t do b ng cách cho hydrogen cho các g c t do G c t do GS m i hình thành s dimer hóa t o thành h p

Nhóm các h p ch t polyphenol

Polyphenol là nhóm các h p ch t t nhiên có nhi u nhóm ch c phenol trong

c u trúc phân t Nhóm này g m có các h p ch t phenol đ n gi n, tannin và các h p

ch t flavonoid V i c u trúc có nhi u nhóm phenol, chúng có kh n ng ng n ch n các chu i ph n ng dây chuy n gây ra b i các g c t do b ng cách ph n ng tr c ti p v i

g c t do đó t o thành m t g c t do m i b n h n, ho c c ng có th t o ph c v i các ion kim lo i chuy n ti p v n là xúc tác cho quá trình t o g c t do Flavonoid là nhóm

h p ch t polyphenol r t ph bi n trong gi i th c v t Cho đ n nay đã có trên 5000 h p

ch t flavonoid đã đ c mô t C u trúc chung c a flavonoid là diphenylpropan C3-C6), flavonoid có 2 vòng benzen C6 (vòng A và B) g n v i d vòng C3 có oxy Ngày càng có nhi u s quan tâm v flavonoid vì chúng là nhóm h p ch t có công

(C6-d ng quan tr ng trong c th c v t và đ ng v t

Do có b n ch t là polyphenol các flavonoid th ng có tính ch ng oxy hóa m nh giúp c th ch ng l i các t n th ng do g c t do m t cách h u hi u Nh v y, flavonoid còn có tác d ng b o v h tim m ch, gi m nguy c t vong do các b nh lý

Do có c u trúc g n gi ng v i - tocopherol nên chúng có th thay th cho nhau trong m t s h th ng Bên c nh tính ch ng oxy hóa, chúng còn có kh n ng c ch

m t s enzym Nhi u lo i enzym trong s này là các enzym oxy hóa kh nh cyclooxygenase, lipoxygenase, và NADPH oxydase Flavonoid còn có kh n ng ch ng ung th m t cách hi u qu m c dù c ch chính xác c a tác đ ng này v n ch a đ c

hi u rõ Nh ng nghiên c u g n đây đã ch ng minh nh h ng c a flavonoid trong s

ng n ng a phát sinh ung th i u này thúc đ y nhi u nghiên c u v s c ch phát sinh ung th ph thu c flavonoid do vi c lo i các g c t do

Hình 1.12: Ph n ng c a quercetin v i g c t do superoxid

Nh v y, kh n ng ch ng oxy hóa c a flavonoid là do:

Trung hòa các g c t do và làm ch m đáng k s kh i đ u c a quá trình peroxid hóa lipid T o ph c v i các ion kim lo i chuy n ti p do đó ng n ch n s peroxid hóa lipid c ch vi c t o ra các g c t do b ng cách c ch m t s enzym nh xanthin oxydase, cyclooxygenase, lipoxygenase…

c p đ t bào, m t trong nh ng đ c tính h u ích nh t c a flavonoid – trung hòa các g c t do – là nh vào c u trúc hóa h c c ng nh s liên k t ch t ch c a nó v i màng t bào; flavonoid b o v LDL ch ng l i s oxy hóa giai đo n kh i đ u c a s peroxyde hóa lipid Flavonoid g n vào b m t c a phân t LDL hình thành liên k t ether làm gi i h n s t n công m nh m c a các tác nhân oxy hóa và các g c t do

Nh v y mà flavonoid có th b o v t bào ch ng l i các t n th ng do các g c t do

m t cách r t hi u qu

1.3.4.1 Ph ng pháp TEAC

Cation ABTS+[2,2’ – azinobis(3 – ethylbenzothiazolin – 6 – sulfonate)(ABTS)]

là m t g c t do b n ây là m t ch t phát quang màu xanh, đ c đ t tr ng đ h p thu 734 nm Khi cho ch t ch ng oxy hóa vào dung d ch ch a ABTS+, các ch t ch ng oxy hóa s kh ion này thànhABTS o đ gi m h p thu c a dung d ch b c sóng

734 nm đ xác đ nh ho t tính ch ng oxy hóa c a ch t ch ng oxy hóa trong so sánh chu n Trolox[6 – hydroxy – 2,5,7,8 – tetramethylchroman – 2 – carboxylic acid] Trong môi tr ng kali persulfate, g c ABTS+

có th b n 2 ngày trong t i nhi t đ

phòng

1.3.4.2 Ph ng pháp DPPH

1,1 – Diphenyl – 2 – picrylhydrazyl (DPPH) là m t g c t do b n, có màu tía và

có đ h p th c c đ i b c sóng 517 nm Khi có m t c a ch t ch ng oxy hóa, nó s

b kh thành 2,2 – Diphenyl – 1 – picrylhydrazyl (DPPH – H), có màu vàng o đ

gi m đ h p ph b c sóng 517 nm đ xác đ nh kh n ng kh g c DPPH c a ch t

ch ng oxy hóa

Hình 1.13: Ph n ng trung hòa g c DPPH 1.3.4.3 Ph ng pháp ORAC

Ph ng pháp này đo m c đ phân h y do b oxy hóa c a fluorescein khi có s

hi n di n c a g c peroxy Ph n ng trong đi u ki n này so sánh v i ph n ng trong s

hi n di n c a ch t chu n Trolox (hay vitamin E) và trong hi n di n c a m u ch a ch t

ch ng oxy hóa c n xác đ nh ho t tính Khi fluorescein b oxy hóa, c ng đ phát

hu nh quang s gi m đi Ti n hành đo đ gi m c ng đ phát quang này liên t c trong

fluorescein s ch m h n Xây d ng đ ng cong bi u di n s ph thu c đ gi m hu nh quang theo th i gian và vùng d i đ ng cong dùng đ tính toán K t qu tính toán là

mmol Trolox/g m u

1.3.4.4 Ph ng pháp TRAC

Ph ng pháp TRAP s d ng g c peroxyl đ c t o thành t 2,2’ – azobis(2 – amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) Khi cho AAPH vào môi tr ng plasma, các ch t kh s b oxy hóa Quá trình oxy hóa này đ c đo đ c thông qua hàm l ng oxy tiêu th b ng m t đi n c c Khi có m t ch t ch ng oxy hóa trong môi tr ng plasma, quá trình oxy hóa s di n ra ch m h n Giá tr TRAP c a m u thí nghi m

đ c tính toán d a vào đ dài pha lag c a m u so v i đ dài pha lag c a m u tr ng và

đ dài pha lag c a ch t chu n là dung d ch Trolox K t qu tính toán là mmol

Trolox/kg m u r n ho c mmol Trolox/L m u l ng

1.3.4.5 Ph ng pháp FRAP

Nguyên t c xác đ nh ho t ch t ch ng oxy hóa c a ph ng pháp này là d a vào

kh n ng c a các ch t ch ng oxy hóa trong vi c kh ph c FC3+

- TPTZ [2,4,6 – tripyridyl – s – triazin (TPTZ)] (màu tía) thành ph c FC1+ - TPTZ (màu xanh) pH

th p Khi đó, đ t ng c ng đ màu xanh t l v i hàm l ng ch t ch ng oxy hóa có trong nguyên li u M c đ t ng c ng đ màu này đ c đo b c sóng 593 nm trong

s so sánh v i ch t chu n là dung d ch FeSO4 hay BHT (Butylated Hydroxy Toluene)

Khi cho ph c FC3+ - TPTZ vào môi tr ng ch a ch t ch ng oxy hóa, các ch t

ch ng oxy hóa s nh ng đi n t cho ph c này và sinh ra FC1+

- TPTZ K t qu tính toán mmol FC1+/g ch t khô Do đó, khi k t qu tính toán ra l n h n thì chúng ta có th suy đoán r ng trong môi tr ng ph n ng đó, s l ng các phân t có th nh ng đi n

t cao Tuy nhiên, đi u này không hoàn toàn đúng vì m t phân t ch t ch ng oxy hóa

có th kh nhi u ph c FC3+ - TPTZ cùng lúc ây là m t h n ch c a ph ng pháp FRAP

1.4.1 Tính ch t

Tính kháng khu n là m t trong nh ng tác d ng sinh h c c a cây thu c Tác

flavonoid, đ c bi t là các h p ch t phenol có tính phytonxide Nó đ c hình thành nh

là m t ph n ng t v đ i v i các v t th ng do vi khu n t o nên

1.4.2 Các ph ng pháp th ho t tính kháng khu n

Th nghi m invitro thông th ng nh t đ c s d ng cho chi t xu t th c v t đó

là đánh giá ho t tính kháng khu n Ph n l n các nhà nghiên c u s d ng m t trong ba xét nghi m sau đây

- Disk diffusion assay (đ a khu ch tán hay khu ch tán qua vòng gi y l c)

- Agar dilution (pha loãng th ch)

- Broth dilution/microdilution (pha loãng trong canh tr ng/pha loãng)

Nh ng ph ng pháp này d a trên mô t c a tiêu chu n th nghi m kháng sinh.Tuy nhiên, m t s y u t có th nh h ng đ n s phù h p c a các ph ng pháp này đ i v i chi t xu t th c v t (plant extract) Nh ng y u t này bao g m: lo i vi sinh

v t đang th nghi m, n ng đ sinh kh i, lo i môi tr ng và b n ch t chi t xu t đang

đ c th nghi m (pH, đ hòa tan) [13]

Các ph ng pháp có th đ c s d ng đ xác đ nh là có hay không ho t tính kháng khu n hi n di n ho c tính n ng đ c ch t i thi u (MIC_Minimum Inhibitory Concentration)

Các ph ng pháp nói trên là nh ng ph ng pháp s d ng r ng rãi nh t đ th

invitro c a ch t chi t xu t t th c v t cho ho t tính kháng khu n

1.4.2.1 Ph ng pháp s d ng ch t n n bán r n

C hai ph ng pháp disk diffusion (khu ch tán đ a) và agar dilution (pha loãng

th ch) s d ng vi khu n phát tri n trên th ch r n đ ki m tra ho t tính kháng khu n

Nh ng ph ng pháp này t ng đ i nhanh chóng, không t n kém, và không yêu c u thi t b thí nghi m ph c t p, tuy nhiên, chúng không ph i không có nh c đi m

a Ph ng pháp khu ch tán đ a (Disk Diffusion)

Ph ng pháp khu ch tán đ a là ph ng pháp th nghi m ho t tính kháng khu n

đ c s d ng r ng rãi nh t ây là m t ph ng pháp d th c hi n và ít t n kém, có th

đ c th c hi n b i nhân viên nghiên c u và đào t o t i thi u

M i đ a gi y (6 ho c 8 mm) có ch a kh i l ng đã bi t c a ch t th nghi m s

đ c đ t trung tâm c a th ch và đ a trong 24 gi ho c h n Trong th i gian này vùng c ch xung quanh đ a đ c hình thành, đo và so sánh v i các vùng kháng sinh tiêu chu n ho c giá tr tài li u c a chi t xu t t ng ng Tr ng h p chi t xu t là nh t

ho c bán l ng (nh m t ong) m t gi ng có th đ c t o ra trong môi tr ng th ch làm

c ch t khu ch tán ra t t h n

M t trong nh ng y u đi m chính c a ph ng pháp này là nó d a trên kh n ng khu ch tán c a chi t xu t qua th ch T t c các ph ng pháp th nghi m kháng khu n

s d ng dung d ch n c đ phân tán ch t th nghi m, do đó xét nghi m các chi t xu t

có kh n ng hòa tan h n ch trong môi tr ng n c (ví d nh các lo i tinh d u) có

th không ph n ánh đúng ho t tính kháng khu n [13]

b Agar Dilution Method (Pha loãng th ch)

Các ph ng pháp pha loãng th ch là m t ph ng pháp t ng đ i nhanh chóng

mà không c n đ n vi c s d ng các thi t b tinh vi B t k phòng thí nghi m nào v i các c s vi sinh c b n có th s d ng ph ng pháp này

Trong ph ng pháp này, các ch t th nghi m đ c s d ng v i n ng đ đ c

bi t tr c vào th ch, vi khu n đ c tr i lên b m t c a đ a th ch Các đ a l p l i có th

đ c thi t l p v i m t lo t các n ng đ c a ch t th nghi m b ng cách phân chia trên

b m t th ch, nhi u loài vi khu n có th đ c th cho m t đ a duy nh t B ng cách này, m t s l ng l n các vi khu n có th đ c ki m tra trong m t th nghi m duy

nh t Các đ a đ c trong 24 gi ho c nhi u h n

M t y u đi m chính c a ph ng pháp này là khi m t h th ng tính đi m đ c

s d ng r t khó đ đ m b o tính khách quan, ngoài ra thì ph ng pháp này s d ng

kh i l ng l n ch t th nghi m h n các ph ng pháp khác Tác d ng kháng vi sinh gây nhi u b i ch t d bay h i, khó kh n trong vi c đ t đ c h nh t ng n đ nh c a tinh d u trong môi tr ng th ch và h n ch n ng đ t i đa có th đ c s d ng khi

th ch tr nên quá loãng

1.4.2.2 Ph ng pháp s d ng ch t n n l ng

T khó kh n v i s tách l p c a các h p ch t k n c trong môi tr ng th ch

vi c s d ng các ph ng pháp pha loãng canh tr ng đ th nghi m tính kháng khu n

c a ch t chi t xu t t th c v t Trong ph ng pháp này, vi khu n đ c c y trong ng nghi m trong m t môi tr ng l ng, trong s hi n di n c a các ch t th nghi m Kho ng th i gian th ng xuyên (ví d m i 10 phút hay m i gi ) m t m u đ c l y ra

và đ m vi khu n đ c xác đ nh b ng cách pha loãng n i ti p c a m u, sau đó nuôi c y

ti p trên môi tr ng th ch và đ m các đ n v khu n l c hình thành

Ph ng pháp Broth Dilution cho phép đánh giá t t h n nhi u v ho t các m c kháng khu n c a chi t xu t ho c ch t kháng sinh theo th i gian và các tính n ng nh

s ph c h i t nh ng nh h ng c a ch t th nghi m và t l sinh v t b tiêu di t t i

m t th i đi m nh t đ nh có th đ c xác đ nh Tuy nhiên ph ng pháp này t n th i gian và c n ngu n l c chuyên sâu và có th là thi u tính kinh t khi có s l ng r t l n các th nghi m đ c ki m tra

T ng t nh v i các ph ng pháp th nghi m khác, vi c k t h p các h p ch t

k n c và các lo i tinh d u vào môi tr ng l ng là m t v n đ khó Broth Dilution Methods không có pha r n đ b y các h p ch t đó nên chúng nhanh chóng tách bi t

v i môi tr ng và t o thành m t l p trên b m t c a môi tr ng i v i sinh v t nh y

c m v i hàm l ng oxy trong môi tr ng c y này có th b sung m t l p d u trên b

vi khu n ho c n m (direct bioautography) ho c đ c bao ph b i th ch và th ch gi ng

vi sinh v t (overlay bioautography) [13]

L i th chính c a ph ng pháp này là k t h p v a phân tách các thành ph n chi t xu t v a xác đ nh đ ng th i nh ng giá tr ho t tính sinh h c c a chúng

1.5.1 Ph ng pháp trích ly

1.5.1.1 Các ph ng pháp trích ly