1,1 – Diphenyl – 2 – picrylhydrazyl (DPPH) là m t g c t do b n, có màu tía và có đ h p th c c đ i b c sóng 517 nm. Khi có m t c a ch t ch ng oxy hóa, nó s b kh thành 2,2 – Diphenyl – 1 – picrylhydrazyl (DPPH – H), có màu vàng. o đ gi m đ h p ph b c sóng 517 nm đ xác đnh kh n ng kh g c DPPH c a ch t ch ng oxy hóa.
Hình 1.13: Ph n ng trung hòa g c DPPH
1.3.4.3 Ph ng pháp ORAC
Ph ng pháp này đo m c đ phân h y do b oxy hóa c a fluorescein khi có s
hi n di n c a g c peroxy. Ph n ng trong đi u ki n này so sánh v i ph n ng trong s hi n di n c a ch t chu n Trolox (hay vitamin E) và trong hi n di n c a m u ch a ch t ch ng oxy hóa c n xác đnh ho t tính. Khi fluorescein b oxy hóa, c ng đ phát hu nh quang s gi m đi. Ti n hành đo đ gi m c ng đ phát quang này liên t c trong
fluorescein s ch m h n. Xây d ng đ ng cong bi u di n s ph thu c đ gi m hu nh quang theo th i gian và vùng d i đ ng cong dùng đ tính toán. K t qu tính toán là mmol Trolox/g m u.
1.3.4.4 Ph ng pháp TRAC
Ph ng pháp TRAP s d ng g c peroxyl đ c t o thành t 2,2’ – azobis(2 –
amidinopropane) dihydrochloride (AAPH). Khi cho AAPH vào môi tr ng plasma,
các ch t kh s b oxy hóa. Quá trình oxy hóa này đ c đo đ c thông qua hàm l ng oxy tiêu th b ng m t đi n c c. Khi có m t ch t ch ng oxy hóa trong môi tr ng plasma, quá trình oxy hóa s di n ra ch m h n. Giá tr TRAP c a m u thí nghi m đ c tính toán d a vào đ dài pha lag c a m u so v i đ dài pha lag c a m u tr ng và đ dài pha lag c a ch t chu n là dung d ch Trolox. K t qu tính toán là mmol Trolox/kg m u r n ho c mmol Trolox/L m u l ng.
1.3.4.5 Ph ng pháp FRAP
Nguyên t c xác đ nh ho t ch t ch ng oxy hóa c a ph ng pháp này là d a vào
kh n ng c a các ch t ch ng oxy hóa trong vi c kh ph c FC3+ - TPTZ [2,4,6 –
tripyridyl – s – triazin (TPTZ)] (màu tía) thành ph c FC1+ - TPTZ (màu xanh) pH th p. Khi đó, đ t ng c ng đ màu xanh t l v i hàm l ng ch t ch ng oxy hóa có trong nguyên li u. M c đ t ng c ng đ màu này đ c đo b c sóng 593 nm trong s so sánh v i ch t chu n là dung d ch FeSO4 hay BHT (Butylated Hydroxy Toluene).
Khi cho ph c FC3+ - TPTZ vào môi tr ng ch a ch t ch ng oxy hóa, các ch t ch ng oxy hóa s nh ng đi n t cho ph c này và sinh ra FC1+ - TPTZ. K t qu tính toán mmol FC1+/g ch t khô. Do đó, khi k t qu tính toán ra l n h n thì chúng ta có th
suy đoán r ng trong môi tr ng ph n ng đó, s l ng các phân t có th nh ng đi n
t cao. Tuy nhiên, đi u này không hoàn toàn đúng vì m t phân t ch t ch ng oxy hóa
có th kh nhi u ph c FC3+ - TPTZ cùng lúc. ây là m t h n ch c a ph ng pháp FRAP.
1.4 Quá trình kháng khu n
1.4.1 Tính ch t
flavonoid, đ c bi t là các h p ch t phenol có tính phytonxide. Nó đ c hình thành nh là m t ph n ng t v đ i v i các v t th ng do vi khu n t o nên.
1.4.2 Các ph ng pháp th ho t tính kháng khu n
Th nghi m invitro thông th ng nh t đ c s d ng cho chi t xu t th c v t đó là đánh giá ho t tính kháng khu n. Ph n l n các nhà nghiên c u s d ng m t trong ba xét nghi m sau đây
- Disk diffusion assay (đ a khu ch tán hay khu ch tán qua vòng gi y l c)
- Agar dilution (pha loãng th ch)
- Broth dilution/microdilution (pha loãng trong canh tr ng/pha loãng)
Nh ng ph ng pháp này d a trên mô t c a tiêu chu n th nghi m kháng sinh.Tuy nhiên, m t s y u t có th nh h ng đ n s phù h p c a các ph ng pháp này đ i v i chi t xu t th c v t (plant extract). Nh ng y u t này bao g m: lo i vi sinh v t đang th nghi m, n ng đ sinh kh i, lo i môi tr ng và b n ch t chi t xu t đang đ c th nghi m (pH, đ hòa tan). [13]
Các ph ng pháp có th đ c s d ng đ xác đ nh là có hay không ho t tính
kháng khu n hi n di n ho c tính n ng đ c ch t i thi u (MIC_Minimum Inhibitory Concentration).
Các ph ng pháp nói trên là nh ng ph ng pháp s d ng r ng rãi nh t đ th
invitro c a ch t chi t xu t t th c v t cho ho t tính kháng khu n. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1.4.2.1 Ph ng pháp s d ng ch t n n bán r n
C hai ph ng pháp disk diffusion (khu ch tán đ a) và agar dilution (pha loãng
th ch) s d ng vi khu n phát tri n trên th ch r n đ ki m tra ho t tính kháng khu n.
Nh ng ph ng pháp này t ng đ i nhanh chóng, không t n kém, và không yêu c u
thi t b thí nghi m ph c t p, tuy nhiên, chúng không ph i không có nh c đi m.
a. Ph ng pháp khu ch tán đ a (Disk Diffusion)
Ph ng pháp khu ch tán đ a là ph ng pháp th nghi m ho t tính kháng khu n
đ c s d ng r ng rãi nh t. ây là m t ph ng pháp d th c hi n và ít t n kém, có th đ c th c hi n b i nhân viên nghiên c u và đào t o t i thi u.
M i đ a gi y (6 ho c 8 mm) có ch a kh i l ng đã bi t c a ch t th nghi m s
đ c đ t trung tâm c a th ch và đ a trong 24 gi ho c h n. Trong th i gian này
vùng c ch xung quanh đ a đ c hình thành, đo và so sánh v i các vùng kháng sinh tiêu chu n ho c giá tr tài li u c a chi t xu t t ng ng. Tr ng h p chi t xu t là nh t ho c bán l ng (nh m t ong) m t gi ng có th đ c t o ra trong môi tr ng th ch làm c ch t khu ch tán ra t t h n.
M t trong nh ng y u đi m chính c a ph ng pháp này là nó d a trên kh n ng khu ch tán c a chi t xu t qua th ch. T t c các ph ng pháp th nghi m kháng khu n s d ng dung d ch n c đ phân tán ch t th nghi m, do đó xét nghi m các chi t xu t có kh n ng hòa tan h n ch trong môi tr ng n c (ví d nh các lo i tinh d u) có th không ph n ánh đúng ho t tính kháng khu n. [13]
b. Agar Dilution Method (Pha loãng th ch)
Các ph ng pháp pha loãng th ch là m t ph ng pháp t ng đ i nhanh chóng
mà không c n đ n vi c s d ng các thi t b tinh vi. B t k phòng thí nghi m nào v i
các c s vi sinh c b n có th s d ng ph ng pháp này.
Trong ph ng pháp này, các ch t th nghi m đ c s d ng v i n ng đ đ c
bi t tr c vào th ch, vi khu n đ c tr i lên b m t c a đ a th ch. Các đ a l p l i có th đ c thi t l p v i m t lo t các n ng đ c a ch t th nghi m b ng cách phân chia trên b m t th ch, nhi u loài vi khu n có th đ c th cho m t đ a duy nh t. B ng cách này, m t s l ng l n các vi khu n có th đ c ki m tra trong m t th nghi m duy
nh t. Các đ a đ c trong 24 gi ho c nhi u h n.
M t y u đi m chính c a ph ng pháp này là khi m t h th ng tính đi m đ c s d ng r t khó đ đ m b o tính khách quan, ngoài ra thì ph ng pháp này s d ng kh i l ng l n ch t th nghi m h n các ph ng pháp khác. Tác d ng kháng vi sinh gây nhi u b i ch t d bay h i, khó kh n trong vi c đ t đ c h nh t ng n đ nh c a tinh d u trong môi tr ng th ch và h n ch n ng đ t i đa có th đ c s d ng khi th ch tr nên quá loãng.
1.4.2.2 Ph ng pháp s d ng ch t n n l ng
T khó kh n v i s tách l p c a các h p ch t k n c trong môi tr ng th ch
vi c s d ng các ph ng pháp pha loãng canh tr ng đ th nghi m tính kháng khu n c a ch t chi t xu t t th c v t. Trong ph ng pháp này, vi khu n đ c c y trong ng nghi m trong m t môi tr ng l ng, trong s hi n di n c a các ch t th nghi m. Kho ng th i gian th ng xuyên (ví d m i 10 phút hay m i gi ) m t m u đ c l y ra và đ m vi khu n đ c xác đnh b ng cách pha loãng n i ti p c a m u, sau đó nuôi c y
ti p trên môi tr ng th ch và đ m các đ n v khu n l c hình thành.
Ph ng pháp Broth Dilution cho phép đánh giá t t h n nhi u v ho t các m c
kháng khu n c a chi t xu t ho c ch t kháng sinh theo th i gian và các tính n ng nh s ph c h i t nh ng nh h ng c a ch t th nghi m và t l sinh v t b tiêu di t t i m t th i đi m nh t đnh có th đ c xác đ nh. Tuy nhiên ph ng pháp này t n th i gian và c n ngu n l c chuyên sâu và có th là thi u tính kinh t khi có s l ng r t l n các th nghi m đ c ki m tra.
T ng t nh v i các ph ng pháp th nghi m khác, vi c k t h p các h p ch t
k n c và các lo i tinh d u vào môi tr ng l ng là m t v n đ khó. Broth Dilution Methods không có pha r n đ b y các h p ch t đó nên chúng nhanh chóng tách bi t
v i môi tr ng và t o thành m t l p trên b m t c a môi tr ng. i v i sinh v t nh y
c m v i hàm l ng oxy trong môi tr ng c y này có th b sung m t l p d u trên b (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
m t môi tr ng đ ng n c n s trao đ i khí.