Nghiên cứu cải tiến quy trình nhân giống in vitro một số giống lan thuốc thuộc chi hoàng thảo (dendrobium)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI    TRẦN THẾ MAI NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO MỘT SỐ GIỐNG LAN THUỐC THUỘC CHI HOÀNG THẢO (DENDROBIUM) LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 60.42.80 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. NGUYỄN THỊ LÝ ANH HÀ NỘI – 2012 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan rằng các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam ñoan rằng mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Trần Thế Mai Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… ii LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành bản luận văn này tôi ñã nhận ñược sự giúp ñỡ về nhiều mặt của các cấp lãnh ñạo, các tập thể và cá nhân. Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng tới PGS.TS Nguyễn Thị Lý Anh, GS.TS Nguyễn Quang Thạch, ThS. Nguyễn Thị Sơn ñã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp ñỡ tôi hoàn thành bản luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh ñạo và các cán bộ Viện Sinh học Nông nghiệp ñã giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình tôi làm việc và thực hiện ñề tài nghiên cứu của mình. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ban lãnh ñạo Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học, Viện ñào tạo sau ñại học, các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật ñã tạo mọi ñiều kiện giúp ñỡ tôi về kiến thức và chuyên môn trong suốt 2 năm học tập và làm luận văn. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia ñình, người thân và bạn bè ñã cổ vũ, ñộng viên, giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện ñề tài. Một lần nữa tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, tháng 9 năm 2012 Tác giả luận văn Trần Thế Mai Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình ix 1 MỞ ðẦU 1 1.1 ðặt vấn ñề 1 1.2 Mục ñích và yêu cầu 1 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1 Giới thiệu về chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium 4 2.1.1 Vị trí phân bố và phân loại lan chi Hoàng Thảo (Dendrobium) 4 2.1.2 ðặc ñiểm hình thái của chi lan Hoàng Thảo 4 2.1.3 ðặc ñiểm sinh thái học chi Hoàng Thảo 6 2.1.4 ðặc ñiểm hình thái và giá trị sử dụng của loài Dendrobium nobile Lindl. và Dendrobium chrysanthum Lindl. 8 2.2 Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 9 2.2.1 Tính toàn năng của tế bào 9 2.2.2 Sự phản phân hoá và phân hoá của tế bào 9 2.2.3 Quy trình nhân giống in vitro 10 2.2.4 Một số kỹ thuật sử dụng trong nhân giống in vitro. 12 2.2.5 Các yếu tố vật lý ảnh hưởng ñến quá trình nuôi cấy in vitro 19 2.2.6 Nghiên cứu nuôi cấy mô cây lan Hoàng Thảo trên thế giới và ở Việt Nam 22 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iv 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 3.1 ðối tượng, vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 30 3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 31 3.2.1 Nội dung nghiên cứu 31 3.2.2 Phương pháp nghiên cứu 31 3.3 ðiều kiện thí nghiệm 40 3.4 Các chỉ tiêu theo dõi 40 3.5 Xử lý số liệu 41 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của các ñiều kiện nuôi cấy ñến khả năng nhân protocorm và cụm chồi cây lan Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng. 42 4.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của các hệ thống nuôi cấy ñến khả năng nhân protocorm và cụm chồi cây lan Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng. 43 4.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH dung dịch nuôi cấy trên hệ thống Bioreactor Plantima ñến khả năng nhân protocorm và cụm chồi cây lan Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng. 49 4.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nghỉ phun ñến khả ngăng nhân protocorm và cụm chồi. 50 4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của các chế ñộ chiếu sáng ñến khả năng sinh trưởng của cây in vitro. 52 4.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại ánh sáng ñến sinh trưởng của cây. 52 4.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của cường ñộ ánh sáng ñến sinh trưởng của cây 57 4.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của quang chu kỳ ñến sinh trưởng của cây 61 4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của các kỹ thuật trồng và chăm sóc ñến khả năng thích ứng của cây lan in vitro ngoài vườn ươm. 62 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… v 4.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của các phương thức nuôi trồng khác nhau ñến khả năng sinh trưởng của cây ở vườn ươm 63 4.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của các thời vụ trồng ñến khả năng thích ứng của cây ở vườn ươm. 66 4.3.3 Ảnh hưởng của các dung dịch dinh dưỡng khác nhau ñến sinh trưởng và phát triển cây lan. 68 4.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH dung dịch ñến sự sinh trưởng của cây trên hệ thống khí canh 70 4.3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của ñộ dẫn ñiện (Electrical Conductivity : EC) trong dung dịch trên hệ thống khí canh lên sinh trưởng cây lan. 72 4.3.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của chu kỳ phun ñến sinh trưởng của cây. 73 4.3.7 Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại thuốc bảo vệ thực vật và các chế phẩm vi sinh ñến khả năng phòng bệnh của cây. 75 5 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 79 5.1 Kết luận 79 5.2 ðề nghị 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO 80 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CT Công thức CV(%) Hệ số biến ñộng (Correlation of Variants) ðC ðối chứng HSN Hệ số nhân MS Murashige & Shoog, 1962 LSD 0,05 Sai khác tối thiểu có ý nghĩa ở P = 0.5 (Least Significant Difference) ND Nước dừa KC Knudson C, 1965 RE Robert Ernst, 1979 THT Than hoạt tính VW Vacin & Went, 1949 TB Trung bình BP Bioreactor Plantima Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 4.1 Ảnh hưởng của các PTNC ñến hệ số nhân (HSN) protocorm, cụm chồi cây lan Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng 44 4.2 Ảnh hưởng của pH dung dịch ñến hệ số nhân protocorm và cụm chồi cây Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng trên hệ thống BP sau 1 tháng 50 4.3 Ảnh hưởng của thời gian nghỉ phun ñến khả năng nhân protocorm và cụm chồi cây Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàngtrên hệ thống BP sau 1 tháng 51 4.4 Ảnh hưởng của loại ánh sáng ñến một số chỉ tiêu sinh lý của Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng sau 2 tháng 55 4.5 Ảnh hưởng của cường ñộ ánh sáng một số chỉ tiêu sinh lý của cây Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng sau 2 tháng 59 4.6 Ảnh hưởng của quang chu kỳ ñến sinh trưởng của cây lan Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng sau 2 tháng 61 4.7 Ảnh hưởng của phương thức nuôi trồng ñến sinh trưởng cây trên hệ thống khí canh cây Hoàng Thảo Thạch Hộc sau 1 tháng 63 4.8 Ảnh hưởng của phương thức nuôi trồng ñến sinh trưởng cây trên hệ thống khí canh cây Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng sau 1 tháng 64 4.9 Ảnh hưởng của các thời vụ trồng ñến sinh trưởng của cây trên hệ thống khí canh cây Hoàng Thảo Thạch Hộc sau 1 tháng 66 4.10 Ảnh hưởng của các thời vụ trồng ñến sinh trưởng của cây trên hệ thống khí canh cây Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng sau 1 tháng 67 4.11 Ảnh hưởng của các dung dịch dinh dưỡng ñến sinh trưởng của cây trên hệ thống khí canh cây Hoàng Thảo Thạch Hộc sau 3 tháng 69 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… viii 4.12 Ảnh hưởng của các dung dịch dinh dưỡng ñến sinh trưởng của cây trên hệ thống khí canh cây Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng sau 3 tháng 69 4.13 Ảnh hưởng của nồng ñộ EC ñến sinh trưởng cây lan Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng trên hệ thống khí canh sau 3 tháng 72 4.14 Ảnh hưởng của thời gian nghỉ phun ñến sinh trưởng của cây lan Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng trên hệ thống khí canh sau 3 tháng 74 4.15 Ảnh hưởng của các thuốc bảo vệ thực vật và chế phẩm vi sinh vật ñến khả năng phòng bệnh của cây trồng trên giá thể sau 2 tháng 78 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… ix DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 3.1 ðồ thị quang phổ ánh sáng của các hệ thống chiếu sáng nghiên cứu 34 3.2 Sơ ñồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của cường ñộ ánh sáng ñến sinh trưởng của 02 loài lan Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng 35 3.3 Sơ ñồ hệ thống khí canh- Viện Sinh học Nông nghiệp – ðHNN HN 37 4.1 Prtocorm (a), cụm chồi (b) cây lan Hoàng Thảo Thạch Hộc và cụm chồi (c) cây lan Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng sau 2 tháng trên các hệ thống bình nuôi cấy trao ñổi khí không hoàn toàn (ðC), không trao ñổi khí (CT2) và trao ñổi khí hoàn toàn CT3). 46 4.2 Prtocorm(a), cụm chồi(b) cây lan Hoàng Thảo Thạch Hộc và cụm chồi(b) cây lan Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng sau 2 tháng trên các hệ thống bình thoáng khí hoàn toàn nuôi cấy có nền môi trường ñặc (CT3), lỏng tĩnh (CT4) và lỏng lắc (CT5). 47 4.3 Prtocorm (a), cụm chồi (b) cây lan Hoàng Thảo Thạch Hộc và cụm chồi (c) cây lan Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng sau 1 tháng trên hệ thống bipreactor Plantima (BP) 47 4.4 Quang phổ ánh sáng ñèn LED 53 4.5 Quang phổ ánh sáng ñèn T8 – ñỏ 54 4.6 Quang phổ ánh sáng ñèn T8-Deluxe 54 4.7 Quang phổ ánh sáng ñèn T10 54 4.8 Cây lan Hoàng Thảo Thạch Hộc(a) và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng (b) in vitro sinh trưởng trong các ñiều kiện bóng sáng khác nhau sau 2 tháng 56 [...]... năng nhân gi ng in vitro và kh năng nuôi cây con trong vư n ươm c a m t s loài lan dư c li u thu c chi Hoàng Th o (Dendrobium) - Các k t qu thu ñư c s làm cơ s cho vi c nghiên c u và gi ng d y ñ i v i cây lan dư c li u Hoàng Th o (Dendrobium) 1.3.2 Ý nghĩa th c ti n ð xu t ñư c quy trình nhân gi ng in vitro và nuôi tr ng cây con ngoài vư n ươm cho m t s loài lan dư c li u thu c chi Hoàng Th o (Dendrobium). .. ng lan Hoàng Th o c t cành ð c bi t, trong 2 năm g n ñây Vi n ñã thành công trong nhân gi ng in vitro m t s loài lan dư c li u b n ñ a Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p …………………… 1 thu c chi Hoàng Th o Tuy nhiên trong quá trình nhân gi ng còn m t s h n ch như h s nhân và t c ñ tăng trư ng in vitro chưa cao, t l s ng và sinh trư ng sau giai ño n nuôi c y in vitro. .. Hoàng Th o (Dendrobium) 1.2 M c ñích và yêu c u 1.2.1 M c ñích Hoàn thi n ñư c quy trình nhân gi ng in vitro nâng cao h s nhân và ch t lư ng cây gi ng cho 02 loài lan dư c li u thu c chi Hoàng Th o 1.2.2 Yêu c u - Xác ñ nh ñư c nh hư ng c a phương pháp nuôi c y l ng l c ñ n kh năng nhân nhanh protocorm và ch i in vitro - Xác ñ nh ñư c hư ng c a phương pháp nuôi c y thoáng khí ñ n kh năng nhân nhanh... n Sinh h c Nông nghi p ñã thành công trên cây khoai tây, cà chua, c m chư ng, cúc và nhi u lo i cây tr ng khác V i m c ñích hoàn thi n quy trình nhân gi ng áp d ng phương pháp công ngh m i nh m làm gi m chi phí s n xu t và kh c ph c s th ñ ng trong s n xu t cây gi ng hi n nay Chúng tôi ti n hành th c hi n ñ tài: Nghiên c u c i ti n quy trình nhân gi ng in vitro m t s gi ng lan thu c thu c chi Hoàng. .. năng nhân nhanh protocorm và ch i in vitro - Xác ñ nh ñư c ch ñ chi u sáng thích h p nh t cho s sinh trư ng c a cây Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p …………………… 2 - Xác ñ nh ñư c k thu t ra cây ñ t hi u qu cao nh t v t l s ng và sinh trư ng c a cây in vitro vư n ươm - ð xu t quy trình nhân gi ng in vitro ñã ñư c c i ti n v i h s nhân cao hơn, ch t lư ng cây gi ng... ð th bi u di nchi u cao (a) và s lá (b) c a cây Hoàng Th o Th ch H c và Hoàng Th o Ng c V n Vàng dư i tác d ng c a các lo i bóng sáng sau 2 tháng 4.10 Cây lan Hoàng Th o Th ch H c(a) và Hoàng Th o Ng c V n Vàng (b) in vitro sinh trư ng trong các cư ng ñ chi u sáng khác nhau 4.11 57 59 ð th bi u di n nh hư ng cư ng ñ ánh sáng ñ n chi u cao (a) và s lá (b) c a cây Hoàng Th o Th ch H c và Hoàng Th o Ng... c: Theo dư c ñi n Trung Qu c 1997 (b n in ti ng Anh) dùng nhi u loài làm Hoàng Th o Th ch H c như D.Loddigesii Rolfe, D.fimbriatum Hook., D.chrysanthum Wall.ex Lind., D.nobile Lindl Hoàng Th o Th ch H c ch a alcaloid sesquiterpen, dendrobine (alcaloid chính), nobilin, dendroxin, dendramin, dendrin, 8-hydroxydendroxin, 3-hydroxy- 2-oxodendrobine, 6-hydroxydendroxin Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i –... sáng c a lan Hoàng Th o kho ng 70-80% ánh sáng tr c ti p Trong ñi u ki n râm mát cây thư ng y u, m ng nư c, r t d nhi m b nh V mùa ñông cư ng ñ ánh sáng y u và th i gian chi u sáng ng n, ñ lan Hoàng Th o sinh trư ng và phát tri n t t và ra hoa ñư c thì c n b sung ánh sáng b ng cách th p ñi n cho vư n lan (Bùi Th Hi n, 2009) Dinh dư ng: Lan Hoàng Th o yêu c u m t lư ng dinh dư ng nh t ñ nh ñ sinh trư... gi ng lan nói chung và lan dư c li u nói riêng c n ph i có s lư ng l n cây gi ng có ch t lư ng cao Mu n ñáp ng ñư c nhu c u v cây gi ng nêu trên thì vi c nhân gi ng lan b ng công ngh nuôi c y mô t bào là ñi u b t bu c ph i th c hi n Trong nhi u năm qua, Vi n Sinh h c Nông nghi p – ð i h c Nông nghi p Hà N i ñã ti n hành nghiên c u và hoàn thi n ñư c quy trình nhân gi ng in vitro cho nhi u lo i lan thương... tách riêng t ng t bào ho c gi m kích thư c c a kh i mô s t o ñi u ki n thu n l i cho s ho t hóa các gen c a t bào 2.2.3 Quy trình nhân gi ng in vitro Theo Georger (1993) quá trình nhân gi ng in vitro bao g m các bư c sau: * Ch n l c và chu n bi cây m Trư c khi ti n hành nhân gi ng in vitro c n ch n l c các cây m các cây Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p …………………… . NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO MỘT SỐ GIỐNG LAN THUỐC THUỘC CHI HOÀNG THẢO (DENDROBIUM) LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: . giảm chi phí sản xuất và khắc phục sự thụ ñộng trong sản xuất cây giống hiện nay. Chúng tôi tiến hành thực hiện ñề tài: Nghiên cứu cải tiến quy trình nhân giống in vitro một số giống lan thuốc. thuộc chi Hoàng Thảo. Tuy nhiên trong quá trình nhân giống còn một số hạn chế như hệ số nhân và tốc ñộ tăng trưởng in vitro chưa cao, tỷ lệ sống và sinh trưởng sau giai ñoạn nuôi cấy in vitro