Nghiên cứu đặc điểm di truyền của loại sâm mới Panaxsp. thu ở phong thổ Lai Châu

Vì vậy chúng tôi sử dụng phương pháp phân tích di truyền để định loại các mẫu sâm này dựa trên cơ sở so sánh trình tự ITS – rDNA, là vùng gen mang nhiều biến dị có khả năng bộc lộ quan h

Trang 1

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-o0o -

ĐỖ MINH THÀNH

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA LOẠI

SÂM MỚI PANAXSP THU Ở PHONG THỔ LAI CHÂU

Trang 2

MỞ ĐẦU

Nhân sâm được dùng trong y học phương Đông hàng ngàn năm nay Người Trung Quốc đã sử dụng nhân sâm từ hàng ngàn năm trước như một thứ dược liệu vô cùng chân quý chỉ có các vua chúa và các quan lớn mới có loại thảo dược này Tác dụng của nhân sâm được đề cập trong các trước tác của Shi You (khoảng những năm 48-33 TCN) hay Shanghan Lun (khoảng những năm 200 SCN)

Chi Nhân sâm (Panax L.) là một chi nhỏ trong họ Ngũ gia bì (Araliaceae) gồm 15 loài [14], tất cả đều có giá trị làm thuốc, một số loài

thuộc chi Panax L (Araliaceae) được sử dụng làm giá trị cao như Nhân sâm (Panax ginseng), Tam thất (Panax notoginseng) Ở Việt Nam, có một

số loài thuộc chi này như Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus), Tam thất hoang (Panax stipuleanatus) và Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis) [11] Các loài Panax bipinnatifidus thường phân bổ chủ yếu ở Trung Quốc, Ấn

Độ và Nepal Các loài này đang trong tình trạng nguy cấp, vốn hiếm gặp

trong tự nhiên lại bị săn tìm ráo riết để thu hái nên đang bị đe dọa tuyệt chủng Ở Việt Nam sâm Ngọc Linh đã được xác định là một cây thuốc quý

do có chứa nhiều thành phần saponin, hàm lượng acid amin, các chất khoáng vi lượng trong củ, lá và rễ hơn hẳn những loại sâm khác [16] Do vùng phân bố hạn chế và việc khai thác quá mức đã khiến sâm Ngọc Linh rơi vào nhóm đe dọa và loài này đã bị coi như tuyệt chủng ngoài tự nhiên

và hiện chỉ còn tồn tại ở một số vườn trồng tại các khu bảo tồn tại một số vườn trồng tại các khu bảo tồn của tỉnh Quảng Nam và Kon Tum, vì vậy việc nghiên cứu bảo tồn loài sâm này hết sức cấp bách Cho đến nay sâm Ngọc Linh vẫn được coi là loài đặc hữu hẹp, chỉ phân bố trên núi Ngọc Linh thuộc địa phân hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum với độ cao trên

Trang 3

1500m so với mặt biển [11], tuy nhiên Zhu và cộng sự [58] đã ghi nhận

Panax vietnamensis có phân bố ở Vân Nam, Trung Quốc nên chúng tôi đặt

khả năng loài này có thể phân bố ở các tỉnh vùng núi phía bắc của Việt Nam Năm 2012, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã phê duyệt đề tài thuộc 7 hướng KHCN ưu tiên cấp Viện KHCNVN “Nghiên cứu phân loại, phân bố và thành phần hóa học của cây Sâm mọc ở Lai Châu” mã số VAST 04.07/12-13 do Tiến sĩ Phan Kế Long làm chủ nhiệm với mục đích xác định tên khoa học và phân bố của loài sâm mọc tự nhiên ở Lai Châu và thành phần hóa học chủ yếu của nó Vì vậy chúng tôi sử dụng phương pháp phân tích di truyền để định loại các mẫu sâm này dựa trên cơ sở so sánh trình tự ITS – rDNA, là vùng gen mang nhiều biến dị có khả năng bộc lộ quan hệ giữa những loài có nguồn gốc tiến hóa gần gũi [56]

Trên có sở dự án trên, chúng tôi đã tiến hành Luận văn này được thực hiện trên cơ sở phân tích một số mẫu vật thu được trong đợt điều tra

khảo sát ở huyện Phong Thổ tỉnh Lai Châu của dự án trên với với tiêu đề:

“Nghiên cứu đặc điểm di truyền của loại sâm mới Panax sp ở huyện Phong Thổ tỉnh Lai Châu”

Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu đặc điểm sâm Panax sp (Araliaceae) ở huyện Phong

Thổ tỉnh Lai Châu dựa trên cơ sở so sánh trình tự ITS – rDNA, là vùng gen mang nhiều biến dị có khả năng bộc lộ quan hệ giữa những loài có nguồn gốc tiến hóa gần gũi

Nội dung nghiên cứu

- Thu thập mẫu Sâm mới Panax sp từ huyện Phong Thổ tỉnh Lai

Châu

- Tách DNA tổng số của các mẫu, nhân bản vùng gen ITS – rDNA

- Giải trình tự gen ITS – rDNA

Trang 4

- Phân tích số liệu: so sánh, phân tích các trình tự DNA của các mẫu

thu được và so sánh với Panax vietnamsis ở Quảng Nam, và các loài trong chi Panax

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Các nghiên cứu về chi sâm Panax và Sâm Ngọc Linh

1.1.1 Giới thiệu về chi sâm Panax

Chi Nhân sâm (Panax L.) là một chi nhỏ trong họ Ngũ gia bì (Araliaceae) Toàn bộ chi Sâm (Panax L.) trên thế giới hiện đã biết chắc chắn có 11 loài và 1 dưới loài (thứ -var.) Sự phân bố của chi Panax L trên

thế giới cho thấy chúng chỉ xuất hiện ở Bắc bán cầu, kéo dài từ vùng rừng núi giáp bờ biển phía Đông của Bắc Mỹ bao gồm Bắc Hoa Kỳ và Tây-Nam

Canada (có 2 loài P quinquefolius và P trifoliatus) [12, 42, 43] Vùng

Đông Bắc Á (gồm Viễn Đông Nga, Đông Bắc Trung Quốc, bán đảo Triều

Tiên và Nhật Bản) có 2 loài là P ginseng và P japonica Trung tâm phân

bố của chi Panax L có thể từ vùng Tây- Nam của Trung Quốc lan toả

xuống phía Bắc của Việt Nam Thực chất khu vực này gồm 2 tỉnh biên giới

kề nhau là Vân Nam (Trung Quốc) và Lào Cai (Việt Nam), ở đây đang có

tới 7 loài và dưới loài (thứ) mọc hoàn toàn tự nhiên, 2 loài trồng là P notoginseng (nhập từ Bắc Mỹ) và P pseudoginseng (không tìm thấy trong

hoang dại, nhưng giả thiết có nguồn gốc từ vùng cận Himalaya hoặc là kết quả của lai tự nhiên giữa 2 loài gần gũi nào đó) Đây có thể coi là trung tâm

phân bố của chi Sâm (Panax L.) của thế giới Ở Bắc Mỹ hiện có 3 loài (P notoginseng; P quinquefolius và P trifoliatus) Giới hạn cuối cùng về phía Nam của chi Panax L là loài Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis) ở Miền

Trung của Việt Nam, tại 14015’ vĩ độ Bắc

Trang 5

Hình 1.1: Nhân sâm Việt Nam – Panax vietnamensis

1.1.2 Hiện trạng của loài Sâm Việt Nam hiện nay

Ở Việt nam cho đến thời điểm hiện nay, chi Panax có chắc chắn 5

loài, trong đó có 2 loài nhập trồng là Tam thất (P.notoginseng) và Nhân sâm (P.ginseng) [12] Ba loài mọc tự nhiên và đang là đối tượng bảo tồn là Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.), Tam thất hoang (P stipuleanatus Tsai et Feng) và đặc biệt là Sâm Ngọc Linh (P vietnamensis

Ha et Grushv.) là loài đặc hữu hẹp của miền trung Việt Nam, có phân bố tự

Trang 6

Nam Trà My, huyện Phước Sơn (tỉnh Quảng Nam), trên vùng núi Ngọc Linh, độ cao trên 1500m Tuy nhiên hiện tại loài này đã trở nên cực hiếm ngoài tự nhiên, do tình trạng khai thác kiệt quệ trong nhiều năm cộng với việc đốt nương làm rẫy nên diện tích rừng tự nhiên cũng bị thu hẹp Hiện tại, sâm Ngọc Linh đã được đưa vào danh lục đỏ của IUCN (2003) và danh sách các loài hạn chế khai thác và sử dụng vì mục đích thương mại (nghị định 32/2006/NĐ-CP ngày 31.03.2006 về quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp quí hiếm) Hiện nay sâm Ngọc Linh chỉ còn tập trung tại 2 điểm bảo tồn là Chốt Sâm (xã Măng Ri, huyện Tu Mơ Rông, tỉnh Kon Tum) và Trạm Dược Liệu Trà Linh (xã Trà Linh, huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam) với tổng diện tích trồng khoảng 10 hecta

1.1.3 Tầm quan trọng và giá trị của cây Sâm

1.1.3.1 Tầm quan trọng và giá trị của cây Sâm trên Thế giới

Về mặt kinh tế, doanh thu hàng năm từ sâm vào khoảng 98 triệu USD và tăng trưởng ở mức 26%/năm [57] Tập đoàn Sâm Hàn Quốc (KGC) đã có kinh nghiệm sản xuất hồng sâm hơn 100 năm, tính riêng năm

2004 doanh thu từ các sản phẩm nhân sâm đã mang về cho tập đoàn khoảng 305 tỷ Won ($290 triệu USD), trong đó 70% là mỹ phẩm Cùng năm đó, xuất khẩu sản phẩm từ nhân sâm đạt 55 triệu USD, thị trường chủ yếu là Hồng Kông và Trung Quốc đại lục (27 triệu USD) [35] Virginia và Tây Virginia là nơi xuất khẩu sâm lớn nhất của Mỹ, chiếm khoảng 18% trong tổng số 27200 kg sản lượng sâm hàng năm của toàn quốc Trong 3 năm (2004-2006) ngành nông nghiệp Mỹ chứng nhận việc xuất khẩu hàng năm tương ứng đạt 1800 kg, 2270 kg và 1633 kg đem lại gần 1 triệu USD

[35]

1.1.3.2 Tầm quan trọng và giá trị của cây Sâm ở Việt Nam

Tất cả những loài thuộc chi Panax đều có giá trị làm thuốc, một số loài của chi này đã trở thành những cây thuốc nổi tiếng, không chỉ trong phạm vi của nền y học cổ truyền phương Đông mà trên toàn thế giới như

Nhân sâm (Panax ginseng); Giả nhân sâm (P pseudoginseng); Tây dương sâm (P quiquefolius); Tam thất (P notoginseng) [5,17] và sâm Ngọc Linh

Trang 7

(P vietnamensis Ha et Grushv.) Ở Việt Nam, ngay từ những năm kháng

chiến chống Pháp (1952 - 1953) nhiều cán bộ cách mạng hoạt động nằm vùng ở Quảng Nam đã được đồng bào chỉ cho cây thuốc như một thứ thần dược để phòng thân những khi đau yếu, dùng để chữa cho người đau ốm nặng, người bị rắn cắn và các bệnh thông thường như đau bụng, cầm máu vết thương

Theo quan điểm hoá phân loại và dược lý học, những công trình nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới đã chia 12 loài thuộc chi

Panax thành 2 nhóm chính:

- Nhóm 1 gồm các loài có giá trị, hiện đã được phát triển trồng trọt gồm:

Nhân sâm (Panax ginseng), sâm Mỹ (P quinquefolius) và Tam thất (P notoginseng), có bộ phận dưới mặt đất là một rễ củ dạng cà rốt phát triển và

chứa các saponin có khung thuộc nhóm dammaran

- Nhóm 2 gồm các loài mọc hoang như P japonicus, P zingiberensis, P stipuleanatus với bộ phận thân rễ dưới đất rất phát triển theo hướng nắm

ngang, chứa saponin có khung cấu tạo thuộc nhóm olean

Tuy nhiên, hàm lượng saponin của sâm Ngọc Linh so với các loài

Panax trồng trọt thuộc nhóm 1 lại cao hơn rất nhiều

Từ năm 1985 đến năm 2000, thông qua sự hợp tác quốc tế hiệu quả, đặc biệt với các nhà khoa học Ba Lan, Nhật Bản đã cho thấy sâm Ngọc Linh có 52 hợp chất saponin, trong đó có 24 saponin đã được xác định là có cấu trúc hoàn toàn mới, lần đầu tiên được công bố Khi so sánh

với nhóm sâm trồng có giá trị trên thế giới như Nhân sâm (Panax ginseng), Sâm Mỹ (P quinquefolius) và Tam thất (P notoginseng) thì thành phần

saponin của sâm Ngọc Linh rất giống với 3 loài nói trên, nhưng hàm lượng lại cao hơn nhiều Điều này càng khẳng định Sâm ngọc linh là một loài độc

đáo về thành phần hoá học [7]

1.2 Sâm Ngọc Linh

1.2.1 Đặc điểm phân loại

Trang 8

Sâm Ngọc Linh là một loại cây thân thảo, sống nhiều năm, cao đến 1m Thân rễ mập có đường kính 3,5cm, không có rễ phụ dầy dự trữ, đôi khi

ở một số cây phần cuối thân rễ có củ gần hình cầu, đường kính đến 5cm

Đốt trên cùng của thân rễ tồn tại 1-4 thân Thân nhẵn cao 40-80 cm, rỗng, có 3 mặt hơi tròn có những rãnh nhỏ theo chiều dọc Lá mọc vòng, thường có 4 (ít khi 3, 5, 6) Lá kép chân vịt có 5 (ít khi 6, 7) lá chét, lá dài 7- 12cm (ít khi 15 cm) Lá chét trên cùng hình trứng ngược hoặc hình mũi mác, dài 8- 14 cm, rộng 3- 5 cm, đầu lá thường nhọn đột ngột, mũi nhọn kéo 1,5- 2 cm, góc lá hình nêm, mép lá có răng cưa nhỏ đều, gân bên 19 (ít khi 8- 11) cặp dọc theo gân chính và gân bên ở mặt trên của lá chét có nhiều lông cứng dạng gai dài đến 3 mm, mặt dưới ít hơn Cụm hoa dài 25

cm, gấp 1,5- 2 lần chiều dài của cuống lá, thường mang tán đơn độc ở tậ cùng, đôi khi có thêm 1- 4 tán phụ hoặc một hoa đơn độc Tán hoa chính đường kính 2,5- 4 cm, có 50- 120 hoa Hoa mầu vàng lục nhạt, đường kính hoa nở 3- 4 mm Bầu 1 ô, 1 vòi (chiếm 80%) đôi khi có 2 ô, 2 vòi (chiếm 20%) Quả khi chín màu đỏ, thường có một chấm đen ở trên đỉnh quả Quả

1 hạt hình thân, quả 2 hạt hình cầu hơi dẹt dài 7- 10 mm rộng 4- 6 mm (Hình 1.2) [1]

Trang 9

Hình 1.2 Sâm Ngọc Linh Mọc dưới tán rừng ẩm, nhiều mùn, thích hợp với nhiệt độ ban ngày từ 20°C-25°C, ban đêm 15°C-18°C, sâm Ngọc Linh có thể sống rất lâu, thậm chí trên 100 năm, sinh trưởng khá chậm Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu

là thân rễ, củ và ngoài ra cũng có thể dùng lá và rễ con Vào đầu tháng 1 hàng năm, sâm xuất hiện chồi mới sau mùa ngủ đông, thân khí sinh lớn dần lên thành cây sâm trưởng thành có 1 tán hoa Từ tháng 4 đến tháng 6, cây

nở hoa và kết quả Tháng 7 bắt đầu có quả chín và kéo dài đến tháng 9 Cuối tháng 10, phần thân khí sinh tàn lụi dần, lá rụng, để lại một vết sẹo ở đầu củ sâm và cây bắt đầu giai đoạn ngủ đông hết tháng 12 Chính căn cứ vào vết sẹo trên đầu củ mỗi mùa đông đến mà người ta có thể nhận biết cây sâm bao nhiêu tuổi, phải ít nhất 3 năm tuổi tức trên củ có một sẹo (sau 3 năm đầu sâm chỉ rụng một lá) mới có thể khai thác, khuyến cáo là trên 5 năm tuổi Mùa đông cũng là mùa thu hoạch tốt nhất phần thân rễ của sâm [62]

1.2.2 Đặc điểm phân bố

Trang 10

Cây sâm được phát hiện ở độ cao từ 1.200m trở lên (có tài liệu cho biết cao độ tìm thấy sâm Ngọc Linh là khoảng 1.500m), đạt mật độ cao nhất ở khoảng từ 1.700-2.000m dưới tán rừng già, và cho tới nay chỉ có hai tỉnh Kon Tum và Quảng Nam là có cây sâm này Sâm mọc tập trung dưới chân núi Ngọc Linh, một ngọn núi cao 2.578m với lớp đất vàng đỏ trên đá granit dày trên 50cm, có độ mùn cao, tơi xốp và rừng nguyên sinh còn rộng, nên được gọi là sâm Ngọc Linh, tuy những nghiên cứu thực địa mới nhất cho thấy sâm còn mọc cả ở núi Ngọc Lum Heo thuộc xã Phước Lộc, huyện Phước Sơn, tỉnh Quảng Nam, đỉnh núi Ngọc Am thuộc Quảng Nam, Đắc Glây thuộc Kontum, núi Langbian ở Lạc Dương tỉnh Lâm Đồng cũng rất có thể có loại sâm này [62]

1.2.3 Thành phần hóa học

Từ 1974 đến 1990 Nguyễn Thời Nhâm và cộng sự đã ghiên cứu

nhân sâm Việt Nam, so sánh với nhân sâm Triều Tiên (Panax ginseng), nhân sâm Nhật Bản (Panax japonicus) và nhân sâm Hoa Kỳ (Panax quinquefollium) [1] Kết quả có thể tóm tắt như sau:

Bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKIM) đã phát hiện trong

Panax vietnamensis (PV) 15 vết saponin có giá trị Rf và mầu sắc tương ứng với 12 hợp chất saponin của Panax ginseng Chi tiết hơn nữa trong

PV có hàm lượng cao chất saponin kiểu damarane (7,58%), trong đó saponin thuộc diol và triol có tỷ lệ 3,32% và một lượng nhỏ saponin của axit oleanolic Do đặc điểm này, Tanaka xếp nhân sâm Việt Nam vào nhóm B- (Trước đây chỉ có nhân sâm triều Tiên và nhân sâm Hoa Kỳ được xếp vào nhóm này) [1] Điều này trái lại với qui luật chung là thông thường các cây hân sâm cho thân rễ phát triển thì thường chứa lượng saponin của axit oleanolic và lượng nhóm saponin damarane

Trang 11

Cũng là lần đầu tiên trên thế giới, người ta chiết được một hàm

lượng lớn majonozit R2 và ocotillol saponin trong cùng một loại Panax

(chỉ riêng hai chất này đã chiếm 4,34%) gấp 43 lần hàm lượng majonozit

và ocotillol saponin cao nhất có trong cây Panax Ocotillol saponin đã trở

thành một hợp chất cần được chú ý có thể đưa thành tiêu chuẩn để phân

loại hóa học cho các cây Panax vì nó có thể ảnh hưởng đế một số tác dụng mang tính đặc thù của Panax Việt Nam

Sự có mặt của damarane saponin kiểu ocotillol cũng còn là làm cho nhân sâm Việt Nam khác với nhân sâm Triều Tiên, vì cho tới nay người ta chưa tìm thấy ocotillol trong nhân sâm Triều Tiên

Năm 1994, Nguyễn Minh Đức còn chứng minh nhân sâm Việt Nam

có hàm lượng saponin, damarane cao nhất (12- 15%) so với nhân sâm khác chỉ chứa 10% và số lượng saponin nhiều nhất (49%) so với 26% trong nhân sâm Triều Tiên [1]

Ngoài những saponin nói trên, trong nhân sâm Việt Nam còn chứa các polyacetylen, axit béo, axit amin, gluxit, tinh dầu và một số yếu tố vi

Trang 12

Những thí nghiệm tác dụng trên thần kinh trung ương, tác dụng tăng lực, tăng sức bền của cơ thể, trên nội tiết sinh dục, trên hệ tim mạch… đều cho những kết quả hay gần tương đương với khi thí nghiệm Nhân sâm Triều Tiên Tuy nhiên Nhân sâm Việt Nam không gây tăng huyết áp như nhân sâm Triều Tiên Tác dụng này làm tác dụng Nhân sâm Việt Nam giống tam thất hơn

Mặc dù theo báo cáo của trung tâm nghiên cứu sâm Việt Nam, những kết quả nghiên cứu về hóa học và dược lý nói trên được những nhà nghiên cứu nước ngoài, đặc biệt Nhật Bản chú ý, nhưng chúng tôi cũng ghi lại đây một số khác biệt giữa cách đánh giá của hai nền y học cổ truyền dân tộc với các nhà y dược hiện đại: Theo những nhà y học cổ truyền, khi nếm

vị nhân sâm Triều Tiên, nhất là khi nếm củ sâm, trước hết phải thấy vị ngọt (tiền cam, hậu khổ, hậu cam, cam) khi đang mệt, ngậm một miếng sâm trong miệng một lúc, thấy hết mệt liền, trong người thấy khoan khoái Còn Nhân sâm Việt Nam ta, khi nếm thì đầu tiên thấy đắng, sau vẫn thấy đắng, đắng (tiền khổ, hậu khổ, hậu khổ khổ) Hãm hay sắc củ nhân sâm Việt Nam rồi ta ngậm hay uống hầu như không thấy cảm giác khoan khoái Đó là một điều mà các nhà khoa học hiện đại cần tìm cho ra: Do cách chế biến chưa đúng hay các hoạt chất trong củ nhân sâm của ta hiện còn bị một thứ men nào che lấp, không cho thể hiện ngay như củ nhân sâm Triều Tiên Hiện nay các nhà bào chế phải phối hợp nhân sâm Việt Nam với một vị thuốc khác để sử dụng được phần tác dụng tốt của nhân sâm Việt Nam, đồng thời che lấp những nguyên nhân cản trở mà chúng ta chưa tìm ra được [1]

1.3 Một số phương pháp phân loại thực vật

Trang 13

Hiện nay, phương pháp phân loại thực vật đều dựa trên nguyên tắc chung đó là những thực vật có chung nguồn gốc thì có những tính chất giống nhau, thực vật càng gần nhau tính chất giống nhau càng nhiều Sự giống nhau có thể về đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh lý sinh hoá , một

số phương pháp thường được sử dụng như:

1.3.1 Phương pháp hình thái học (phân loại học truyền thống)

Dựa vào đặc điểm hình thái, đặc biệt là hình thái cơ quan sinh sản, vì

cơ quan này ít biến đổi hơn so với cơ quan sinh dưỡng khi điều kiện môi trường thay đổi Những thực vật càng gần nhau càng có nhiều đặc điểm chung về hình thái Đây là phương pháp cổ điển nhưng hiện nay vẫn được dùng phổ biến [10], hạn chế của phương pháp này đã được ghi nhận trên một số taxa, thực tế nhiều loài khác nhau nhưng có hình thái rất giống nhau

và ngược lại Phương pháp phân loại hình thái thực sự gặp khó khăn khi phân loại ở các đơn vị taxon dưới loài [2]

Phân loại học truyền thống sử dụng chủ yếu các đặc điểm hình thái nhưng các tính trạng hình thái thường biến đổi rất phức tạp, nên đôi khi việc xác định sự tương đồng là rất khó Hiện tượng tiến hoá hội tụ, tiến hoá song song và tiến hoá ngược dẫn đến các đặc điểm tương tự giữa các loài

có họ hàng rất xa nhau, nghĩa là các đặc điểm giống nhau do tiến hoá độc lập từ các nguồn gốc khác nhau để thích nghi với điều kiện môi trường giống nhau là khá phổ biến trong sinh giới Việc phân biệt đặc điểm tương đồng với đặc điểm tương tự trong hệ thống học truyền thống là không dễ dàng, nhất là ở các bậc phân loại thấp Ngoài ra, việc so sánh trực tiếp giữa các bậc phân loại cao là rất khó, vì nhiều đặc điểm không còn khả năng xác định được sự tương đồng Vì vậy hệ thống học truyền thống phải sử dụng các đặc điểm, các khoá định loại riêng cho những nhóm sinh vật nhất định

Ưu điểm lớn nhất của hệ thống học truyền thống là có lịch sử phát triển lâu

Trang 14

dài và đã xây dựng được một hệ thống phân loại sinh vật tương đối đầy đủ, tiện lợi trong nghiên cứu ứng dụng Nhưng hệ thống học truyền thống có nhược điểm là thiếu tính thống nhất, phải sử dụng nhiều tiêu chuần và nhiều khoá phân loại khác nhau, nên bị hạn chế khi nghiên cứu các biến đổi tiến hoá nhỏ, khó xác định chính xác mối quan hệ giữa các nhóm sinh vật ở bậc phân loại thấp như loài và dưới loài [2]

1.3.2 Phương pháp giải phẫu so sánh

Đến thế kỷ XIX, nhờ sự phát triển của kính hiển vi mà giải phẫu học thực vật có điều kiện phát triển Ngoài những đặc điểm hình thái bên ngoài, các nhà phân loại học còn sử dụng cả những đặc điểm hình thái giải phẫu hay vi hình thái (micromorphologie), tức là hình thái cấu trúc bên trong cơ thể, của mô, của tế bào, kể cả cấu trúc siêu hiển vi, để phân loại Việc sử dụng phương pháp này đã nhận được các kết quả nghiên cứu chính xác và khách quan cho phân loại thực vật Các đặc điểm giải phẫu so sánh cho phép xác lập mối quan hệ gần gũi không những của các nhóm lớn, mà cả của các bậc taxon nhỏ, có thể xây dựng được những tiêu chuẩn phân loại cho các chi, các loài thuộc họ Labiaceae [39]

Phương pháp giải phẫu so sánh không đòi hỏi kỹ thuật quá phức tạp nhưng cho kết quả khá chính xác Đối với các loài cây gỗ thường sử dụng đặc điểm giải phẫu thân gỗ để định loại, ngược lại các loài thân thảo thường sử dụng đặc điểm cấu trúc của biểu bì Phương pháp này được sử dụng để định loại gỗ và các thanh gỗ thành phẩm dùng để xuất khẩu

Trang 15

dùng phương pháp sắc ký lớp mỏng, sắc ký cao áp, điện di mao quản, sắc

kí khí - khối phổ… đặc điểm chung của phương pháp hóa học là cho kết quả nhanh, chính xác và có thể cho các thông số về cấu trúc hoá học Ưu điểm của phương pháp này là yêu cầu về tính nguyên vẹn của mẫu vật không cao Trên thế giới, phương pháp này đang được sử dụng nhiều Ở nước ta, phương pháp này mới chỉ được bắt đầu nghiên cứu ở một vài cơ sở[40]

1.3.4 Phương pháp phân loại học phân tử

Phân loại học phân tử là phương pháp phân loại sử dụng sự khác biệt các cấu trúc phân tử để đạt được các thông tin về mối quan hệ tiến hoá giữa các loài Kết quả của một phân tích hệ thống phân tử được thể hiện bằng cây phát sinh loài Phương pháp phân loại phân tử ra đời vào những năm

1960 với các nghiên cứu của Emile và công sự (1999), Zuckerkandl , Emanuel Margoliash , Linus Pauling và Walter M Fitch Những nghiên cứu hệ thống học phân tử được thực hiện đầu tiên của tác giả Charles G Sibley (nghiên cứu về chim), Herbert và cộng sự (nghiên cứu về lưỡng cư)

và Morris Goodman (nghiên cứu về linh trưởng) [30,44,45,46] được phát triển tiếp bởi các nhà nghiên cứu Allan C Wilson, Robert K Selander, John C Avise và đã thu được những thành công lớn, làm sáng tỏ nhiều vấn

đề trong phân loại và tiến hoá [20,22,24,29] Phân loại học phân tử được sử dụng ban đầu là phân tử protein, với kỹ thuật điện di protein Mặc dù khi thực hiện cách này đã không đem lại nhiều hiệu quả xong đã thúc đẩy sự phát triển của phân loại học phân tử Giai đoạn từ 1974 – 1986, phân loại học phân tử chuyển sang sử dụng các đặc điểm của vật chất di truyền (DNA) với kỹ thuật ứng dụng lai DNA – DNA, tiếp đến là các kỹ thuật phân tích bằng enzyme giới hạn và cuối cùng là kỹ thuật đọc trình tự DNA [20,23]

Trang 16

Nguyên lý của phân loại học phân tử: Phân loại học phân tử dựa trên

nguyên lý mỗi sinh vật sống đều mang các phân tử DNA, RNA và protein, các sinh vật có họ hàng gần gũi sẽ có mức độ tương đồng cao trong cấu trúc phân tử những chất này, ngược lại những sinh vật có họ hàng xa nhau

sẽ cho thấy những đặc điểm cấu trúc khác nhau Hiện nay, các phân tử có tính bảo thủ như DNA ty thể, DNA lục lạp đang được sử dụng nhiều nhất cho phân loại và được coi là tích luỹ các đột biến theo thời gian Thêm vào

đó nếu coi tốc độ đột biến không đổi, chúng ta sẽ tạo ra được một đồng hồ phân tử cho biết thời gian diễn ra các đột biến, nói cách khác chúng ta có thể ước lượng được thời gian hình thành loài Mặc dù phân loại học phân tử

là phương pháp phân loại sử dụng đặc điểm cấu trúc của các phân tử để xây dựng hệ thống phát sinh chủng loại, tuy nhiên mãi cho đến những thập kỷ gần đây, con người mới có khả năng tách chiết và xác định được cấu trúc phân tử của những chất này

Sự ra đời của kỹ thuật giải trình tự DNA của Maxam – Gilbert (1977, 1980) và Singer (1977) [23] đã mở ra một ứng dụng to lớn cho phân loại học phân tử Hiện nay phân tích hay được sử dụng trong phân loại học phân

tử là so sánh trình tự DNA, sử dụng kỹ thuật sắp xếp phân tử (alignment)

để xác định mức độ giống nhau Các biến đổi phân tử đơn giản hơn nhiều

so với các biến đổi hình thái, vì vật chất di truyền DNA chỉ cấu thành từ 4 loại nucleotide (adenine, guanine, thymine và cytosine) Mặc khác, các biến đổi phân tử ít bị ảnh hưởng bởi các điều kiện môi trường Ưu thế lớn nhất của hệ thống học phân tử là có thể phân biệt rõ ràng các đặc điểm tương đồng với đặc điểm tương tự [23] Ngoài ra, nhiều phần của vật chất

di truyền có nguồn gốc và kiểu biến đổi chung cho mọi sinh vật, nên có thể

so sánh trực tiếp bất kể nhóm sinh vật nào với nhau Các biến đổi tiến hoá nhỏ (microevolution), hay đa dạng di truyền giữa các quần thể sinh vật

Trang 17

Tính thống nhất cao là một trong những ưu điểm của hệ thống học phân tử, sử dụng tiêu chuẩn phân tử chung cho cả sinh giới, có lợi thế trong nghiên cứu biến đổi tiến hoá nhỏ, nên số liệu phân tử có giá trị cao trong phân tích quan hệ phát sinh chủng loại giữa các taxon ở bậc phân loại thấp, cũng như đa dạng di truyền quần thể Nhược điểm chính của hệ thống học phân tử là không tiện dụng khi nghiên cứu và ứng dụng trong tự nhiên và hiện chưa hình thành một hệ thống phân loại riêng

Sự kết hợp giữa hai hệ thống phân loại phân tử và phân loại truyền thống sẽ đem lại kết quả tốt nhất Thực tế cũng chứng minh rằng hầu hết những gì hệ thống học truyền thống đã giải quyết tốt, đều không mâu thuẫn với các kết quả nghiên cứu của hệ thống học phân tử [23] Phân tích phân

tử thường được sử dụng để giải quyết một số vấn đề mà hệ thống học truyền thống còn gặp khó khăn, trong khi chỉ thị phân tử có lợi thế hơn Hiện tại, hệ thống học phân tử là phương pháp hữu hiệu hỗ trợ cho phương pháp phân loại truyền thống và cho kết quả khá tin cậy

1.4 Hệ gen sử dụng trong nghiên cứu phân loại phân tử ở thực vật

1.4.1 Cấu trúc hệ gen lục lạp

Lục lạp là bào quan nằm trong tế bào chất của thực vật và tảo (algae), chúng có chứa DNA riêng DNA lục lạp có từ 102 – 104 bản sao trong mỗi tế bào Lục lạp có chứa chất diệp lục (chlorophyll) và là nơi thực hiện quá trình quang hợp của cây Genome lục lạp thường được sử dụng cho phân loại ở thực vật do đặc tính di truyền theo dòng mẹ, không bị tái tổ hợp di truyền cho thế hệ sau và tốc độ đột biến cũng khá cao Hệ gen lục lạp được các nhà phân loại học phân tử đánh giá chúng là sự tích luỹ các đột biến theo thời gian, do vậy sẽ phản ánh đúng mức độ tiến hoá giữa các loài

Trang 18

Hình 1.3: Hệ gen lục lạp [41]

Genome lục lạp (cpDNA) thực chất là một phân tử DNA vòng, sợi đơn, mỗi gen thường không lặp lại Không giống như các gen nhân, các gen lục lạp chỉ mã hoá cho các protein cần thiết cho chức năng quang hợp

và bộ máy biểu hiện những protein này Vùng DNA không mã hoá trên hệ gen lục lạp là rất ít

Genome lục lạp (cpDNA) có kích thước từ 120 kb – 220 kb (hình 1.3), kích thước này thay đổi do có sự tồn tại của 2 vùng lặp lại ngược chiều nhau (Inverted repeat), tách genome lục lạp thành hai vùng (vùng lớn LSC

và vùng nhỏ SSC) Mặc dù phần lớn DNA lục lạp đều mang số lượng gen như nhau, tuy nhiên đôi khi một số gen di trú vào DNA nhân và biến mất khỏi hệ gen lục lạp Các gen lục lạp có tốc độ đột biến thấp hơn từ 4 – 5 lần

so với gen trong nhân, nhưng nhanh hơn khoảng ba lần so với DNA ty thể thực vật và thường xuyên được sử dụng trong nghiên cứu phân loại [23] Hiện nay, các gen lục lạp thường được sử dụng trong nghiên cứu hệ

thống học phân tử thực vật bao gồm: gen matK, gen trnL, vùng đệm psbA -

Trang 19

trnH, tất cả các gen thuộc hệ gen lục lạp thường có mức độ biến đổi không

lớn hơn 2% giữa các loài lân cận

Vùng đệm psbA - trnH: thường được sử dụng cho nghiên cứu phân

loại Vùng này có kích thức xấp xỉ 450bp, xác suất nhân bản thành công rất cao (100% với các loài đã được nghiên cứu) Mức độ khác biệt trình tự nucleotide giữa các loài là 1,24% và sự khác biệt bên trong loài rất thấp từ

0.00% – 0.08% [40] Trình tự psbA - trnH cũng đã được công bố trên ngân

hàng gen với nhiều loài khác nhau thuộc thực vật hạt trần, dương xỉ, rêu và rêu tản (liverwort)

Gen matK (MaturaseK): cùng với vùng đệm psbA - trnH đã được đề

xuất làm DNA barcoding cho nhóm thực vật có hoa Kết quả sử dụng gen

matK cho phân loại đã thu được sự tương đồng rất cao với phân loại hình

thái và cho giá trị bootstrap từ 92 – 100% [ 47,48]

Gen trnL: Là gen mã hoá cho tRNA vận chuyển Leucine trong lục

lạp, có kích thước từ 452bp đến 528bp với các loài thuộc họ đâu Gen này được sử dụng nhiều trong nghiên cứu phân loại phân tử [39,46,65] Các kết quả thu được trong các nghiên cứu nguồn gốc phát sinh loài sử dụng gen

trnL cho thấy đây là một vùng DNA hữu ích cho phân loại

Gen rbcL (Ribulose – 1,5 – Bisphosphate Carboxylase)

Ribulose – 1,5 – Bisphosphate Carboxylase/oxygenase (Rubisco) là protein đệm trong lục lạp Protein này có 8 tiểu phần lớn (55 kDa) và 8 tiểu phần nhỏ (12 kDa) giống nhau Các tiểu phần lớn được mã hoá bằng gen

lục lạp (rbcL), còn các tiểu phần nhỏ mã hoá bằng gen nhân Riêng đối với

tảo nâu và tảo đỏ đã phát hiện thấy gen lục lạp mã hoá cho tiểu phần nhỏ

Các gen rbcL ở thực vật bậc cao không có intron Các gen này được dùng

nhiều trong nghiên cứu mối quan hệ phát sinh chủng loại

Trang 20

Ngoài các locus được nêu trên, các vùng DNA: gen rbcL, vùng đệm trnL – trnF, trnT – trnL thuộc hệ gen lục lạp cũng thường được sử dụng

cho phân tích Việc sử dụng mỗi đoạn gen cho những ưu nhược điểm khác nhau, kết quả phân loại sẽ chính xác hơn khi phân tích tổ hợp nhiều gen

1.4.2 Vùng ITS

Vùng gen ITS: vùng ITS (internal transcribed spacer) của gen mã hoá

cho ribosome gồm các đơn vị gen 18S, 5,8S và 26S (hình 1.4) Giữa các đơn vị gen có các đoạn ITS-1 và ITS-2, các thành phần này tạo thành một nhóm gen cơ bản Các nhóm gen như vậy lặp lại liên tục trong hàng nghìn bản sao trong hệ gen nhân và chúng được ngăn cách bởi vùng NTS (nontranscribed spacer) (hình 1.4)

Hình 1.4: Sơ đồ vùng gen ITS Trong các nghiên cứu phân loại thực vật ở mức độ loài, vùng ITS là locus được giải mã phổ biến nhất [28] Vùng ITS cho thấy có sự hiệu quả cao trong nghiên cứu phân loại nhiều đối tượng thực vật và nấm (ngoại trừ dương xỉ), và đây là một locus được kiến nghị làm vùng DNA barcode cho thực vật (kỹ thuật nhận biết các loài sử dụng trình tự DNA ngắn) Ở mức

độ loài, vùng ITS có mức độ đa dạng cao (khoảng 13,6% giữa các loài gần

Trang 21

gũi) và đã được chứng minh trong hầu hết các nghiên cứu Thuận lợi của vùng ITS là có thể nhân bản theo hai đoạn nhỏ hơn (ITS1 và ITS2) nằm hai bên với locus 5,8S, điều này rất có ý nghĩa khi nhân bản các mẫu bị hư hại Vùng ITS cũng đã được chứng minh có mức độ biến đổi thấp bên trong loài [27,28]

Ngày nay với sự hiện diện của trên 60.000 trình tự ITS (tính đến 8/2010) được công bố trên ngân hàng Genbank, đây là nguồn tư liệu có giá trị, mở ra những triển vọng lớn cho nghiên cứu phân loại và giám định, số lượng các trình tự vẫn tiếp tục được bổ sung hàng ngày

1.5 Một số kỹ thuật sinh học phân tử dùng trong nghiên cứu phân loại

1.5.1 Một số thành tựu nghiên cứu về phân loại học phân tử

 Ngoài nước: trong những năm gần đây, kỹ thuật sinh học phân tử

đang được áp dụng rộng rãi, có hiệu quả trong nghiên cứu tiến hoá, phân loại và đa dạng di truyền quần thể sinh vật Phương pháp chủ yếu dựa trên

kỹ thuật phân tích DNA Các chỉ thị AFLP (đa hình các đoạn nhân chọn lọc), RFLP (đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn), RAPD (đa hình các đoạn được nhân bản ngẫu nhiên), SSR (DNA vệ tinh hay trình tự lặp lại đơn giản), cpSSR (trình tự lặp lại đơn giản genome lục lạp), gen mã hoá 18S rRNA,… hay được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền, nhận dạng các đoạn DNA hoặc các trình tự đặc trưng cho loài [8] Với số lượng bản sao lớn trong hệ gen là điều kiện thuận lợi cho kỹ thuật PCR (phản ứng

chuỗi polymerase) với các cặp mồi (primers) thích hợp

Vì thế chỉ trong vài thập kỷ, cơ sở dữ liệu gen (GenBank, 2007) đã lưu giữ trên 70 triệu trình tự DNA với gần 90 tỷ nucleotit Đây là nguồn

dữ liệu có giá trị trong sinh học bảo tồn (Conservation biology) vì bốn lý

do chính là (1) số liệu về trình tự các nucleotit rất có giá trị trong việc xác

Trang 22

định các đơn vị bảo tồn giúp cho đánh giá sắp xếp phân loại, nhất là bậc loài và dưới loài; (2) số liệu trình tự nucleotit đảm bảo độ chính xác cao nên tạo cơ sở khoa học tốt nhất cho bảo tồn đa dạng di truyền, trong nghiên cứu di truyền quần thể (population genetics), vì nó bộc lộ rõ các biến đổi di truyền ở trong và giữa các quần thể, giữa các cá thể, giữa cha

mẹ và con cái ; (3) kết quả phân tích DNA cho phép xác định chính xác loài, quần thể cho đến tận cá thể từ các mẫu vật không còn nguyên vẹn mà vẫn xác định thấy hiện tượng tạp lai giữa các loài, các quần thể địa lý…;

và (4) kết quả nghiên cứu DNA không bị ảnh hưởng vào bất cứ yếu tố khách quan do môi trường hay con người gây ra

Vì các giá trị khoa học nêu trên, đến nay kỹ thuật sinh học phân tử đang là công cụ hỗ trợ đắc lực cho các nhà nghiên cứu trong việc phát hiện các loài mới, giải quyết các nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy

đủ về tính đa dạng di truyền, quan hệ chủng loại và mức độ tiến hoá của

nhiếu loài động thực vật và vi sinh vật [23] Các kết quả nghiên cứu ở

mức độ DNA đã và đang góp phần đánh giá tính đa dạng sinh học, định hướng khoa học cho việc bảo tồn và khai thác một cách hợp lý nguồn tài nguyên sinh vật trên thế giới cũng như ở Việt Nam [52]

Do có giá trị sử dụng và thương mại lớn, nên nghiên cứu đa dạng di truyền đối với một số loài cây gỗ quý của chi Dalbergia sử dụng các chỉ thị RAPD, cpSSR, AFLP cũng được nhiều quốc gia quan tâm nghiên cứu Chẳng hạn, Olivarimbola và cộng sự (2004) [21] đã dựng mối quan hệ di

truyền của 122 cá thể loài Dalbergia monticola của Madagascar bằng việc

phân tích với 60 chỉ thị RAPD và 03 chỉ thị cpSSR, kết quả nhận được cho thấy các quần thể cây ở vùng trung tâm phía Bắc có nguồn gốc từ vùng Holocene của phía Nam Tương tự, các nhóm tác giả ở Pháp, Ấn Độ, Brasil cũng đã sử dụng các chỉ thị RAPD, SSR để nghiên cứu mối quan

hệ di truyền giữa các loài, các quần thể và xác định trình tự các đoạn gen

Trang 23

đặc trưng cho một số loài cây thân gỗ thuộc chi Dalbergia (Subhash et al., 2004) [26,37,56,67] Vì thế, riêng đối với chi Dalbergia trong ngân hàng Genbank cũng đã lưu giữ hàng trăm trình tự nucleotit đặc trưng cho một số

loài ở một số quốc gia (trang Web NCBI) Đây là nguồn dữ liệu có giá trị

để chúng tôi có thể khai thác ứng dụng cho nghiên cứu chi này của Việt Nam

 Trong nước: nhìn chung, các nghiên cứu về đa dạng di truyền phục

vụ công tác bảo tồn đa dạng sinh học và tái tạo nguồn gen đã được thế giới quan tâm và phát triển Theo hướng này, các nhà nghiên cứu trong nước cũng đã từng bước tiếp cận Tuy nhiên, nghiên cứu xây dựng cơ sở dữ liệu DNA có tính hệ thống cao mới được thực hiện tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật cho một số loài động vật quý hiếm Còn đối với thực vật thì hầu như chưa có, hơn nữa trong thực tế, sự tồn tại phân bố của nhiều loài ở dạng biệt lập, nên chứa đựng tính đa dạng nguồn gen rất lớn mà chưa được nghiên cứu

Vài năm trở lại đây, nghiên cứu đa dạng DNA ở thực vật đã và đang được tiến hành nghiên cứu ở Viện Công nghệ sinh học, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, Trường Đại học Lâm nghiệp và Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, nhưng mới chỉ tập trung được vào vài đối tượng cây trồng (cây lạc, lúa, một số loài hoa lan, một số loài thuộc chi họ Dầu, Vạn tuế, Bách xanh và Giổi) Mặc dù các nghiên cứu mới chỉ tập trung vào việc đánh giá

đa dạng di truyền quần thể nhưng cũng rất có giá trị cho nghiên cứu bảo tồn, tiến hoá và tái tạo nguồn gen

Gần đây, việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền, phân loại và nhận dạng mẫu sinh vật ở Việt Nam cũng đã đạt được nhiều kết quả có giá trị Đối với một số loài động thực

Trang 24

vật là nhóm nghiên cứu của Nông Văn Hải [8] đã dùng gen ty thể (18S rRNA) để nghiên cứu phả hệ và giám định DNA một số loài lan Hài, cây Bình vôi, chim (gà Lôi), cá (cá Vược) và đã phát hiện ra mức độ tiến hóa của chúng Hay nhóm tác giả của Đặng Tất Thế (2003-2006) cũng sử dụng các nhóm gen này để phân tích sự tiến hóa phân tử và phát sinh chủng loại của một số loài thú, bò sát quý hiếm của Việt Nam [2,4] Nguyễn Thuý Hạnh (2006), Lê Thị Muội và cs (2005) đã dùng chỉ thị ISSR và cpSSR để nghiên cứu đa dạng di truyền một số loài chi họ Dầu và Lạc của Việt Nam [9,15] Hay nhóm tác giả của Nguyễn Minh Tâm đã dùng các chỉ thị SSR để đánh giá đa dạng nguồn gen cây Vạn tuế của Việt Nam làm cơ sở cho công tác bảo tồn đa dạng di truyền [13]

Tuy nhiên nghiên cứu ứng dụng phương pháp phân tích DNA góp phần vào việc phân loại mẫu thực vật đang còn rất ít Đặc biệt đối với nhóm cây rừng nói chung và loài gỗ quý có nguy cơ truyệt chủng nói riêng nên cần tập trung nghiên cứu có hệ thống

1.5.2 Kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được Karry Mullis và cộng sự mô tả lần đầu tiên năm 1985 đã góp phần tạo nên một cuộc cách mạng trong sinh học phân tử Đây là phương pháp invitro để nhân bản nhanh một đoạn DNA nào đó mà chỉ cần lượng mẫu ban đầu rất hạn chế (cỡ 10-3µg) Kỹ thuật này có độ nhạy cảm rất cao và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như sinh học phân tử, chẩn đoán bệnh, trong di truyền quần thể và phân tích pháp y

Trong nghiên cứu khoa học, kỹ thuật PCR rất hữu hiệu cho việc xác định trình tự nucleotit của các đoạn DNA được nhân, có thể sử dụng PCR

để tách dòng đặc hiệu, nó giúp phát hiện đột biến, cho phép phân tích gen

từ các tế bào riêng lẻ, giúp nghiên cứu quá trình tiến hóa ở mức độ phân tử Thậm chí giúp phục hồi những gen đã tồn tại cách đây hàng chục triệu

Trang 25

1.5.3 Đọc trình tự nucleotide

Phương pháp giải trình tự hiện nay được dùng phổ biến là phương pháp Dideoxy hay còn gọi là phương pháp gián đoạn chuỗi (chain-determination method) là một phương pháp xác định trình tự DNA được Frederick Sanger phát triển vào năm 1975

Nguyên tắc cơ bản của phương pháp Dideoxy dựa vào hoạt động của enzyme DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA Enzyme DNA polymerase xúc tác gắn các nucleotit vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở

vị trí 3' có chứa nhóm -OH tự do, khi gặp nucleotit không có nhóm 3'-OH thì phản ứng tổng hợp bị dừng lại Đặc trưng của phương pháp là sử dụng các loại dideoxynucleotit để làm ngừng phản ứng tổng hợp DNA một cách ngẫu nhiên Trong phản ứng sử dụng đoạn DNA là đoạn DNA mạch đơn

có kích thước 20 nucleotit

1.6 Xây dựng cây phát sinh chủng loại

Cây phát sinh chủng loại là một sơ đồ mô tả mối quan hệ tiến hoá giữa các loài, được xây dựng dựa trên sự giống và khác nhau các đặc điểm vật chất di truyền hay cơ thể Trong nghiên cứu này là sự giống và khác nhau về cấu trúc DNA giữa các loài Các taxa được nối với nhau trên cây thể hiện mối quan hệ di truyền giữa chúng, khoảng cách càng lớn, mối quan hệ di truyền càng xa và ngược lại Trên cây có rễ mỗi nút bên trong cây đại diện cho một loài tổ tiên chung Giả định nút gần nhất với rễ là loài khởi điểm, các nút còn lại được toả ra từ nút này được gọi là con cháu Mỗi một nút được gọi là một đơn vị phân loại, các nút trong cây được gọi là các đơn vị phân loại giải thiết Độ dài của cành cây mô phỏng thời gian tiến hoá Cây không rễ là cây không có điểm khởi đầu, do đó nó không tái dựng lịch sử tiến hoá của các loài Cây không rễ chỉ cho biết mối quan hệ họ hàng giữa các loài hiện tại Có 4 phương pháp tạo cây bao

Trang 26

gồm: (1) phương pháp Neighbor – Joining (NJ), (2) phương pháp Minimum Evolution, (3) phương pháp Maximum Parsimony và (4) phương pháp UPGMA,\ Khoảng cách di truyền giữa các loài cũng được ước lượng thông qua độ dài của cành cây

Dữ liệu DNA sau khi thực hiện ghép nối, xắp xếp thẳng hàng (alignment) được tạo cây tiến hoá bằng phần mềm MEGA 4.0, sử dụng phương pháp Maximum Parsimony (MP) với các thông số phân tích như sau:

- Kiểm tra phân tích: kiểm tra bằng giá trị bootstrap với số lần lặp lại (replicate) là 1000 lần

- Dữ liệu thiếu/ khoảng trống nucleotide (do đột biến thêm bớt tạo ra): được xoá bỏ theo cặp (pairwise deletion)

- Mô hình đột biến: mô hình Maximum composite Likelihood với số lượng đột biến được tính bao gồm cả đột biến hoán đổi (A↔T, G↔C) và hoán vị (A↔C, A ↔ G, T ↔ C, T↔ G) Giả thuyết sự giống nhau giữa các loài là giống nhau (sự giống nhau giữa hai trình tự DNA con cháu được di truyền

từ cùng một tổ tiên được gọi là sự giống nhau “homogeneous”, sự giống nhau này nếu được di truyền từ 2 tổ tiên khác nhau được gọi là sự giống nhau chất (homoplasious), tốc độ đột biến coi như không đổi theo thời gian

Trang 27

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu

Bao gồm 02 mẫu lá sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) thu tại vườn

sâm Tắk-nô, xã Trà Linh, huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam và 05 mẫu

lá sâm thu tại huyện Phong Thổ, tỉnh Lai Châu (sâm Lai Châu) Ký hiệu và địa điểm thu thập của 07 mẫu nghiên cứu được trình bày trong bảng 1

Hình 2.1 Thân và rễ Sâm Lai Châu Bảng 2.1 Danh sách và địa điểm thu thập 07 mẫu vật nghiên cứu

STT Ký hiệu mẫu Nơi thu mẫu

Trang 28

2.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Phòng Hệ thống học Sinh học phân tử và Di truyền bảo tồn, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật Tháng 10/2011 – 5/2012

2.1.3 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu

Các hóa chất dùng trong nghiên cứu bao gồm:

- Taq PCR mastermix 2x (QIAgen, Mỹ)

- BigDye terminator v3.1 (Applied Biosystems, Mỹ)

- Dung dịch TBE 10x (10mM Tris, 0.9 mM axir boric, 0.01 mM EDTA) của hãng Invitrogen, Mỹ

- Ethidium Bromide (EtBr) 10 mg/ml (Invitrogen, Mỹ)

- Hóa chất điện di agarose (agarose, đệm TAE )

* Hóa chất cho phản ứng PCR:

Trang 29

- Taq DNA polymerase

- MgCl2

- Mastermix 2X bao gồm:

+ dNTP + MgCL2

+ Taq DNA polymerase

- Tủ khử trùng, máy sấy chân không

- Máy khuấy từ, máy trộn

- Máy soi cực tím

- Máy khử trùng Mac - 250Nex (Sanyo, Nhật Bản)

- Cân phân tích (Precisa, Thụy Sĩ)

- Máy ổn nhiệt (Memmert, Đức)

- Máy trộn rung (Vortex - Fluka, Mỹ)

- Máy ly tâm 5415D (Eppendorf, Đức)

- Máy ly tâm lạnh (Mikro 200R, Mỹ)

- Máy PCR Mastercycler (Eppendorf, Đức)

- Máy điện di agarose gel (BioRad, Mỹ)

- Máy soi gel (UVP, Mỹ)

- Máy giải trình tự tự động ABI 3100 - Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Mỹ)

Trang 30

30

- Pipette, đầu côn, ống eppendorf

2.1.5 Các cặp mồi dùng trong nghiên cứu

Cặp mồi nhân bản vùng ITS-rDNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi thiết kế kế trên cơ sở trình tự ITS-rDNA của các loài trong chi

Panax trên Genbank có trình tự như sau:

Mồi xuôi PaITS-F: 5’- CAC TGA ACC TTA TCA TTT AG AG -3’ Mồi ngược PaITS-R: 5’- CTT ATT GAT ATG CTT AAA CTC AG -3'

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Thiết kế mồi Tách chiết

PCR

Cặp mồi DNA Tổng số

ITS-rDNA

Cặp mồi Khai thác trình tự trong NCBI Mẫu lá sâm

Trang 31

Hình 2.2 Sơ đồ các bước thí nghiệm

2.2.2 Các phương pháp nghiên cứu

2.2.2.1 Phương pháp thu thập mẫu

Mẫu lá sâm được làm khô trong túi nylon có ch ứa silicagel Giữ mẫu ở nhiệt độ phòng hoặc -200C cho đến khi sử dụng

2.2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số của các mẫu sâm được tách chiết bằng Dneasy Plant Mini Kit theo qui trình sau:

- Lấy mẫu lá non bảo quản lạnh sâu (-70◦C) đem nghiền trong nitrogen lỏng (-196◦C) thành dạng bột mịn Lấy 100mg bột cho vào ống eppendorf 1,5ml

- Thêm 400μl đệm AP1 và 4ul Rnase A Trộn đều bằng vortex và ủ ở 65◦C trong 10 phút Đảo trộn 2 – 3 lần trong quá trình ủ

- Thêm 130μl đệm AP2 Trộn đều và ủ trong đá 5 phút

- Hút dịch ly giải vào cột QIAshredder Mini Ly tâm tốc độ 14000rpm trong 2 phút

Trang 32

- Chuyển dịch qua cột vào ống eppendorf 1,5ml mới nhưng không xáo trộn Thêm 1,5 lần thể tích đệm AP3/E và trộn đều bằng pipet

- Chuyển 650μl hỗn dịch vào cột Dneasy Mini Ly tâm tốc độ 8000rpm trong 1 phút Loại bỏ dịch qua cột Lặp lại bước này với phần hỗn dịch còn lại

- Đặt cột vào ống thu mới Thêm 500μl đệm AW và ly tâm 8000rpm trong

1 phút Loại bỏ dịch qua cột

- Thêm 500μl đệm AW Ly tâm 14000rpm trong 2 phút Loại bỏ dịch qua cột

- Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5ml có ghi nhãn Thêm 100μl đệm AE

để hoà tan Ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút Ly tâm 6000rpm trong 1 phút Lặp lại bước này, thu được dịch chiết chứa DNA tổng số, bảo quản ở -20◦C DNA tổng số tách chiết được theo qui trình ở trên được điện di kiểm tra trên gel agarose nồng độ 0,8% trong đệm TBE 1x, nhuộm Ethidium bromide 0,5ug/ml

2.2.2.3 Phương pháp điện di DNA bằng gel agarose

 Chuẩn bị gel Agarose 1% và điện di sản phẩm DNA đã tách chiết.

- Khay điện di được đặt lược sẵn ở một đầu khay Sử dụng lược có số răng

là 12 Khay được đặt ở nơi bằng phẳng

- Thể tích gel sử dụng chạy điện di DNA tổng số được tách chiết từ lá: 40ml với nồng độ 1% agrarose

- Chạy điện di ở điện thế 100-120V, 70- 80 mA, trong khoảng 30 phút

- Soi gel trên máy soi cực tím Nồng độ DNA được xác định dựa vào độ sáng của băng DNA so với độ sáng của băng DNA chuẩn Độ gọn của băng DNA sẽ cho biết độ nguyên vẹn của DNA đã tách chiết được

Trang 33

2.2.2.4 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

 Tiến hành:

- Sau khi đo nồng độ DNA khuôn , tính và tạo các nồng độ DNA của các mẫu như nhau để khi đưa vào mỗi ống phản ứng thể tích DNA khuôn được giống nhau, và đạt nồng độ 10ng trong tổng thể tích là 25µl/ 1 phản ứng

- Tính lượng thể tích các thành phần khác trong phản ứng , trộn đều các thành phần rồi chia vào các ống đã có khuôn DNA

- Đặt các ống vào máy PCR, khởi động, cài đặt chu kì và cho máy chạy

Phản ứng PCR được tiến hành với các thành phần như Bảng 2

Bảng 2.2 Các thành phần phản ứng PCR

2 Mồi xuôi: PaITS-F 20 mM 1,0

3 Mồi ngược: PaITS-R 20 mM 1,0

Trang 34

Hình 2.3 Chu trình phản ứng PCR

2.2.2.5 Tinh sạch sản phẩm PCR

Trang 35

Hình 2.4 Sơ đồ phản ứng QIAquick

 Các bước tiến hành: