Đồ án nuôi cấy mô lan kim tuyến

Từ xưa, người ta đã tiến hành nhân giống các loài Lan bằng nhiều phương pháp khác nhau như gieo hạt, tách mầm nhưng những phương pháp này vẫn còn nhiều nhược điểm như mất thời gian, nguồn vật liệu ban đầu cần nhiều, hệ số nhân thấp, dễ bị thoái hoá qua nhiều thế hệ, khả năng lây truyền bệnh cao, chất lượng cây không đảm bảo, việc nhân giống mang tính thời vụ. , Hơn nữa, hạt lan lại quá nhỏ, chỉ có một phôi; nảy mầm cần sự có mặt của nấm cộng sinh nên tỷ lệ nảy mầm trong tự nhiên là rất thấp. Để khắc phục nhược điểm này, hiện nay người ta tiến hành nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực, cây con được tạo ra với số lượng lớn đồng nhất về kiểu hình, chất lượng đảm bảo, sạch bệnh, giá thành phù hợp và không phụ thuộc vào yếu tố thời tiết. Nhờ đó đáp ứng nhu cầu không ngừng tăng lên của thị trường.. Đây là điều mà phương pháp truyền thống không thực hiện được. Nói đến ch

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đồ án này

Trước hết tôi xin gởi tới Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nha Trang, Ban Giấm Đốc Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường niềm kính trọng, sự tự hào được học tập tại trường trong những năm qua

Sự biết ơn sâu sắc tới thầy: Th.s Lê Phương Chung – Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường – Trường Đại học Nha Trang và Th.s Nguyễn Trọng Lực – Trưởng phòng Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật – Trung Tâm Ứng Dụng Và Chuyển Giao Công Nghệ - Sở Khoa Học Và Công Nghệ tỉnh Phú yên đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này

Đặc biệt xin ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường – Trường Đại học Nha Trang và các anh chị trong Trung Tâm Ứng Dụng và Chuyển Giao Công Nghệ – Sở Khoa Học Và Công Nghệ tỉnh Phú yên đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án này

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều kiên, động viên, khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua

Nha trang, ngày tháng 7 năm 2012

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Huỳnh Uyên

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

KÝ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT vi

LỜI MỞ ĐẦU 1

Chương I :TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 3

1.1.1 Khái niệm về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 3

1.1.2 Đặc điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vât (TBTV) 3

1.1.2.1 Tính toàn năng của tế bào 3

1.1.2.2 Khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào 4

1.1.2.3 Sự trẻ hoá 4

1.1.3 Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô TBTV 5

1.1.4 Nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô TBTV 6

1.1.5 Các phương pháp nuôi cấy mô TBTV 6

1.1.5.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 7

1.1.5.2 Nuôi cấy mô sẹo 7

1.1.5.3 Nuôi cấy bao phấn và túi phấn 8

1.1.5.4 Nuôi cấy protoplast 9

1.1.5.5 Nuôi cấy mô cơ quan tách rời 9

1.1.5.6 Nuôi cấy tế bào đơn 10

1.1.6 Môi trường nuôi cấy mô TBTV 10

1.1.6.1 Khoáng đa lượng 11

1.1.6.2 Khoáng vi lượng 12

1.1.6.3 Nguồn cacbon 12

1.1.6.4 Các vitamin 13

1.1.6.5 Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác 13

1.1.6.6 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 14

1.1.7 Các giai đoạn nuôi cấy mô tế bào thực vật 18

1.1.7.1 Giai đoạn chuẩn bị 18

1.1.7.2 Giai đoạn tái sinh mẫu nuôi cấy 18

1.1.7.3 Giai đoạn nhân nhanh 19

1.1.7.4 Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh 19

1.1.7.5 Giai đoạn đưa cây mô ra ngoài vườn ươm 20

1.1.8 Các yếu tố khác ảnh hưởng đến nhân giống nuôi cấy mô TBTV 20

1.1.8.1 Điều kiện vô trùng 20

1.1.8.2 Ánh sáng và nhiệt độ 22

1.1.8.3 pH môi trường 23

1.2 Giới thiệu về cây lan gấm 23

1.2.1 Phân loại thực vật 23

1.2.2 Đăc điểm thực vật 24

1.2.3 Sự phân bố 26

1.2.4 Tính dược liệu và công dụng 26

1.2.5 Tình hình nghiên cứu cây lan gấm 27

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 28

2.1.3 Điều kiện nuôi cấy 28

2.2 Nội dung nghiên cứu 29

2.3 Địa điểm thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu 30

2.4 Phương pháp nghiên cứu 30

2.4.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 30

2.4.1.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu kỹ thuật vô mẫu cây lan Gấm 30

2.4.1.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi 32

2.4.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng đến khả năng nhân nhanh chồi 33

2.4.1.4 Thí nghiệm 4 : Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng

đến khả năng nhân nhanh chồi 33

2.4.1.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát khả năng nhân nhanh 35

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 36

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Nghiên cứu kỹ thuật khử trùng mẫu lan gấm 37

3.1.1 Khử trùng bằng Javen 37

3.1.2 Khử trùng bằng chlorine 39

3.1.3 Khử trùng kết hợp Javen và Chlorin 40

3.2 Tái sinh chồi 42

3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường khoáng thích hợp để nhân nhanh chồi lan gấm 45

3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh thể chồi 46

3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi. 47

3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi 49

3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi 50

3.5 Khảo sát quá trình nhân nhanh 53

3.6 Đề xuất quy trình nhân nhanh lan gấm 55

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57

4.1 Kết luận 57

4.2 Kiến nghị 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Công thức khử trùng mẫu 31

Bảng 2.2 Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến khả năng nhân nhanh chồi của vật liệu nuôi cấy 33

Bảng 2.3 Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi 34

Bảng 2.4 Ảnh hưởng của các nồng độ Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi 34

Bảng 2.5 Ảnh hưởng của các nồng độ TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi 35

Bảng 2.6: Khảo sát quá trình nhân nhanh 36

Bảng 3.1 Hiệu quả khử trùng với chất khử trùng là Javen 37

Bảng 3.2 Hiệu quả khử trùng với chất khử trùng là Chlorine 39

Bảng 3.3 Hiệu quả khử trùng với sự kết hợp Javen và Chlorine 40

Bảng 3.4 So sánh hiệu quả khử trùng với các chất khử trùng khác nhau 41

Bảng 3.5 Khả năng tái sinh chồi mẫu cấy 42

Bảng 3.6 Ảnh hưởng môi trường khoáng thích hợp nhân nhanh lan gấm 45

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi 47

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi 49

Bảng 3.9: Ảnh hưởng của TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi sau 6tuần nuôi cấy51 Bảng 3.10 Khảo sát quá trình nhân nhanh 53

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cây lan gấm Anoectochilus setaceus Blume 25

Hình 3.1 Biểu đồ hiệu quả khử trùng với các chất khử trùng khác nhau 41

Hình 3.2 Mẫu sau khi khử trùng 42

Hình 3.3 Sự tái sinh chồi 44

Hình 3.4 Sự phát triển hình thái chồi trên các môi trường khoáng 46

Hình 3.5 Sự phát triển hình thái chồi với các nồng độ BA khác nhau 48

Hình 3.6 Sự phát triển của chồi với các nồng độ Kinetin khác nhau 50

Hình 3.7 Sự phát triển của chồi với các nồng độ TDZ khác nhau 52

Hình 3.8 Khảo sát quá trình nhân nhanh 54

Hình 3.9 Khảo sát quá trình nhân nhanh protocorm 55

Hình 3.10 Quy trình nhân nhanh lan gấm 56

KÝ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT

TBTV : Tế bào thực vật

DNA : Deoxyribonucleotic acid

RNA : Ribonucleotic acid

MS :Murashige&Skoog

VW :Vaccine và Went

LS : Linsmainer và Skoog

ATP : Adenosine triphosphate

GA3 : Acid ascorbic

ĐTD : Đơn tử diệp

STD : Sông tử diệp

LỜI MỞ ĐẦU

Thế kỉ 21 được coi là thế kỷ của sự phát triển công nghệ sinh học trong đó dược liệu là tài nguyên di truyền - tài nguyên tái tạo Nắm được, phát huy được tài nguyên di truyền là nắm kinh tế, nắm tương lai Dùng thế mạnh dược liệu đẩy

-

-tộc.Từ lâu, người phương đông đã tôn hoa Lan là “ vương giả chi hoa” và người phương tây cũng tôn hoa Lan là “ nữ hoàng của các loài hoa” Hoa Lan đã chinh phục người phương Đông và người phươngTây không chỉ cấu trúc kì diệu và sự đa dạng về màu sắc, hình dáng và hương thơm quyến rũ mà còn bỡi giá trị làm thuốc của nó

Từ xưa, người ta đã tiến hành nhân giống các loài Lan bằng nhiều phương pháp khác nhau như gieo hạt, tách mầm nhưng những phương pháp này vẫn còn nhiều nhược điểm như mất thời gian, nguồn vật liệu ban đầu cần nhiều, hệ số nhân thấp, dễ bị thoái hoá qua nhiều thế hệ, khả năng lây truyền bệnh cao, chất lượng cây không đảm bảo, việc nhân giống mang tính thời vụ , Hơn nữa, hạt lan lại quá nhỏ, chỉ có một phôi; nảy mầm cần sự có mặt của nấm cộng sinh nên tỷ lệ nảy mầm trong tự nhiên là rất thấp Để khắc phục nhược điểm này, hiện nay người ta tiến hành nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực, cây con được tạo ra với số lượng lớn đồng nhất về kiểu hình, chất lượng đảm bảo, sạch bệnh, giá thành phù hợp và không phụ thuộc vào yếu tố thời tiết Nhờ đó đáp ứng nhu cầu không ngừng tăng lên của thị trường Đây là điều mà phương pháp truyền thống không thực hiện được

Nói đến chi lan gấm Anoectochilus, thì loài lan gấm Anoectochilus setaceus

Blume được biết đến nhiều hơn cả không chỉ bởi giá trị làm cảnh do lá và hoa đẹp

mà còn vì giá trị làm thuốc của nó Theo các tài liệu y học thế giới, lan gấm là loài cây thuốc đặc biệt có tác dụng tăng cường sức khoẻ, phòng bệnh, có tính kháng khuẩn, làm khí huyết lưu thông, chữa các bệnh viêm khí quản, lao phổi, chống tăng

huyết áp, đau nhức khớp xương…Hơn nữa mới đây người ta đã phát hiện ra khả năng phòng và chống ung thư của loại thảo dược này

Như vậy, lan Gấm Anoectochilus setaceus Blume là loại thảo dược có giá trị

và có tiềm năng rất lớn.Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam số lượng loài này trong tự nhiên được phát hiện còn rất ít mà lại bị thu hái cả cây với số lượng lớn để bán làm thuốc (500,000VNĐ/ kg tươi) do vậy loài lan này đang bị đe doạ mạnh và đứng trước nguy cơ tuyệt chủng nếu không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu Hiện nay, lan Gấm được xếp trong nhóm IA của Nghị định 32/2006/CP; và nhóm thực vật đang nguy cấp EN A1a, c, d trong Sách Đỏ Việt Nam 2007

Xuất phát từ những vấn đề trên, được sự cho phép của Bộ môn Công nghệ sinh học- Viện công nghệ sinh học và môi trường - trường Đại học Nha Trang, tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi lan Gấm (Anoectochilus setaceus Blume) ” tìm ra điều kiện thích hợp để nhân nhanh chồi lan gấm bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

Chương I :TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.1.1 Khái niệm về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là thuật ngữ được dùng một cách rộng rãi để nói

về việc mô tả các phương thức nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô trùng [3]

Mục đích chung của nuôi cấy mô tế bào thực vật là sử dụng các điều kiện như: nhiệt độ, ánh sáng, thành phần dinh dưỡng, các chất điều hoà sinh trưởng thực vật… để điều khiển qúa trình sinh trưởng và phát triển của tế bào, mô nuôi cấy theo mục tiêu và yêu cầu đặt ra

Nuôi cấy mô tế bào thực vật còn là một phương pháp nghiên cứu hiệu quả nhất quá trình phát sinh hình thái ở nhiều loài thực vật Phương pháp này giúp mở

ra những hướng mới trong nghiên cứu sinh lý và di truyền thực vật như: cơ chế sinh tổng hợp các chất, sinh lý phân tử - đột biến, sinh lý dinh dưỡng ở tế bào thực vật và nhiều vấn đề sinh học khác…

Tất cả dạng nuôi cấy mô đều được tiến hành qua hai bước:

- Các phần của thực vật hoặc một cơ quan thực vật nào đó được tách ra khỏi phần còn lại Đó là sự tách rời tế bào, mô hay cơ quan đang tương tác lẫn nhau trong một tổ chức thực vật nguyên vẹn

- Các phần tách ra nói trên phải đặt trong môi trường thích hợp để nó có thể biểu

lộ hết bản chất hoặc khả năng đáp ứng của nó.[3]

1.1.2 Đặc điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vât (TBTV)

1.1.2.1 Tính toàn năng của tế bào

Mỗi tế bào đều mang đầy đủ lượng thông tin di truyền của cơ thể và có khả năng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi

Gottlibeb Haberlant (1902) - nhà thực vật học người Đức đã đặt nền móng đầu tiên cho nuôi cấy mô tế bào thực vật Ông đã đưa ra giả thuyết về tính toàn năng của tế bào trong cuốn sách "Thực nghiệm về nuôi cấy tách rời" Theo ông: “Tế bào

bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền (DNA) cần thiết và đủ của cả sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh”

Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Cho đến nay, các nhà khoa học đã chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ.[7]

1.1.2.2 Khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào

Biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái tế bào phôi cho đến khi thể hiện một chức năng nào đó

Các tế bào dùng trong nuôi cấy đều đã biệt hóa về cấu trúc và chức năng từ

tế bào phôi Trong những điều kiện thích hợp, có thể làm cho những tế bào này quay trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng - tế bào phôi và quá trình

đó gọi là quá trình phản biệt hóa

Trong cùng một cơ thể, mỗi loại tế bào đều có khả năng biệt hóa, phản biệt hóa và vì thế triển vọng nuôi cấy thành công cũng khác nhau Những tế bào càng chuyên hóa về một chức năng nào đó (đã biệt hóa sâu) thì càng khó xảy ra quá trình phản biệt hóa, như các tế bào mạch dẫn của hệ thống mạch dẫn ở thực vật, tế bào Người ta đã tổng kết rằng; những tế bào càng gần với trạng thái của tế bào phôi bao nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu

Đối với các loài thực vật thì các tế bào phôi non, các tế bào mô phân sinh, các

tế bào của cơ quan sinh sản (hạt phấn, noãn) rất dễ xảy ra quá trình phản biệt hóa

Vì vậy nói một cách hình tượng như Galson (1986) và Murashige (1974) thì khả năng hình thành cơ quan hay cơ thể của các tế bào thực vật là giảm dần theo chiều hướng từ ngọn xuống gốc

phản ứng với các điều kiện và môi trường nuôi cấy nhanh, dễ tái sinh, đặc biệt trong nuôi cấy mô sẹo, phôi Ngoài ra mô non trẻ mới được hình thành, sinh trưởng mạnh, mức độ nhiễm mầm bệnh ít hơn.[7]

1.1.3 Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô TBTV

Quá trình nuôi cấy mô TBTV có những ưu điểm như sau:

- Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp, công nghệ vi nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ 1 cây sau khi được nuôi cấy

từ 1 đến 2 năm có thể tạo ra hàng triệu cây

- Sản phẩm cây giống đồng nhất: Vi nhân giống về cơ bản là công nghệ nhân dòng Nó tạo ra quần thể có độ đều cao dù xuất phát từ cây mẹ có kiểu gen dị hợp hay đồng hợp

- Tiết kiệm không gian: Vì hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng thí nghiệm, không phụ thuộc vào thời tiết bên ngoài và các vật liệu khởi đầu có kích thước nhỏ Mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất trên đồng ruộng và trong nhà kính theo phương pháp truyền thống

- Nâng cao chất lượng cây giống: cây được nuôi cấy đã được loại trừ các mầm bệnh như virus, nấm, vi khuẩn … nên cấy giống tạo ra hoàn toàn sạch bệnh Vì vậy, cây giống tạo ra có sức sinh trưởng và phát triển tốt, năng suất cây trồng tăng 15-30%

so với phương pháp truyền thống

- Khả năng tiếp thị sản phẩm tốt hơn và nhanh hơn: Các dạng sản phẩm khác

nhau có thể tạo ra từ phương pháp nuôi cấy môTBTV như cây con in vitro (trong

ống nghiệm) hoặc trong bầu đất Các cây giống có thể được bán ở dạng cây, củ bi hay là thân củ

- Lợi thế về vận chuyển: Các cây con kích thước nhỏ có thể vận chuyển đi xa dễ dàng và thuận lợi, đồng thời cây con tạo ra trong điều kiện vô trùng được xác nhận

là sạch bệnh Do vậy, bảo đảm an toàn, đáp ứng các qui định về vệ sinh thực vật quốc tế

- Sản xuất quanh năm: Quá trình sản xuất có thể tiến hành vào bất kỳ thời gian nào, không phụ thuộc mùa vụ.[4]

1.1.4 Nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô TBTV

Bên cạnh những ưu điểm, phương pháp nuôi cấy mô TBTV còn có những nhược điểm:

- Chi phí sản xuất cao: chi phí hóa chất, trang thiết bị hiện đại, tiêu tốn nhiều năng lượng… nên giá thành sản xuất của cây giống cao so với các phương pháp truyền thống như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt

- Chất lượng cây giống có thể bị biến dị: Cây con nuôi cấy mô có thể sai khác với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma Kết quả là cây con không giữ được các đặc tính quý của cây mẹ Tỷ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng Hiện tượng biến dị này cần được lưu ý khắc phục nhằm đảm bảo sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền [4]

1.1.5 Các phương pháp nuôi cấy mô TBTV

Nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm :

- Cấy cây : nuôi cấy cây con và cây lớn hơn

- Cấy phôi : gồm nuôi cấy các phôi cô lập đã trưởng thành và chưa trưởng thành

- Cấy cơ quan : cấy các cơ quan thực vật tách rời

- Cấy mô hoặc mô sẹo : cấy các loại mô tách ra từ một phần nào đó của một

cơ quan thực vật

- Cấy tế bào và huyền phù tế bào : cấy các tế bào cô lập hoặc cụm tế bào rất nhỏ trong môi trường lỏng

- Cấy tế bào trần : cấy teé bào trần thực vật là nuôi cấy những tế bào không

có thành (vách) được dùng trong kỹ thuật di truyền

- Cấy túi phấn (thể đơn bội) : cấy túi phấn hoặc những hạt phấn chưa trưởng thành để thu được tế bào đơn bội hay mô sẹo trong kỹ thuật di truyền.[3]

Trong các phương pháp được liệt kê như trên, các phương pháp thường được

áp dụng phổ biến như sau:

1.1.5.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Trong nuôi cấy mô TBTV, một phương thức đơn giản và thường hay được

sử dụng để tái sinh chồi invitro là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng là sử dụng phần mô phân sinh ngọn với 3-4 tiền phát khởi lá, có kích thước

từ 0,1 –0,15mm tính từ chóp sinh trưởng Kỹ thuật này khá phức tạp, phải thực hiện dưới kính lúp và khả năng sống sót của mẫu cấy có kích thước nhỏ như thế thường không cao, Phương pháp này được ứng dụng tạo cây con sạch bệnh virus.[16]

Trên thực tế người ta thường nuôi cấy đỉnh chồi non với kích thước khoảng vài mm Đó có thể là đỉnh chồi ngọn hoặc đỉnh chồi nách Mỗi đỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ tạo ra một hay nhiều chồi và mỗi chồi sẽ phát triển thành cây hoàn chỉnh Xét về nguồn gốc của các cây đó, có thể có ba khả năng:

- Cây phát triển từ chồi ngọn

- Cây phát triển từ chồi nách phá ngủ

- Cây phát triển từ chồi mới phát sinh, ví dụ: nuôi cấy đoạn trụ hạ diệp của cây

mãng cầu (Annona squamosa) sẽ cho rất nhiều mầm trên mô cấy và một số mầm

sau đó sẽ phát triển thành chồi và sau đó sẽ thành cây invitro hoàn chỉnh

1.1.5.2 Nuôi cấy mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào vô tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt (vết thương, xử lý bằng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật…) Mẫu cấy ban đầu để tạo mô sẹo có thể lấy từ cây con vô trùng trong ống nghiệm, rễ, thân, lá của cây bên ngoài đã được vô trùng Không phải tất

cả mọi tế bào trong mẫu cấy đều góp phần hình thành mô sẹo và chỉ có một số loại

mô sẹo nhất định mới có khả năng tái tạo lại các cơ quan có tổ chức Mô sẹo là nguyên liệu khởi đầu cho các nghiên cứu quan trọng khác như: phân hóa mô và tế bào, chọn dòng tế bào, nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy phôi soma, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học… Các tế bào thuộc các mô hoặc cơ quan này phải chịu một sự phản phân hóa trước lần phân chia đầu tiên Nhìn chung sự tạo mô sẹo invitro (nhờ auxin tác động) do 3 quá trình:

- Sự phản phân hóa tế bào nhu mô (ít nhiều ở sâu bên trong cơ quan) bao gồm các tế bào nhu mô mộc và libe, nhu mô vỏ hay lõi

- Sự phân chia của các tượng tầng: các tế bào tượng tầng của phần lớn STD dễ dàng phân chia dưới tác động của auxin thấm chí không cần auxin ngoại sinh như ở các loài cây cỏ hay dây leo

- Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ) quá trình này được

ưu tiên áp dụng ở ĐTD (đơn tử diệp), vì các cây này tượng tầng thiếu và nhu mô khó phản phân hoá so với STD (song tử diệp) Màu sắc của mô sẹo không giống nhau trên các môi trường nuôi cấy khác nhau hay trên các bộ phận khác nhau và chúng thường có màu vàng, trắng, nâu hay trắng xanh…

Nồng độ và loại kích thích tố sử dụng trong môi trường nuôi cấy là những yếu

tố có ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển mô sẹo Thường mô sẹo được hình thành trên môi trường giàu auxin; có thể dùng auxin riêng rẽ hay kết hợp với nhau hoặc có thể kết hợp với cytokinin tuỳ từng loại cây

Hàm lượng hormon nội sinh và chiều di chuyển của các hormon này trong mẫu cấy có ảnh hưởng đến sự phát sinh mô sẹo Vì vậy nguồn mẫu cấy, việc lấy mẫu cấy, cách đặt mẫu cấy trên môi trường nuôi cấy sẽ ảnh hưởng đến sự phát sinh

mô sẹo dẫn đến những phản ứng khác nhau của mẫu cấy.[16]

1.1.5.3 Nuôi cấy bao phấn và túi phấn

Nuôi cấy bao phấn và túi phấn tạo cây đơn bội là nhờ sự cảm ứng phát sinh phôi từ những lần phân chia lặp lại của các bào tử đơn bội, các tiểu bao tử, các hạt phấn non Giai đoạn phát triển đặc thù cảu bao phấn tại thời điểm nuôi cấy là nhân

tố quan trọng nhất đối với sự thành công của phát sinh phôi

Thực vật hạt kín, mỗi chồi hoa có thể chứa các bao phấn ở các giai đoạn khác nhau Vì vậy mỗi chồi hoa phải kiểm tra để xác định tất cả các giai đoạn phát triển giúp lựa chọn những bao phấn có độ tuổi phù hợp cho nuôi cấy

Có hai phương pháp cơ bản trong nuôi cấy bao phấn và hạt phấn là :

- Các bao phấn được nuôi cấy trên môi trường có agar hoặc môi trường lỏng

và sự phát sinh phôi xảy ra trong bao phấn

- Hạt phấn được tách rời khỏi bao phấn hoặc bằng phương pháp cơ học hoặc

do nứt nẻ tự nhiên của bao phấn và được nuôi trên môi trường lỏng.[16]

1.1.5.4 Nuôi cấy protoplast

Nuôi cấy protoplast được phát triển nhờ công trình của Cocking (1960) Ông

là người đầu tiên dùng enzyme để thủy phân thành tế bào và tách được protoplast từ

tế bào rễ cà chua Trong điều kiệ nuôi cấy phù hợp protoplast có thể táo sinh thành

tế bào mới, phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh

Do không có thành tế bào nên protoplast trở thành một đối tượng lý tưởng trong nghiên cứu biến đổi di truyền thực vật Bằng phương pháp dung hợp hai protoplast có thể tạo ra các cây lai soma Ngoài ra còn có thể sử dụng kỹ thuật dung hợp protoplast để chuyển các bào quan và chuyển gene.[4]

1.1.5.5 Nuôi cấy mô cơ quan tách rời

Wetmore (1946) nuôi cấy đỉnh chồi nho dai, cùng với một số tác giả khác, ông

đã chứng minh các bộ phận của cây như lá, thân, hoa thì khả năng tạo mô sẹo nhiều hơn

Nhu cầu dinh dưỡng khi nuôi cấy khi nuôi cấy các bộ phận khác nhau của cây

là khác nhau nhưng có thể thấy một số yêu cầu chung như nguồn cacbon dưới dạng đường và các muối của các nguyên tố đa lượng (nitơ, phospho, kali, canxi) và vi lượng (magiê, sắt, mangan, cobê, kẽm,…) Ngoài ra cần một số chất đặc biệt như vitamin (B1, B6, B3…) và các chất điều hòa sinh trưởng Muốn duy trì sinh trưởng

và phát triển của cơ quan nuôi cấy cần thường xuyên cấy chuyền qua môi trường mới

Dối với nuôi cấy mô, ngoài những thành phần dinh dưỡng như đôi với nuôi cấy cơ quan tách rời, cần bổ sung thêm các chất hữu cơ chứa ít nitơ ở dạng acid amine, có đường và inositol Trong trường hợp nuôi cấy mô, các chất điều hòa sinh

trưởng có vai trò quan trọng hơn vì mô tách rời không có khả năng tổng hợp chất này [4]

1.1.5.6 Nuôi cấy tế bào đơn

Ngoài khả năng nuôi cấy các cơ quan và mô thực vật, tế bào thực vật có thể được tách và nuôi riêng rẽ trong môi trường phù hợp Những công trình về nuôi cấy

tế bào đơn được tiến hành từ những năm 50 của thế kỷ XX

Tế bào đợn có thể ghi nhân bằng con đường nghiền mô, hoặc xử lý bằng enzyme Mỗi loiạ cây, mỗi loại tế bào khác nhau đòi hỏi những kỹ thuật nuôi cấy khác nhau

Nuôi cấy tế bào đơn được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc tế bào, nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện khác nhau lên quá trình sinh trưởng, phát triển và phân hóa của tế bào Nuôi cấy tế bào đơn còn được sử dụng trong chọn dòng tế bào.[4]

1.1.6 Môi trường nuôi cấy mô TBTV

Môi trường dinh dưỡng phải có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiết cho sự phân chia, phân hoá tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường của cây

Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy thực vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác nhau được sử dụng cho mục đích này, trong đó có một số môi trường cơ bản được sử dụng rất phổ biến như

MS (Murashige&Skoog, 1962) , LS (Linsmainer và Skoog, 1965)… Môi trường

MS (Murashige&Skoog, 1962) là môi trường được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô của tế bào thực vật, môi trường MS thích hợp cho cả thực vật 1 lá mầm, 2 lá mầm Môi trường Gramborg (1965) còn gọi là B5 dùng thử nghiệm trên đậu tương, được sử dụng trong tách và nuôi tế bào trần

Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy mô đóng vai trò quyết định đến sự thành công hay thất bại của nuôi cấy tế bào và mô thực vật Mỗi một loại vật liệu nuôi cấy hay loại cây khác nhau cần những thành phần môi trường thích hợp để phù hợp với mục đích việc nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nhìn chung, môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật gồm các thành phần cơ bản sau :

+ Các khoáng đa lượng

+ Các khoáng vi lượng

+ Nguồn cacbon

+ Các vitamin

+ Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác

+ Các chất điều hòa sinh trưởng

+ Các chất bổ sung khác: nước dừa; dịch chiết nấm men; than hoạt tính; Agar

1.1.6.1 Khoáng đa lượng

Các khoáng đa lượng bao gồm các nguyên tố khoáng được sử dụng ở nồng độ trên

30 ppm tức là 30mg/l Những nguyên tố đó là : N, Fe, P, K, Ca, Mo Riêng Na và Cl cũng được sử dụng trong một vài loại môi trường, nhưng chưa rõ vai trò của chúng

- Nitrogen: Mô, tế bào thực vật có thể sử dụng nitrogen khoáng như ammonium và nitrate Tỷ lệ ammonium và nitrat thay đổi tùy theo loại cây và trạng thái phát triển của mô Nitrogen được cung cấp dưới NO3 -, NH4+ [3]

- Phospho ( P): Phospho là nguyên tố quan trọng trong đời sống thực vật Nó tham gia vào việc vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, acid nucleic và tham gia vào cấu trúc màng Ngoài ra khi phosphor ở dạng H2PO4 - và HPO4 2- còn

có tác dụng như một hệ thống đệm (buffer) làm ổn định pH của môi trường trong quá trình nuôi cấy

- Kali ( K): K+ là một cation chủ yếu trong cây,giúp cho cây cân bằng các anion vô cơ và hữu cơ Ion K được chuyển qua màng tế bào dễ dàng và có hai vai trò chính là điều hòa pH và áp suất môi trường nội bào Sự thiếu hụt K+ trong môi trường nuôi cấy mô thực vật sẽ dẫn đến tình trạng thừa nước và làm giảm tốc độ hấp thu photphate Người ta cung cấp Kali cho mô nuôi cấy dưới dạng kali nitat (KNO3), kali clorua (KCl) và kalihydrophotphat (KH2PO4) [3]

- Canxi (Ca): Ca có mặt rất nhiều trong vách tế bào và màng tế bào Sự có mặt của Ca2+ rất quan trong trong khả năng đối kháng với sự nhiễm nấm Sự ổn định

của màng tế bào chịu ảnh hưởng rất lớn bỡi ion Ca 2+. Sự thiếu hụt Ca2+ sẽ làm tăng quá trình giải phóng các hợp chất ra khỏi màng tế bào Canxi được cung cấp dưới dạng canxi nitrat ( Ca(NO3)2.4H2O) canxi clorua (CaCl2.6H2O)

- Magiê (Mg): Là thành phần cấu trúc của diệp lục tố, có tác dụng đến quá trình quang hợp, phụ trợ cho nhiều enzyme lien quan trong biến dưỡng cacbonhydrat sự tổng hợp acid nucleic… Ion Mg có tính linh động cao, hầu hết ion

Mg2+ đều đc sử dụng cho việc điều hòa pH nội bào và ổn đinh cân bằng anion và cation Nếu thiếu hụt Mg sẽ ngăn cản quá trình tổng hợp RNA Kết quả là cấu trúc

và chức năng của lục lạp sẽ bị ảnh hưởng nhanh chóng khi xảy ra thiếu hụt Mg, là yếu tố không thể thiếu trong quá trình trao đổi năng lượng cảu thực vật bỡi vì nó có vai trò quan trọng trong việc tổng hợp ATP Mg được cung cấp dưới dạng magiê sunphat ( MgSO4.7H2O)

- Sắt (Fe): Nhưng môi trường cổ điển thường dùng sắt dưới dạng FeCl2, FeCl3.6H2O, FeSO4.7H2O, Fe2(SO4)3, Fe(C4H4O6) Hiện nay hầu hết các phòng phòng thí nghiệm đều dùng sắt ở dạng chelat kết hợp với Na2-Ethylene Diamine Tetra Acetate (EDTA) Ở dạng này sắt không bị kết tủa và giải phóng tư từ ra môi trường theo nhu cầu mô thực vật.[3]

1.1.6.2 Khoáng vi lượng

Cu, Zn, Mn, Bo, I, Co là các nguyên tố vi lượng thường được dùng trong môi trường nuôi cấy invitro Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzyme Chúng được dùng với nồng độ thấp hơn nhiều so với các nguyên

tố đa lượng Các dung dịch vi lượng thường dùng là : Nistch (1951), Heller (1953), Murashige – skoog ( 1962).[7]

1.1.6.3 Nguồn cacbon

Trong nuôi cấy mô TBTV, các mẫu nuôi cấy nói chung không thể quang hợp hoặc quang hợp ở cường độ rất thấp, vì vậy trong môi trường nuôi cấy cần bổ sung các hợp chất hydratcacbon Nguồn hydratcacbon được sử dụng phổ biến là đường

saccarozơ với hàm lượng từ 2-6% (W/V) Những loại đường khác như fructose, glucose, maltose, sorbitol, rất ít dùng [7]

1.1.6.4 Các vitamin

Thông thường thực vật tổng hợp các vitamincần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác

nhau Khi tế bào và mô được nuôi cấy invitro một vài vitamin trở thành yếu tố giới

hạn sự phát triển của chúng Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol Thiamine là một vitamin căn bản cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả các tế bào Thiamine thường được sử dụng với nồng độ từ 0,1 – 10mg/l Acid nicotini và pyridixine thường được bổ sung vào môi tường nuôi cấy nhưng cũng không cần thiết cho sự tăng trưởng của nhiều loài thực vật Acid nicotinic được sử dụng với nồng độ từ 0,1 – 5 mg/l Pyrdoxine thường được sử dụng với nồng độ 0,1 – 10mg/l Myo-inositol thường được pha chung với dung dịch mẹ của vitamin Mặc dù đây là một cacbonhydrate chứ không phải là vitamin nhưng nó cũng được chứng minh là kích thích sự tăng trưởng tế bào đa số loài thực vật.[4]

Các vitamin khác như biotine, acid folic, acid ascorbic, panthothenic acid, vitamin E … cũng được sử dụng trong một số môi trường nuôi cấy

Inositol cũng được đề cập tới như một loại vitamin có tác dụng kích thich sự sinh trưởng và phát triển của cây một cách đáng kể.[13]

1.1.6.5 Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác

Mặc dù tế bào có khả năng tổng hợp tất cả các aminoacid cần thiết nhưng sự

bổ sung các aminoacid vào môi trường nuôi cấy là để kích thích sự tăng trưởng của

tế bào Việc sử dung amino acid đặc biệt quan trọng trong nuôi cấy tế bào và tế bào trần Amino acid cung cấp cho thực vật nguồn amino acid sẵn sàng cho nhu cầu của

tế bào và nguồn nitrogen này được tế bào hấp thu nhanh hơn nitrogen vô cơ.[3] Các nguồn nitrogen thường sử dụng trong nuôi cấy mô TBTV là hỗn hợp amino acid như casein hydrolysate, L-glutamine, L-asparagine và adnine

1.1.6.6 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật là các chất hữu cơ có bản chất hóa học khác nhau được tổng hợp với một lượng rất nhỏ trong các cơ quan, bộ phận nhất định của cây để điều hòa hoạt động sinh lý cũng như quá trình sinh trưởng và phát triển của cây nhằm duy trì mối quan hệ hài hòa giữa các cơ quan, các bộ phận trong

cơ thể thực vật

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật tham gia vào quá trình phân chia tế bào, phân hóa các mô, phát sinh phôi, tác dụng lên chức năng của DNA và RNA làm ảnh hưởng mạnh đến những quá trình chủ yếu của hoạt động sống thực vật như quá trình sinh tổng hợp các enzyme, hô hấp, dinh dưỡng rễ, quang hợp … Chính vì vậy chúng có tác dụng điều hòa sinh trưởng phát triển của cây Các chất điều hòa sinh truỏng bao gồm những chất sau:

a.Auxin

Auxin là chất điều hòa sinh trưởng được nghiên cứu đầu tiên với việc xác định cấu trúc hóa học đầu tiên vào năm 1934 Auxin là chất xúc tác cho sự sinh trưởng của cây trồng , có phổ hoạt động rộng hơn giberelin Tác động sinh lý của auxin đối với thực vật rất phức tạp Các mô thực vật khác nhau có phản ứng khác nhau đối với tác động của auxin Hoạt động của auxin tùy thuộc vào nồng độ và sự tác động tương hỗ giữa chúng với các chất điều hòa sinh trưởng khác.[3]

Auxin kết hợp chặt chễ với các thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được sử dụng phối hợp với cytokinine Khi nồng

độ cytokinine cao hơn auxin thì sẽ có sự tạo chồi từ mẫu cấy, ngược lại hoặc khi chỉ

xử lý với auxin thì rễ sẽ được tạo thành [3] [10]

Auxin đẩy mạnh sự sinh trưởng thông qua sự kéo dài tế bào Hiệu quả này là

do chúng thúc đẩy các hoạt động của enzyme, làm gia tăng tính đàn hồi của thành tế bào làm cho sự xâm nhập của nước vào trong tế bào được dễ dàng, giảm sức đề kháng của thành tế bào và tế bào tự kéo dài ra Auxin hoạt hóa các quá trình sinh tổng hợp các chất cao phân tử ( protein, xenluloza, pectin,… ) và ngăn cản sự phân

giải chúng Vì vậy, chúng có tác dụng làm chậm trễ quá trình già hóa, kích thích ra

rễ và xúc tiến sự sắp xếp của những rễ bất định

Nồng độ sử dụng của auxin liên quan chặc chẽ đến sự chiếu sáng, nhiệt độ và

sự có mặt của chất điều hòa sinh trưởng khác

Năm 1957 Skoog và Miller nuôi cấy mô cây thuốc lá cho thấy khả năng tạo chồi ở môi trường có nồng độ cytokinine cao và auxin thấp, tạo rễ trong môi trường

có nồng độ cytokinine thấp vào auxin cao Sau đó một vài năm, sự hình thành phôi sinh dưỡng bằng cách nuôi cấy trên môi trường có chứa 2,4D vì thế auxin chỉ được

sử dụng trong giai đoạn đầu của sự hình thành rễ bất định và phát sinh phôi soma, sau đó trở thành chất ức chế của các cơ quan và phôi mới được hình thành

Các chất điều hòa sinh trưởng trong nhóm auxin được biết đến như IBA Indolbutyric acid); IAA (3-Indolacetic acid); NAA (Naphtalenacecetic acid); 2,4D ( acid 2,4 Dichloropphenoxy acetic)

(3-b Cytokinine

Cytokine được phát hiện trong quá trình nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật vào năm 1945-1955 Nhưng đến năm 1965, Miller mới tách được chất hoạt tính sinh học này với tên gọi là kinetin, sau đó mới xác định được cấu trúc hóa học của

nó Cytokine là chất điều hòa sinh trưởng thực vật có tác dụng đẩy mạnh sự sinh trưởng của cây trồng.[6]

Cytokinine có khả năng kích thích sự phân chia tế bào, tính đặc hiệu của nó

là kích thích quá trình phân bào giảm nhiễm Bên cạnh đó cytokinine có vai trò quan trọng trong quá trình phân hóa tế bào và tạo mới các cơ quan Để thực hiện được quá trình phân hóa tế bào và tạo mới các cơ quan thì cytokinine phải kết hợp với auxin hoặc giberelin Nếu vắng mặt auxin hoặc giberelin thì quá trình phân hóa

tế bào và tạo mới các cơ quan sẽ không hiệu quả auxin thúc đẩy quá trình nhân đôi DNA và cytokinine cho phép tách rời các nhiễm sắc thể [6]

Trong nuôi cấy mô tế bào thực, cytokinine đẩy mạnh quá trình hình thành chồi mầm trong nhiều mô bao gồm mô sẹo Cytokinine rất có hiêu quả trong vai trò

kích thích tạo chồi trực tiếp hoặc gián tiếp trên thực vật nguyên vẹn cũng như trên

mô thực vật nuôi cấy invitro

Một tỉ lệ thích hợp giữa auxin và cytokinine sẽ có hiệu quả trên sự phát sinh hình thái mẫu cấy, khi nồng cytokinine cao hơn nồng độ cytokinine thì kích thích sự tạo chồi và ngược lại nồng độ auxin cao hơn cytokinine thì kích thích sự tạo rễ Nồng độ cytokinine cao thường cản hoặc làm chậm sự tạo rễ đồng thời cũng ngăn cản sự tăng trưởng của rễ và cản hiệu quả kích thích tạo rễ của auxin

Đại diện chính của cytokinine là kinetine được phát hiên trong dịch thủy phân nấm men Đặc trưng nhất của chất này là ngăn cản sự mất màu của lá trong tối, tăng cường sự xâm nhập của dòng chất dinh dưỡng và thúc đẩy sự phân chia tế bào khi nuôi cấy tế bào rời

Trong nhóm cytokinine còn bao gồm các chất thường được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô: BA (6-benzylaminopurin) và TDZ (1-phenyl 3-(1-2,3 thiadiazol-5yl) urea); Zeatine

Khi bổ sung giberelin vào môi trường nuôi cấy mô thực vật thì chúng thường

có tác dụng như auxin tự nhiên, sẽ làm giảm bớt hoặc ngăn cản sự tạo chồi,

Acid giberelic có ảnh hưởng chủ yếu lên sự phân hóa tế bào invitro ngoài sự tác động của auxin Tuy nhiên, sự tăng trưởng của chồi từ đỉnh sinh trưởng và mẫu cấy chồi cũng có thể tăng thêm khi bổ sung acid giberelic.[3][13]

d Ethylene

Ethylen là chất điều hoà sinh trưởng dạng khí Ethyllen có rất nhiều tác dụng đối với hoạt động sinh lý và trao đổi chất ở thực vật Đã từ lâu vai trò của ethyllen đối với việc làm tăng hô hấp trong thời gian quả chín đã được ứng

dụng nhiều Trong những năm gần đây đã xem xét tác dụng của ethyllen lên sự kéo dài thân và rễ, kích thích tế bào phát triển về bề ngang, kích thích nảy mầm, tạo lông rễ, tạo hoa ở dứa và lan, ức chế vận chuyển ngang và xuống của auxin [7]

1.1.6.7 Các chất bổ sung

a Nước dừa

Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chất kích thích sinh trưởng [15] Nước dừa đã được sử dụng để kích thích phân hóa

và nhân nhanh chồi ở nhiều loại cây Nước dừa thường được lấy từ quả dừa

để sử dụng tươi hoặc sau bảo quản Nước dừa thường sử dụng với nồng độ 5- 20% thể tích môi trường, kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi.[4]

b Dịch chiết nấm men

Có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của mô và tế bào Dịch chiết nấm men là chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô tế bào động vật với nồng độ thích hợp

Ngoài ra, có thể sử dụng dịch thủy phân casein hydrolyase (0,1- 1%) hoặc bột chuối với hàm lượng 40g bột tăng cường sự phát triển của mô sẹo hay cơ quan nuôi cấy

nhiên, than hoạt tính lại làm giảm hiệu quả của các chất điều hoà sinh trưởng Nồng

độ than hoạt tính thường sử dụng từ 0,2 - 0,3 % (w/v)

1.1.7 Các giai đoạn nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.1.7.1 Giai đoạn chuẩn bị

Mục đích chủ yếu của giai đoạn này là phải tạo ra nguồn nguyên liệu thực vật vô trùng để đưa vào môi trường nuôi cấy Khâu đầu tiên của giai đoạn này có thể coi như một bước thuần hoá vật liệu nuôi cấy

Cây giống được đưa ra khỏi nơi phân bố tự nhiên để chúng thích ứng với môi trường mới, đồng thời giảm bớt khả năng nhiễm bệnh của mẫu nuôi cấy và chủ động nguồn mẫu trong công tác nhân giống Trong trường hợp cần thiết có thể làm trẻ hoá vật liệu giống Khi đã có nguồn nguyên liệu nuôi cấy, tiến hành lấy mẫu và

xử lý mẫu cấy trong những điều kiện vô trùng

Người ta thường sử dụng một số loại hoá chất như: HgCl2 0,1 %, cồn 700,

H2O2, Ca(OCl)2 để khử trùng mẫu cấy Tuỳ thuộc vào từng loại vật liệu nuôi cấy

mà lựa chọn loại hoá chất, nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp.[7]

1.1.7.2 Giai đoạn tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục đích của giai đoạn này là tạo ra các chồi mới từ các mẫu vật đã được khử trùng và nuôi cấy trên môi trường thích hợp Về nguyên tắc thì mô nuôi cấy có thể là bất kỳ bộ phận nào của cây lấy từ các phần non của cây (thân, rễ, lá,…) nhưng theo Bhatt thì mô nuôi cấy lấy từ các phần non của cây có khả năng nuôi cấy thành công cao hơn mô lấy từ các bộ phận trưởng thành khác Vì vậy, người ta thường lấy chồi đỉnh hay chồi nách để nuôi cấy in vitro

Ngoài ra, khi lựa chọn mô nuôi cấy cần chú ý tuổi sinh lý của cây mô, các

mô ở thời kỳ sinh trưởng mạnh của cây trong mùa sinh trưởng cho khả năng tái sinh chồi tốt hơn

Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm bệnh thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt Giai đoạn này thường kéo dài trong 4-6 tuần

1.1.7.3 Giai đoạn nhân nhanh

Một trong những ưu thế lớn nhất của phương pháp nhân giống in vitro so với các phương pháp nhân giống truyền thống là có hệ số nhân cao Vì vậy giai đoạn nhân nhanh được coi là giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhân giống

Giai đoạn này sẽ kích thích mô nuôi cấy phát sinh nhiều chồi mầm cung cấp cho giai đoạn sau bằng cách cắt nhỏ những bộ phận mới sinh ở giai đoạn 2 và cấy chúng lên môi trường mới theo định kỳ Phải xác định được môi trường dinh dưỡng

và môi trường vật lý phù hợp để đạt hiệu quả cao nhất Trong giai đoạn này thì vai trò của các chất điều hoà sinh trưởng (auxin, cytokinin, gibberellin…), các chất phụ gia (nước dừa, chuối, khoai tây…) là cực kỳ quan trọng Tuỳ vào đối tượng nuôi cấy mà người ta có thể nhân nhanh theo hướng kích thích sự hình thành cụm chồi hoặc kích thích sự phát triển của chồi nách

Mặt khác, cũng cần đảm bảo các nhân tố vật lý (nhiệt độ, ánh sáng …) phù hợp Trong giai đoạn này cần tăng cường chiếu sáng (16 giờ/ ngày, cường độ ánh sáng tối thiểu 1000 lux, ánh sáng tím) là yếu tố quan trọng kích thích mô phân hoá mạnh Bảo đảm chế độ nhiệt 20-300C

Yêu cầu của giai đoạn này là tạo ra hệ số cao nhất nhưng không ảnh hưởng đến sức sống và bản chất di truyền của cây

1.1.7.4 Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh

Đây là giai đoạn các chồi đã đạt kích thước nhất định và được chuyển từ môi trường ở công đoạn 3 sang môi trường nuôi cấy tạo rễ để hình thành cây hoàn chỉnh Thường sau 2-3 tuần, từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Ở giai đoạn này môi trường cần giảm lượng cytokinin và tăng lượng auxin để rễ phát triển Các chất α- NAA, IBA, IAA thường được sử dụng ở nồng độ 0,1-5 mg/l để tạo rễ cho hầu hết các loài cây trồng Lúc này cây con rất nhạy cảm với ẩm độ và bệnh tật do hoạt động của lá và rễ mới sinh rất yếu, cây chưa chuyển sang giai đoạn tự dưỡng

1.1.7.5 Giai đoạn đưa cây mô ra ngoài vườn ươm

Đây là giai đoạn chuyển dần cây con từ ống nghiệm ra nhà kính rồi ra ngoài trời để tạo điều kiện cho cây con tự dưỡng hoàn toàn và thích nghi dần với môi trường tự nhiên Khi cây đủ tiêu chuẩn cứng cáp (chiều cao, số lá, rễ) thì mang trồng Giá thể phải đảm bảo tơi xốp và sạch bệnh Trong 2- 3 tuần đầu cần duy trì

độ ẩm trên 50%, tránh ánh sáng quá mạnh gây cháy lá, tránh nhiễm khuẩn và nấm gây hiện tượng thối nhũn Điều kiện môi trường trong giai đoạn này là rất quan trọng, cần tạo điều kiện cho bộ rễ phát triển, cứng cáp và phòng bệnh cho cây Đây được xem là công đoạn quyết định khả năng ứng dụng quy trình này trong thực tiễn sản xuất

1.1.8 Các yếu tố khác ảnh hưởng đến nhân giống nuôi cấy mô TBTV

1.1.8.1 Điều kiện vô trùng

a Vô trùng mẫu cấy

Mẫu cấy có thể là hầu hết các bộ phận khác nhau của thực vật như hạt giống, phôi, noãn, đế hoa, lá, đầu rễ, thân củ…Tuỳ theo sự tiếp xúc với môi trường bên ngoài, các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn và nấm Đòng lúa non khi còn trong bẹ, mô thịt bên trong quả… thường ít bị nhiễm vi sinh vật; ngược lại, lá, thân đặc biệt ở các bộ phận nằm sâu trong đất như rễ, củ… có lượng nấm, khuẩn tạp rất cao Hầu như không thể vô trùng mô cấy được nếu nấm, khuẩn nằm sâu ở các tế bào bên trong mô chứ không hạn chế ở bề mặt Lá khoai lang có thể vô trùng dễ dàng trong mùa khô nhưng không thể làm được trong mùa mưa Phương pháp vô trùng

mô cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hoá học có hoạt tính diệt nấm khuẩn Hiệu lực diệt nấm khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ ngách lồi lõm trên bề mặt mô cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô cấy Để tăng tính linh động

và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, thông thường người ta xử lý mô cấy trong vòng 30s trong rượu ethylic 70% sau đó mới xử lý dung dịch diệt khuẩn

Đồng thời người ta thêm các chất giảm sức căng bề mặt như Tween 80, Fotoflo, Teepol vào dung dịch diệt nấm khuẩn.[14]

b Vô trùng dụng cụ và môi trường nuôi cấy

Dụng cụ thuỷ tinh

Thông thường các dụng cụ thuỷ tinh dùng trong các thí nghiệm thường được

xử lý bằng dung dịch sulfocromate một lần đầu trước khi đưa vào sử dụng; về sau chỉ cần rửa sạch bằng xà phòng, tráng sạch bằng nước cất và để thật ráo trước khi sử dụng

Trong trường hợp các dụng cụ thuỷ tinh dùng trong các thí nghiệm nuôi cấy

mô và tế bào thực vật đòi hỏi vô trùng, có thể khử trùng trong tủ sấy ở nhiệt độ cao trong nhiều phút hoặc nhiều giờ Các dụng cụ này luôn được gói trong giấy nhôm hoặc hộp kim loại để tránh bị nhiễm trở lại sau khi đã khử trùng.[17]

Nút đậy

Thường dùng nhất là các nút đậy làm bằng bông gòn không thấm nước.Nút phải tương đối chặt để đảm bảo bụi không đi qua được, đồng thời nước từ môi trường không bị bốc hơi quá dễ dàng trong quá trình nuôi cấy Bông không thấm nước là loại nút đơn giản nhất nhưng có các nhược điểm sau:

- Nếu khi hấp nút bông bị ướt hoặc dính môi trường thì về sau sẽ rất dễ bị nhiễm nấm, nhất là với những thí nghiệm tiến hành trong một thời gian dài

- Thao tác làm nút bông chậm, không thuận tiện khi nuôi cấy trên qui mô lớn

- Chỉ dùng được vài lần là phải bỏ

Hiện nay người ta sử dụng nhiều loại nắp đậy khác thay thế nút bông Các hãng sản xuất dụng cụ nuôi cấy mô cung cấp loại nắp ống nghiệm và bình tam giác bằng nhựa chịu nhiệt có thể hấp vô trùng ở nhiệt độ 1210C mà không bị biến dạng Một số phòng thí nghiệm dùng nắp ống nghiệm bằng inox hoặc cao su rất thuận tiện cho việc vô trùng khô hoặc ướt Cũng có thể sử dụng giấy nhôm để làm nắp đậy…

Môi trường

Môi trường nuôi cấy thường được hấp khử trùng trong nồi hấp (autoclave), khử trùng bằng áp suất hơi nước bão hòa Thời gian hấp từ 15-30 phút ở áp suất hơi

nước bão hòa là 103,4 kPa (1atm) tương đương với nhiệt độ 1210C Ở nhiệt độ

1210C, hầu hết các sinh vật có trong môi trường đều bị tiêu diệt, kể cả ở dạng bào

tử Sau khi vô trùng cần phải làm khô nắp ống nghiệm hoặc nút bông để tránh bị nhiễm trở lại.[17]

Việc hấp khử trùng bằng nồi hấp thì không thích hợp với nhiều hoá chất nhạy cảm với nhiệt độ như: các acid amin, các vitamin, các hormon tăng trưởng, và các chất kháng sinh Các chất như vậy thường phải được khử trùng bằng cách lọc vô trùng Màng lọc được làm bằng màng polyethylen hoặc sợi cellulose Các lỗ trên màng siêu lọc này được thiết kế hiệu quả cho việc giữ lại các vi sinh vật gây nhiễm

Lọc vô trùng

Phương pháp đơn giản nhất là dùng các màng lọc Millipore hoặc dùng các phểu lọc thủy tinh xốp số 5 Một số loại màng lọc vô trùng của hàng Millipore Đây

là loại màng lọc đã được khử trùng bằng chiếu xạ và chỉ dùng 1 lần

Phương pháp sử dụng màng lọc Millipore: hãng Millipore cung cấp màng lọc

và giá đỡ bằng nhựa hịu nhiệt Dưới đây mô tả màng lọc loại Millipore Swinex có đường kính 25mm Bộ lọc gồm có giá đỡ bằng loại nhựa chịu nhiệt gồm nắp và đế, vòng cao su và màng lọc Đặt màng lọc (có kích thước lỗ 0,25µm) trên đế, đặt vòng cao su lên và vặn chặt nắp vào đế Gói toàn bộ bộ lọc vào trong một tờ giấy nhôm

và khử trùng trong autoclave ở 121oC trong 15-20 phút Đồng thời cũng hấp vô trùng một bình huỷ tinh để hứng dịch lọc Dùng ống tiêm hút dịch lọc và bơm qua

bộ lọc.[17]

1.1.8.2 Ánh sáng và nhiệt độ

Ánh sáng: Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu

tố như: thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng.Thời gian chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy Thời gian chiếu sáng thích hợp với đa số các loài cây là 12 – 18 h/ngày Cường độ ánh sáng tác động đến

sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy Cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000 lux (Morein, 1974), chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát

sinh hình thái của mô thực vật invitro: ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân

chồi hơn so với ánh sáng trắng Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế sinh trưởng chiều cao nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo Hiện nay trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô để cung cấp nguồn ánh sáng có cường độ 2000 - 2500 lux người ta sử dụng các dàn đèn huỳnh quang đặt cách bình nuôi cấy từ 35- 40 cm

Nhiệt độ : có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của cây nuôi cấy in-vitro Tùy thuộc vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp Nhìn chung nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây

là 20-250C Một số loại cây cần có nhiệt độ tối ưu để tạo hình

1.1.8.3 pH môi trường

Tế bào và mô thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng và phát triển trong nuôi cấy Trong khi chuẩn bị môi trường, pH có thể được điều chỉnh đến giá trị cần thiết của thí nghiệm Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào Vì vậy, đối với từng loại môi trường nhất định và từng trường hợp cụ thể của các loài cây phải chỉnh độ pH của môi trường về mức ổn định ban đầu.[4]

pH của đa số các môi trường nuôi cấy được điều chỉnh trong phạm vi 5,5-6,0 pH dưới 5,5 làm agar khó chuyển sang trạng thái gel, còn pH lớn hơn 6,0 agar có thể rất cứng

1.2 Giới thiệu về cây lan gấm

1.2.1 Phân loại thực vật

Lan Gấm Anoectochilus setaceus Blume

đồng danh là Anoectochilus roxburghi Wall

Họ: Phong lan Orchidaceae Bộ: Phong lan Orchidales Chi Lan Gấm (Anoectochilus) còn được gọi là lan trang sức vì vẻ đẹp hấp

dẫn của nó, được Carlvon Blume mô tả đầu tiên năm 1810 thuộc phân họ Orchidoideae Trên thế giới đã thống kê được 51 loài Ở Việt Nam hiện thống kê

được 12 loài, trong đó loài Lan Gấm (Anoectochilus setaceus Blume) được biết

đến chủ yếu với công dụng làm thuốc

1.2.2 Đăc điểm thực vật

Lan gấm là cây thảo, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài; thân trên đất mọng nước mang 2-6 lá mọc xoè sát đất Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, chóp hơi nhọn và có mũi ngắn, cỡ 3-5 x 2-3cm Lá thông thường có màu nâu đỏ ở mặt trên Số lượng lá trên cây thay đổi từ 2-6 lá, thông thường có 4 lá Lá mọc cách xoắn quanh thân, xoè trên mặt đất Kích thước của lá cũng thay đổi, thường dài từ 3-5cm, trung bình là 3,5cm và rộng của lá từ 2-4cm, trung bình là 3cm Các lá trên một cây thường có kích thước khác nhau rõ rệt Chiều rộng trung bình của các lá trên một cây là 2,5cm

Hệ gân lá mạng lưới lông chim, thường có 5 gân gốc Các gân này thường có màu hồng ở mặt trên và nổi rất rõ Đôi khi gân ở giữa có màu vàng nhạt Mặt dưới lá có màu nâu đỏ nhạt, nhẵn với 5 gân gốc nổi rõ Các gân bên ở phía rìa lá nổi rõ, gân ở giữa lá ở mặt dưới không rõ Cuống lá dài 0,5 - 1,2cm, thường nhẵn và có màu trắng xanh, đôi khi hơi đỏ tía ở bẹ lá Bẹ lá nổi rõ và nhẵn Đôi khi có một số cây thì toàn bộ lá có màu xanh lục sẫm Tuy nhiên, hệ thống gân lá rất giống với loài đã mô

tả Một số lá lại có 2 màu Phía ngoài màu nâu đỏ, phía trong màu xanh vàng nhạt Đối với những lá này thì gân ở giữa lá không rõ [16]

Hoa tự chùm mọc ở đầu ngọn thân, trục hoa dài từ 5-20cm, thường phủ lông màu nâu đỏ, mang từ 4-10 hoa Mùa hoa nở tháng 9-12 Mùa quả chín tháng 12-2 năm sau Hoa có cánh môi màu trắng Hai bên rìa mang từ 6-8 râu mỗi bên

Về mặt cấu tạo, lan gấm có các đặc điểm sau:

Đặc điểm thân rễ: Thân rễ nằm ngang sát mặt đất, đôi khi hơi nghiêng, bò dài Chiều dài thân rễ từ 5-14cm, trung bình là 9,4cm Đường kính thân rễ từ 2,5-4,0cm, trung bình là 3,05cm Số lóng trên thân rễ từ 3-10 lóng, trung bình là 4,71 lóng Chiều dài của lóng từ 1-6cm, trung bình là 2,01cm Thân rễ thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu nâu đỏ, thường nhẵn, không phủ lông.[9]

Hình 1.1: Cây lan gấm Anoectochilus setaceus Blume

Đặc điểm thân khí sinh: Thân khí sinh thường mọc thẳng đứng trên mặt đất,

ít khi mọc nghiêng Chiều dài thân khí sinh từ 4-6cm, trung bình 5,4cm Đường kính thân khí sinh từ 2,5-3,5cm, trung bình là 2,98cm Thân khí sinh mang nhiều lóng, các lóng có chiều dài khác nhau Số lóng trên thân khí sinh thay đổi từ 2-4 lóng, trung bình là 3,6 Chiều dài mỗi lóng từ 1-4cm, trung bình 1,52cm Thân khí sinh thường mọng nước, nhẵn, không phủ lông; thường có màu xanh trắng, đôi khi

có màu hồng nhạt.[9]

Đặc điểm của rễ: Rễ được mọc ra từ các mấu trên thân rễ Đôi khi rễ cũng được hình thành từ thân khí sinh Rễ thường đâm thẳng xuống đất Thông thường mỗi mấu chỉ có một rễ, đôi khi có vài rễ cùng được hình thành từ một mấu trên thân

rễ Số lượng và kích thước rễ cũng rất thay đổi tuỳ theo cá thể Số rễ trên một cây thường từ 4-10 rễ, trung bình là 5,9 rễ Chiều dài của rễ thay đổi từ 0,5-10cm, rễ dài nhất trung bình là 5,03cm và ngắn nhất trung bình là 0,96cm, chiều dài trung bình của các rễ trên một cây là 3,47cm.[9]

Đặc điểm lá cây: Số lượng lá trên một cây thay đổi từ 2-6 lá, thông thường

có 4 lá Lá mọc cách xoắn quanh thân, xoè trên mặt đất Kích thước của lá cũng thay đổi, thường dài từ 3-5cm, trung bình là 3,75cm và rộng của lá từ 2-4cm, trung bình là 2,95cm Các lá trên một cây thường có kích thước khác nhau rõ rệt.[9]

1.2.3 Sự phân bố

Lan gấm rất khó tìm, vì cây mọc rải rác trong rừng sâu, vùng núi đá vôi, nơi

ẩm, dọc theo khe suối, ở độ cao 300-1000m Ở Việt Nam, lan gấm thường phân bố ở các tỉnh: Lào Cai (Sapa), Hà Giang (Quảng Bạ), Yên Bái, Vĩnh Phúc (Tam Đảo),

Hà Tây (Mỹ Đức: Chùa Hương), Quảng Trị (Đồng Chè), Kom Tum (Đắc Tô: Đăc Uy), Gia Lai (Kbang: Kon Hà Nừng), Lâm Đồng, Ninh Thuận, Bình Thuận …

Trên thế giới, lan gấm thường gặp ở các nước: Trung Quốc (Vân Nam, Quảng Đông), Ấn Độ, Lào, Inđônêxia, Nhật Bản, Nêpan, Xri Lanca, Việt Nam

1.2.4 Tính dược liệu và công dụng

Lan gấm là loài cây thuốc rất đặc biệt có tác dụng tăng cường sức khoẻ, làm khí huyết lưu thông, có tính kháng khuẩn, chữa các bệnh viêm khí quản, viêm gan mãn tính, chữa suy nhược thần kinh Theo Nguyễn Tiến Bân, Dương Đức Huyến thì loài lan này được dùng làm thuốc chữa bệnh trị lao phổi, phong thấp, đau nhức khớp xương, viêm dạ dày mãn tính Trước đó, trong sách Khoa học quốc dược quyển I

kỳ 2 (năm 1958) của ông Tạ A Mộc và Trần Kiến Đào (đăng tải trong tạp chí Đài Loan dân gian dược dụng thực vật) có nói đến lan Gấm (A.setaceus) là một trong những dược thảo quý giá, giúp bổ máu, dưỡng âm, chữa trị nóng phổi và nóng gan

Theo đông y, lan gấm có vị ngọt, hơi chát, tính mát, có tác dụng dư âm nhuận phế, làm mát phổi, máu sinh tân dịch, tiêu viêm, lọc máu Do đó, lan gấm được dùng để chữa lao phôi, khô phổi, ho, khạc, ra máu, thần kinh suy nhược chứ không phải chữa tim mạch hay ung thư như mọi người đồn đại

Theo một số chuyên gia ở Đài Loan, cây lan gấm vô cùng quý giá, có bán tại các tiệm thuốc Bắc trong nhân dân, là một loại cây nổi tiếng, có tác dụng làm tăng cường sức khỏe và lưu thông khí huyết Ngoài ra, cây lan gấm còn dùng để chữa

thần kinh suy nhược, chữa ho khan, đau họng, cao huyết áp, suy thận, chữa di tinh, đau lưng, phong thấp làm tiêu đờm, giải độc, giải nhiệt, chữa các bệnh khí quản, viêm gan mãn tính

1.2.5 Tình hình nghiên cứu cây lan gấm

Năm 2001: các tác giả Yih-Juh Shiau và cộng sự đã nghiên cứu và nhân

giống thành công loài lan gấm Anoectochilus formosanus Hayata từ hạt đem lại

triển vọng sản xuất số lượng lớn loài lan này

Năm 2005: các tác giả Ông Chun-nian He và cộng sự đã nghiên cứu các hợp

chất có trong loài lan gấm Anoectochilus roxburghi và tìm ra đăc tính lâm sàng cụ

thể và hiệu quả của loại cây thảo dược này

Năm 2004: Tiến sĩ Nguyễn Văn Kết cũng đã đưa ra quy trình nhân giống in

vitro thành công cho loài lan Kim tuyến ( A formosanus) với vật liệu ban đầu là từ

chồi đỉnh tại trường Đại học tổng hợp quốc gia Hàn Quốc Năm 2009: Phùng Văn Phê, Nguyễn Trung Thành, Vương Duy Hưng nghiên cứu về Đặc điểm hình thái,

phân bố của loài lan oectochilus setaceus blume ở Vườn Quốc gia Tam Đảo, tỉnh

Vĩnh Phúc

Năm 2010: Phùng Văn Phê, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Trung Thành

đã nghiên cứu về quá trình nhân nhanh chồi của lan gấm

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu đề tài là cây lan gấm (Anoectochilus setaceus Blume)

được Trung tâm ứng dụng và chuyển giao công nghệ - Sở khoa học và công nghệ Tỉnh Phú Yên thu thập trên địa bàn tỉnh Phú Yên và trồng thử nghiệm tại trung tâm

Nguồn mẫu bình giống tại phòng nuôi cấy mô của Trung tâm ứng dụng và chuyển giao công nghệ tỉnh Phú Yên

2.1.2 Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy sử dụng các loại môi trường cơ: MS (Murashige và Skoog, 1962) VW (Vacin và Went, 1949), KC (Kundson C), ngoài ra môi trường có

Môi trường sau khi pha chế được đổ vào bình tam giác có dung tích 250ml với lượng 60 ml môi trường/bình Các bình được đem đi hấp khử trùng ở nhiệt độ

121oC trong thời gian 20 phút Sau đó, chúng được lưu giữ ở điều kiện 25oC trong 5-7 ngày để kiểm tra độ nhiễm trước khi cấy mẫu

2.1.3 Điều kiện nuôi cấy

- Nhiệt độ phòng cấy: 25 ± 2oC

- Cường độ chiếu sáng: 2000 ÷ 3000 lux

- Thời gian chiếu sáng: 16h/ngày