a. M c đích
Xác đ nh đ m, đ tro và hàm l ng polyphenol t ng c a nguyên li u lá gai.
b. Cách ti n hành
Chu n b lá gai đ c l a ch n k , không b sâu hay héo.
Ph ng pháp phân tích các ch tiêu trên theo b ng:
B ng 2.2: Ph ng pháp phân tích các ch tiêu nguyên li u ban đ u
STT Ch tiêu Ph ng pháp
1 m S y đ n kh i l ng không đ i
2 tro Nung tro
3 L ng polyphol t ng Ph ng pháp đ nh l ng polyphenol t ng b ng thu c th Folin – ciocalteu.
Cách ti n hành đ c th c hi n nh ph l c.
Ti n hành thí nghi m l p l i ba l n, k t qu cu i cùng là giá tr trung bình c a ba l n đo.
c. Cách đánh giá
Tính toán các ch tiêu theo ph l c.
2.2.4.2 Thí nghi m 2: Kh o sát các đ c tính sinh h c đ c tr ng c a nguyên li u nguyên li u
kh o sát kh n ng ch ng oxy hóa và kháng khu n c a lá gai, các thí nghi m đ c ti n hành d a trên cao chi t ethanol, chính vì v y kh o sát các y u t nh h ng đ n quá trình trích ly là 1 y u t c n thi t giúp xác đnh chính xác kh n ng ch ng oxy hóa và kháng khu n c a lá gai.
Thí nghi m 2.1: Kh o sát nh h ng c a n ng đ dung môi đ n
a. M c đích
Ch n đ c n ng đ dung môi ethanol trích ly thích h p đ nâng cao hi u su t quá trình trích ly.
b. B trí thí nghi m
B trí thí nghi m m t y u t là A v i các n ng đ dung môi ethanol 60%, 70%,
80%, 90% t ng ng A1, A2, A3, A4 và đ c b trí theo ki u hoàn toàn ng u nhiên
v i 3 l n l p l i v i A0 là m u đ i ch ng trích ly b ng n c.
B ng 2.3: B ng b trí thí nghi m kh o n ng đ dung môi trích ly
Ti n hành thí nghi m: Dung môi trích ly Ethanol (%) (v/v ) A0 A1 A2 A3 A4 N ng đ dung môi 0% ( i ch ng) 60% 70% 80% 90%
Hình 2.3: S đ b trí thí nghi m kh o sát n ng đ dung môi trích ly c. Cách đánh giá
Chu n b lá gai đ c l a ch n k , không b sâu hay héo, l t b cu ng lá. Chu n
b 5 becher đ ng dung môi, ti n hành pha loãng c n 99,5 đ đ c 100 ml dung môi
v i n ng đ l n l t nh b ng trên.
Cân 5 g m u, ch n qua v i n c sôi trong 5 giây, xay nh , l n l t cho vào các becher đã chu n b . Ti n hành trích ly 600C trong 1 gi . Sau đó, l c thu d ch chi t r i
đem dch chi t đi pha loãng 1000 l n b ng c n tuy t đ i 99,5 và th c hi n đ nh l ng
hàm l ng polyphenol c a d ch chi t.
Cách pha loãng d ch chi t nh sau: hút 1 ml d ch chi t cho vào ng nghi m ch a 9 ml c n 99,5, l c đ u ng nghi m ta thu đ c d ch chi t có đ pha loãng 10 l n, Ti p t c pha loãng nh trên đ n 1000 l n. Hút 1 ml d ch pha loãng 1000 l n vào ng nghi m và ti n hành đo OD theo ph ng pháp đ nh l ng hàm l ng polyphenol c a
Lá gai X lý Trích ly A0 A1 A2 A3 A4 L c và thu d ch chi t polyphenol t ng
Ti n hành th c hi n l p l i 3 l n m i nghi m th c và ghi nh n k t qu .
d. Cách đánh giá
Ch tiêu theo dõi: Hàm l ng Polyphenol t ng .
o hàm l ng ho t ch t sinh h c b ng ph ng pháp đ nh l ng hàm l ng
polyphenol t ng theo ph l c.
Sau khi tính toán k t qu b ng ph n m m Stagraphic 3.0 tìm đ c n ng đ dung môi thích h p.
Thí nghi m 2.2: Kh o sát nh h ng c a t l nguyên li u - dung
môi đ n hàm l ng polyphenol trong cao chi t a. M c đích
Tìm ra t l nguyên li u và dung môi thích h p đ thu đ c hàm l ng ho t ch t sinh h c polyphenol cao nh t.
b. B trí thí nghi m
B trí thí nghi m m t y u t là B v i các t l nguyên li u/dung môi là 1/5,
1/10, 1/15, 1/20, 1/25 t ng ng B1, B2, B3, B4, B5 và đ c b trí theo ki u hoàn
toàn ng u nhiên v i 3 l n l p l i.
B ng 2.4: B ng b trí thí nghi m kh o sát t l nguyên li u : dung môi
Nguyên li u : Dung môi
B1 B2 B3 B4 B5
T l (w/v) 1/5 1/10 1/15 1/20 1/25
Hình 2.4: S đ b trí thí nghi m kh o sát t l nguyên li u : dung môi trích ly
c. Cách ti n hành
Chu n b lá gai đ c hái t v n lá gai tr ng i h c M Tp. H Chí Minh, c s 3 Bình D ng, l a ch n k , không b sâu hay vàng héo, b cu ng.
Cân kh i l ng lá gai cho m i nghi m th c nh b ng trên. Ch n qua v i n c n c sôi trong 5 giây, xay nh , l n l t cho vào các becher đã chu n b s n. Ti n hành trích ly v i dung môi đã ch n đ c thí nghi m 3.2.4.2 600C trong 1 gi . Sau đó, l c thu d ch chi t r i đem d ch chi t đi pha loãng 1000 l n nh thí nghi m 3.2.4.2 và
ti n hành đo OD theo ph ng pháp đ nh l ng hàm l ng polyphenol c a d ch chi t
nh ph l c. Sau khi thu đ c k t qu đo OD thì ch n nghi m th c có k t qu cao
nh t và có khác bi t so v i nh ng nghi m th c còn l i. Ti n hành th c hi n l p l i 3 l n m i nghi m th c và ghi nh n k t qu . Lá gai X lý Trích ly B1 B2 B3 B4 B5 L c và thu d ch chi t Polyphenol t ng
Ch tiêu theo dõi: Hàm l ng Polyphenol t ng .
o hàm l ng ho t ch t sinh h c b ng ph ng pháp đ nh l ng hàm l ng
polyphenol t ng theo ph l c.
Sau khi tính toán k t qu b ng ph n m m Stagraphic 3.0 tìm đ c t l nguyên li u : dung môi thích h p.
Thí nghi m 2.3: Kh o sát nh h ng c a nhi t đ và th i gian đ n
hàm l ng polyphenol trong cao chi t a. M c đích
Ti n hành kh o sát kép hai y u t nhi t đ và th i gian nh m tìm đ c nhi t đ và th i gian t i u cho quá trình trích ly đ thu đ c hi u su t thu h i ho t ch t sinh h c polyphenol cao nh t.
b. B trí thí nghi m
B trí thí nghi m hai y u t v i C là nhi t đ trích ly bao g m 500C , 550C , 600C , 650C t ng ng v i C1, C2, C3, C4 và D là th i gian trích ly bao g m 80, 90,
100 phút t ng ng D1, D2, D3 b trí theo ki u hoàn toàn ng u nhiên v i 3 l n l p l i.
B ng 2.5: B ng b trí thí nghi m kh o sát nhi t đ - th i gian trích ly Nhi t đ C1 (500C) C2 (550C) C3 (600C) C4 (650C) Th i gian D1 (80 phút) C1D1 C2D1 C3D1 C4D1 D2 (90phút) C1D2 C2D2 C3D2 C4D2 D3 (100 phút) C1D3 C2D3 C3D3 C4D3 Ti n hành thí nghi m:
Hình 2.5: S đ b trí thí nghi m kh o sát nhi t đ - th i gian trích ly c. Cách ti n hành
Chu n b lá gai đ c hái t v n lá gai tr ng i h c M Tp. H Chí Minh,
c s 3 Bình D ng, l a ch n k , lá không b sâu hay vàng héo, b cu ng.
Chu n b 100 ml dung môi trích ly nh k t qu t thí nghi m 3.2.4.2 và s d ng t l nguyên li u/dung môi theo k t qu thí nghi m 3.2.4.3. Sau khi cân nguyên li u đ c ch n qua v i n c n c sôi trong 5 giây, xay nh , l n l t cho vào các becher đã chu n b s n. Ti n hành trích ly các th i gian và nhi t đ c n kh o sát nh b ng trên.
Sau đó, l i đem d t đi pha loãng 1000 l n nh thí nghi
Lá gai X lý Trích ly C1 C2 C3 C4 D1 D2 D3 o OD L c và thu d ch chi t D1 D2 D3 D1 D2 D3 D1 D2 D3
3.2.4.2 và ti n hành đo OD theo ph ng pháp đ nh l ng hàm l ng polyphenol c a d ch chi t nh ph l c.
Sau khi thu đ c k t qu đo OD thì ch n nghi m th c có k t qu cao nh t và có
khác bi t so v i nh ng nghi m th c còn l i.
Ti n hành th c hi n l p l i 3 l n m i nghi m th c và ghi nh n k t qu .
d. Cách đánh giá
Ch tiêu theo dõi: Hàm l ng Polyphenol t ng .
o hàm l ng ho t ch t sinh h c b ng ph ng pháp đ nh l ng hàm l ng
polyphenol t ng theo ph l c.
Sau khi tính toán k t qu b ng ph n m m Stagraphic 3.0 tìm đ c th i gian trích ly thích h p.
Thí nghi m 2.4: Nghiên c u ho t tính ch ng oxy hóa c a d ch chi t lá gai
a. M c đích
Kh o sát kh n ng ch ng oxy hóa c a lá gai.
b. Cách th c hi n
Chu n b các nghi m th c nh b ng sau:
B ng 2.6: B trí thí nghi m th ho t tính ch ng oxy hóa c a lá gai
ng nghi m 1 2 3 4 5 6 7 N ng đ m u (mg/ml) 1 0,5 0,25 0,125 0,0625 0,03125 0 Dd methanol (ml) 0 0 0 0 0 0 4 Dd m u th (ml) 4 4 4 4 4 4 0
Thêm 1ml dung d ch DPPH 0,2 mM, l c đ u, đ yên trong t i 30 phút
c. Cách ti n hành
Dung d ch DPPH: pha dung d ch DPPH 0,2 mM trong methanol.
M u th : Lá gai t i đ c trích ly nhi t đ 550C, t l nguyên li u/ dung môi 1/15 trong th i gian 90 phút v i ethanol đ thu d ch trích. Sau trích ly, l c thu d ch trích, cô quay b ng máy cô quay chân không nhi t đ 550C đ thu cao chi t lá gai. Hòa tan cao chi t b ng methanol v i các n ng đ pha loãng liên ti p: 1 mg/ml; 0,5 mg/ml; 0,25 mg/ml; 0,125 mg/ml; 0,0625 mg/ml và 0,03125 mg/ml
M u tr ng là dung d ch methanol thay cho dung d ch m u th
Ch ng d ng đ so sánh là Vitamin C pha thành các n ng đ 1; 0,5; 0,25;
0,125; 0,0625; 0,03125 mg/ml.
d. Cách đánh giá
Ch tiêu theo dõi: Kh n ng b t g c t do c a d ch chi t lá gai.
V đ th t ng quan gi a n ng đ m u th và kh n ng b t g c t do DPPH, tính IC50, ch ng d ng đ so sánh là Vitamin C.
Thí nghi m 2.5: Nghiên c u ho t tính kháng khu n c a cao chi t lá gai trên b n lo i vi khu n gây b nh ph bi n E.coli, S.typhi, S.aureus, P.aeruginosa
a. M c đích
Kh o sát kh n ng kháng khu n E.coli, S.typhi, S.aureus, P.aeruginosa c a d ch chi t.
b. Cách ti n hành
Chu n b các đ a môi tr ng NA và đánh s th t lên m i đ a. Chu n b các ng vi khu n và n c mu i sinh lý đã h p ti t trùng. Ti n hành pha loãng vi khu n đ đ c n ng đ 108 t bào/ml
Chu n b d ch chi t lá gai: chu n b 500 ml d ch lá gai v i các thông s trích ly là nhi t đ trích ly 550C, th i gian 90 phút, t l nguyên li u – dung môi 1:15, n ng đ dung môi c n 700, Sau khi thu đ c d ch chi t, ti n hành cô quay chân không lo i h t dung môi và thu d ch chi t.
Ti n hành dùng t m bông c y các vi khu n t các ng d ch khu n pha loãng
vào các đ a môi tr ng đã đánh d u. Sau đó, ti n hành đ c th ch, m i đ a 4 l . Dùng
micropipette hút 70µl d ch chi t lá gai cho vào các gi ng th ch trong đó có m t gi ng ch a m u đ i ch ng là n c. Nuôi vi khu n 37oC trong 12 - 24 gi và quan sát vòng kháng khu n.
c. Cách đánh giá
Ch tiêu theo dõi: vòng kháng khu n
o vòng kháng khu n và tính toán kh n ng kháng khu n c a d ch chi t ph
l c E.
2.2.4.3 Thí nghi m 3: Nghiên c u t l ph i tr n trà lá gai, c ng t đ n ch t l ng c m quan s n ph m cu i