CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.2. Các phương pháp nghiên cứu
2.2.2.1. Phương pháp thu thập mẫu
Mẫu lá sâm được làm khô trong túi nylon có ch ứa silicagel. Giữ mẫu ở nhiệt độ phòng hoặc -200C cho đến khi sử dụng.
2.2.2.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số của các mẫu sâm được tách chiết bằng Dneasy Plant Mini Kit theo qui trình sau:
- Lấy mẫu lá non bảo quản lạnh sâu (-70◦C) đem nghiền trong nitrogen lỏng (-196◦C) thành dạng bột mịn. Lấy 100mg bột cho vào ống eppendorf 1,5ml.
- Thêm 400μl đệm AP1 và 4ul Rnase A. Trộn đều bằng vortex và ủ ở 65◦C trong 10 phút. Đảo trộn 2 – 3 lần trong quá trình ủ.
- Thêm 130μl đệm AP2. Trộn đều và ủ trong đá 5 phút.
- Hút dịch ly giải vào cột QIAshredder Mini. Ly tâm tốc độ 14000rpm trong 2 phút.
- Chuyển dịch qua cột vào ống eppendorf 1,5ml mới nhưng không xáo trộn. Thêm 1,5 lần thể tích đệm AP3/E và trộn đều bằng pipet.
- Chuyển 650μl hỗn dịch vào cột Dneasy Mini. Ly tâm tốc độ 8000rpm trong 1 phút. Loại bỏ dịch qua cột. Lặp lại bước này với phần hỗn dịch còn lại.
- Đặt cột vào ống thu mới. Thêm 500μl đệm AW và ly tâm 8000rpm trong 1 phút. Loại bỏ dịch qua cột.
- Thêm 500μl đệm AW. Ly tâm 14000rpm trong 2 phút. Loại bỏ dịch qua cột.
- Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5ml có ghi nhãn. Thêm 100μl đệm AE để hồ tan. Ủ ở nhiệt độ phịng 5 phút. Ly tâm 6000rpm trong 1 phút. Lặp lại bước này, thu được dịch chiết chứa DNA tổng số, bảo quản ở -20◦C. DNA tổng số tách chiết được theo qui trình ở trên được điện di kiểm tra trên gel agarose nồng độ 0,8% trong đệm TBE 1x, nhuộm Ethidium bromide 0,5ug/ml.
2.2.2.3. Phương pháp điện di DNA bằng gel agarose
Chuẩn bị gel Agarose 1% và điện di sản phẩm DNA đã tách chiết.
- Khay điện di được đặt lược sẵn ở một đầu khay. Sử dụng lược có số răng là 12. Khay được đặt ở nơi bằng phẳng.
- Thể tích gel sử dụng chạy điện di DNA tổng số được tách chiết từ lá: 40ml với nồng độ 1% agrarose.
- Chạy điện di ở điện thế 100-120V, 70- 80 mA, trong khoảng 30 phút. - Soi gel trên máy soi cực tím. Nồng độ DNA được xác định dựa vào độ sáng của băng DNA so với độ sáng của băng DNA chuẩn. Độ gọn của băng DNA sẽ cho biết độ nguyên vẹn của DNA đã tách chiết được.
2.2.2.4. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Tiến hành:
- Sau khi đo nờng đợ DNA khn , tính và tạo các nồng độ DNA của các mẫu như nhau để khi đưa vào mỗi ống phản ứng thể tích DNA khn được giống nhau, và đạt nồng độ 10ng trong tổng thể tích là 25µl/ 1 phản ứng.
- Tính lượng thể tích các thành phần khác trong phản ứng , trộn đều các thành phần rồi chia vào các ống đã có khn DNA.
- Đặt các ống vào máy PCR, khởi động, cài đặt chu kì và cho máy chạy.
Phản ứng PCR được tiến hành với các thành phần như Bảng 2
Bảng 2.2. Các thành phần phản ứng PCR
TT Thành phần Nồng độ Thể tích (μl)
1 Taq PCR Mastermix 2x 12,5
2 Mồi xuôi: PaITS-F 20 mM 1,0
3 Mồi ngược: PaITS-R 20 mM 1,0
4 DNA tổng số 10 ng 1,0
5 Nước cất khử ion - 9,5
Tổng 25,0
Phản ứng PCR được thực hiện với chu kì nhiệt như sau:
96oC 96oC 2 phút 30 giây 56oC 72oC 72oC 40giây 5 phút 35 chu kì 4oC
Hình 2.3. Chu trình phản ứng PCR
Hình 2.4. Sơ đồ phản ứng QIAquick
Các bước tiến hành:
Sử dụng Dneasy plant mini kit (Qiagen, Đức) [59,60] để tinh sạch sản phẩm PCR. Các bước tinh sạch sản phẩm:
Bước 1: Chạy điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%.
Bước 2: Cắt đoạn gel chứa băng DNA của từng mẫu, cho vào eppendorf
1,5 ml.
Bước 3: Cân đoạn gel từng mẫu đã cắt. Bổ sung 3 lần thể tích dung dịch
QG theo trọng lượng từng mẫu (1g gel tương đương 1000 μ dung dịch QG).
Bước 4: Ủ ở 50 0
C trong 10 phút cho tới khi gel tan hoàn toàn. Để làm tan gel tốt. lắc đều eppendorf vài lần trong quá trình ủ, mỗi lần cách nhau 2 - 3 phút.
Bước 5: Khi gel đã tan hoàn toàn, kiểm tra màu của dung dịch mẫu. Màu
của dung dịch tốt là màu vàng của QG ban đầu.
Bước 6: Hút toàn bộ dung dịch cho vào cột MinElute đặt trong ống thu
dịch ly tâm của Kit và ly tâm 13.000 rpm trong 1 phút.
Bước 7: Chuyển cột sang ống thu dịch ly tâm khác, cho 700 μl dung dịch
PE vào cột, để mẫu ở nhiệt độ phòng khoảng 5 phút, ly tâm 13.000 rpm trong 1 phút.
Bước 8: Chuyển cột sang ống thu dịch ly tâm khác và ly tâm với 13.000
rpm trong 1 phút.
Bước 9: Chuyển cột sang eppendorf 1,5 ml đã ghi kí hiệu mẫu, cho 10 μl
EB vào cột và ly tâm 13.000 rpm trong 1 phút.
Bước 10: Bỏ cột, bảo quản sản phẩm PCR trong ống eppendorf ở -20 0
C.
Bước 11: Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được gửi đi giải trình tự ở cơng
ty Macrogen (Hàn Quốc).
2.2.2.6. Phương pháp phân tích số liệu
- Sử dụng chương trình BLAST để tìm kiếm các trình tự tương đồng đã được các tác giả khác công bố trên ngân hàng DNA (Genbank).
- Các trình tự DNA được so sánh, phân tích với các lồi thuộc chi Panax và loài Polyscias javanica là lồi ngồi nhóm (Bảng 1) sử dụng các
phần mềm ClustalW, PAUP v4.0 và MrBayes v3.1.2, GeneDoc 2.5, phần mềm MEGA 4.0 được dùng để phân tích tiến hóa phân tử và xây dựng cây phát sinh chủng loại theo phương pháp Maximum Parsimony (MP).
Bảng 2.3. Danh sách các trình tự sử dụng trong nghiên cứu
Tên khoa học Mã hiệu Genbank
Panax assamicus AY233321
P. bipinnatifidus U41679
P. ginseng AY548192
P. japonicas AY271918
P. japonicus var. angustifolius FJ872548
P. japonicus var. bipinnatifidus AY233323
P. japonicus var. major AH010327
P. notoginseng AY271919
P. omeiensis U41686
P. pseudoginseng AY233327
P. pseudoginseng var. angustifolius AY271915
P. pseudoginseng var. elegantior AY271917
P. pseudoginseng var. bipinnatifidus AY271913
P. quinquefolius FJ606755 P. shangianus AY233328 P. sinensis AY271920 P. stipuleanatus AY271921 P. trifolius HQ112445 P. variabilis AY271923 P. wangianus U41690 Polyscias javanica DQ007383
Giá trị bootstrap (bootstrap value) dùng để đánh giá độ tin cậy của cây phát sinh chủng loại được tính với 1.000 lần lấy mẫu thử (resampling).