CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu
Bao gồm 02 mẫu lá sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) thu tại vườn sâm Tắk-nô, xã Trà Linh, huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam và 05 mẫu lá sâm thu tại huyện Phong Thổ, tỉnh Lai Châu (sâm Lai Châu). Ký hiệu và địa điểm thu thập của 07 mẫu nghiên cứu được trình bày trong bảng 1.
Hình 2.1. Thân và rễ Sâm Lai Châu
Bảng 2.1. Danh sách và địa điểm thu thập 07 mẫu vật nghiên cứu STT Ký hiệu mẫu Nơi thu mẫu
1 SNL 1 Quảng Nam
3 SLC 1 Lai Châu
4 SLC 2 Lai Châu
5 SLC 3 Lai Châu
6 SLC 4 Lai Châu
7 SLC 5 Lai Châu
2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Phòng Hệ thống học Sinh học phân tử và Di truyền bảo tồn, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật. Tháng 10/2011 – 5/2012.
2.1.3. Các hóa chất dùng trong nghiên cứu
Các hóa chất dùng trong nghiên cứu bao gồm:
- Taq PCR mastermix 2x (QIAgen, Mỹ).
- BigDye terminator v3.1 (Applied Biosystems, Mỹ).
- Dung dịch TBE 10x (10mM Tris, 0.9 mM axir boric, 0.01 mM EDTA) của hãng Invitrogen, Mỹ.
- Ethidium Bromide (EtBr) 10 mg/ml (Invitrogen, Mỹ). - Kít tách chiết DNA
- Kít tinh sạch sản phẩm PCR: QIAgen Quick Gel Extraction Kit (QIAgen, Mỹ).
- Agarose (Invitrogen, Mỹ). - Sephadex G50 (Sigma, Mỹ).
- Các hóa chất tách chiết và tinh sạch DNA (NaCl, CTAB, EDTA, Tris-HCl, β-Mercaptoethanol, Isopropanol, Sodium acetate 3M, ethanol 100%, 70%, Rnase (10mg/ml)
- Hóa chất điện di agarose (agarose, đệm TAE...). * Hóa chất cho phản ứng PCR:
- Taq DNA polymerase - MgCl2
- Mastermix 2X bao gồm: + dNTP
+ MgCL2
+ Taq DNA polymerase
2.1.4. Các thiết bị sử dụng
Các thiết bị chính sử dụng trong thao tác thực hiện thí nghiệm:
- Tủ lạnh thường và tủ lạnh sâu - Bể ổn nhiệt và lò vi sóng.
- Tủ khử trùng, máy sấy chân không. - Máy khuấy từ, máy trộn.
- Máy soi cực tím
- Máy khử trùng Mac - 250Nex (Sanyo, Nhật Bản). - Cân phân tích (Precisa, Thụy Sĩ).
- Máy ổn nhiệt (Memmert, Đức). - Máy trộn rung (Vortex - Fluka, Mỹ). - Máy ly tâm 5415D (Eppendorf, Đức). - Máy ly tâm lạnh (Mikro 200R, Mỹ).
- Máy PCR Mastercycler (Eppendorf, Đức). - Máy điện di agarose gel (BioRad, Mỹ). - Máy soi gel (UVP, Mỹ).
- Máy giải trình tự tự động ABI 3100 - Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Mỹ).
30
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Pipette, đầu côn, ống eppendorf.
2.1.5. Các cặp mồi dùng trong nghiên cứu
Cặp mồi nhân bản vùng ITS-rDNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi thiết kế kế trên cơ sở trình tự ITS-rDNA của các loài trong chi
Panax trên Genbank có trình tự như sau:
Mồi xuôi PaITS-F: 5’- CAC TGA ACC TTA TCA TTT AG AG -3’ Mồi ngược PaITS-R: 5’- CTT ATT GAT ATG CTT AAA CTC AG -3'
2.1.6. Phần mềm
Các trình tự DNA được so sánh, phân tích sử dụng các phần mềm: - ClustalW [53] - PAUP v4.0 [52] - MrBayes v3.1.2 [51]. - GeneDoc 2.5 [50], - Phần mềm MEGA 4.0[54]