c. Hệ thống nuôi cấy mô trong bioreactor
2.2.6. Nghiên cứu nuôi cấy mô cây lan Hoàng Thảo trên thế giới và ở Việt Nam
* Tình hình nuôi cấy mô lan Hoàng Thảo trên thế giới
Một số kết quả ựạt ựược trong nhân giống một số loài Dendrobium
bằng phương pháp nuôi cấy mô (theo George, 1993)
Dendrobium là loài lan ựược kinh doanh phổ biến trong thị trường hoa lan trên thế giớị Một số phương pháp nuôi cấy phát sinh cụm chồi qua nuôi cấy ựỉnh sinh trưởng và phôi PLB ựã ựược báo cáo (Manorama và cs, 1986; Artidi và Ernst, 1993; Nayak và cs, 1997, 2002). Nuôi cấy phát sinh phôi vô tắnh trong môi trường lỏng ựược ựặc biệt quan tâm do là một hệ thống nuôi cấy thắch hợp nhân nhanh công nghiệp trong các hệ thống bioreactor (Zimmerman, 1993). Nuôi cấy hạt Dendrobium ựầu tiên ựược Itsuhyko Ito thực hiện tại phòng thắ nghiệm đại học Kyoto (Ito, 1966,1967).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 23
Tên loài Mẫu cấy Kết quả Tác giả
D. bigibbum
Lindl.
đoạn thân Tái sinh chồi bên Kukylezanka and Wojciechowska, 1983
D. spp Chồi ngọn Tạo và nhân
nhanh protocorm
Morel, 1965
D. spp Chồi ngọn và
chồi bên
Tạo protocorm và tái sinh cây con
Sagawa and
Kunisaki, 1982
D.spp. Các mắt thân của
cây trưởng thành
Cho sự kéo dài chồi bên
Ball and Arditti , 1976 D. superbiens var.superba đỉnh sinh trưởng chồi ngọn Tạo và nhân nhanh protocorm Morel, 1974
D. lacniosum đỉnh sinh trưởng của chồi ngọn và chồi bên
Tạo sự khởi ựầu và nhân nhanh tiền củ (protocorm) Lim-Ho, 1982 D.Miss Hawaii Các mắt của cọng hoa
Tái sinh chồi từ mắt
Nuraini and
Mohd.Shaib, 1992 Roy và cs (2007) ựã thành công trong nghiên cứu nhân giống Dendrobium
qua con ựường nuôi cấy tạo mô sẹo và tái sinh PLB Dendrobium chrysotoxum
Lindl. Trên môi trường MS, tần suất tạo mô sẹo cao với TDZ hay BA; mô sẹo tạo PLB và chưa thấy xuất hiện biến tắnh tế bào soma sau 18 tháng nuôi cấy trên môi trường không bổ sung chất kắch thắch sinh trưởng; tuy nhiên sự hình thành PLB phụ thuộc nhiều vào tỷ lệ cytikinin và auxin và kỹ thuật nuôi cấy, BA kắch thắch sinh trưởng mô sẹo và tăng sinh PLB; TDZ gây hoại tử mô sẹo, NAA không tác ựộng mạnh lên quá trình tạo mô sẹo nhưng ảnh hưởng ựến quá trình
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 24 cấy truyền mô sẹo; hệ số tăng sinh mô sẹo khi bổ sung 0,5mg/l NAA là 69 lần sau 3 tháng nuôi cấy; tái sinh sẹo ựạt hiệu quả cao nhất 133 PLB/100mg mô sẹo với môi trường bổ sung 1ộM NAA, sự tái sinh và hình thành PLB PLB phụ thuộc vào loại và nồng ựộ cytokinin sử dụng.
PLB Dendrobium ựược sử dụng làm nguyên liệu nuôi cấy chuyển gen trong công tác tạo giống mới (Kuehnle và Sugii, 1992; Chia và cs, 1994; Tee và cs, 2003; Janna và cs, 2006).
Nhân giống Dendrobium qua nuôi cấy ựốt thân: Arditti và cs (1973), Mosich và cs (1973, 1974) nuôi cấy ựốt thân trên môi trường Knop, chồi xuất hiện sau 45 ngày nuôi cấy, chồi ựược tách rời và nuôi cấy ra rễ.
Nhân giống Dendrobium moschatum qua nuôi cấy lát mỏng thân: Kanjilal và cs (1999) nuôi cấy lát mỏng thân (dày 1-1,5mm) của chồi từ hạt in vitro trên môi trường lỏng KnudsonC (lắc 80-120rpm) có bổ sung 15% ND, 2mg/l NAA và 3mg/l BA tạo PLB. Nuôi cấy tăng sinh và tái sinh PLB trên cùng môi trường bán rắn.
Nhân giống qua nuôi cấy chồi sinh ra từ mô sẹo:Khaw và cs (1978a, 1978b) nuôi cấy chồi Dendrobium. Khaw và Ong (1974) nuôi cấy chồi Aranda và
Dendrobium Alice trên môi trường VW. Kukulczanka và Wojciechowska (1983) nuôi cấy chồi Dendrobium antennatum và Dendrobium phalaenopsis.
Nghiên cứu sự tạo mô sẹo trên Dendrobium cho thấy: mô sẹo sinh trưởng chậm, dễ bị hoại tử trong quá trình nuôi cấy ựược ghi nhận (Chang và Chang 1998; Lin và cs, 2000; Roy và Banerjee, 2001). Hơn nữa môi trường nuôi cấy tạo mô sẹo có bổ sung Auxin, cytokinin, ND cho kết quả khả quan (Yam và cs, 1991, Arditti và Ernst 1993) và duy trì mô sẹo (Ishii và cs, 1998; Chen và Chang 2000; Huan và cs, 2004). Tuy nhiên nuôi cấy kéo dài trong môi trường có chất kắch thắch sinh trưởng dẫn ựến biến tắnh tế bào soma (Vazquez, 2001) và cần ựiều khiển Auxin và xytokinin thắch hợp trong tái sinh mô sẹo hình thành chồi
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 25 và PLB (Roy và cs, 2007).
Nhân giống qua nuôi cấy chồi ựỉnh: Nhân giống Dendrobium ựầu tiên ựược thực hiện tại đại học Hawaii (Sagawa và Shoji, 1967; Kim và cs, 1970) qua nuôi cấy chồi ựỉnh. Lim-Ho (1981) và Gandawijaja (1980) nuôi cấy chồi ựỉnh
Dendrobium phalaenopsis. Nhân giống Dendrobium sonia: Prasad và cs (2001) ựã nuôi cấy chồi ựỉnh trên môi trường MS có bổ sung 1mg/l NAA và 1mg/l BA hình thành cụm chồi sau 25 ngày nuôi cấy, với 11 chồi/mẫụ
Fernando (1979) nuôi cấy ựỉnh sinh trưởng Dendrobium caesar Lip. Singh (1976) nuôi cấy chồi ựỉnh Dendrobium. Ng Eng Cheọ Soediono (1983b) nuôi cấy chồi ựỉnh Dendrobium jaquelyn Thomas ỔWhiteỖ. Nhân giống Dendrobium
Joannie Ostenhault qua nuôi cấy ựỉnh sinh trưởng: Sharon, Vasundhara (1990) nuôi cấy ựỉnh sinh trưởng tách rời trên môi trường lỏng VW có bổ sung 15% ND, ựặt trong tối 48h, sau ựó ựưa ra sáng, tạo PLB. PLB ựược cấy chuyển, nhân sinh khối và tái sinh thành chồi trên môi trường bán rắn VW có bổ sung 15% ND.
Nhân giống Dendrobium crumenatum qua nuôi cấy mô lá: Phương pháp này ựược ựược trường đH Quốc Gia Singapore phát triển (Manorama và cs, 1986). Gieo hạt Dendrobium crumenatum in itro, chồi tái sinh từ hạt tách lấy lá non. Lá non ựược cắt thành mảnh mỏng và nuôi cấy trong môi trường lỏng VW (lắc 80rpm) có bổ sung 2,4D (5mg/l), NAA (5mg/l), BA (2mg/l). Mô sẹo hình thành sau 40 ngày nuôi cấy và tạo PLB sau 3 tháng nuôi cấỵ Chung và cs (2007) thành công trong nuôi cấy phát sinh phôi vô tắnh trực tiếp từ lá giống hoa lan
Dendrobium Chiengmai Pink ựã nghiên cứu ảnh hưởng của 4 loại auxin (2,4D; NAA; IBA; IAA) và 5 loại cytokinin (Ki, BA, 2ip, TDZ, zeatin) trên môi trường 1/2MS ựến sự tạo mô sẹo trực tiếp ghi nhận auxin không ảnh hưởng ựến sự hình thành phôi vô tắnh trong tối và ngoài sáng sau 60 ngày nuôi cấy; phôi phát sinh tốt với 1mg/l TDZ với 5-25% mẫu nuôi cấy tạo phôi và ựạt 33,6 phôi/mẫu; phôi thứ cấp phát sinh trên vết cắt bản lá và có tần suất tạo phôi cao ựể trong tối;
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 26 NAA (0-0,1-1mg/l) kết hợp TDZ (0-0,3-3mg/l) nâng cao hiệu suất thành phôi; chồi tái sinh từ phôi dễ dàng trên môi trường 1/2MS không chất kắch thắch sinh trưởng và có tỷ lệ sống cao khi thuần hóạ Anjum S, (2006) nghiên cứu trên lan
Dendobium malones ựã tái sinh protocorm từ mẫu lá trên môi trường MS + 1,0mg/l Kinetin + 0,5mg/l NAA và protocorm sau khi ựược hình thành ựược cấy chuyển lên môi trường MS cơ bản bổ sung 2,0mg/l BAP ựể phát sinh hình thái và thu ựược số lượng protocorm nhiều nhất.
Khi gieo hạt một số loài Dendobium sp. Luan và cs (2006) ựã bổ sung 0,5mg/l NAA kắch thắch sự nảy mầm và phát sinh protocorm khi gieo hạt lan trên nền môi trường MS.
* Tình hình nuôi cấy mô lan Hoàng Thảo ở Việt Nam.
Theo tác giả Trần Văn Minh, Nguyễn Văn Uyển (2001) kết luận MS là môi trường nuôi cấy cơ bản thắch hợp cho nhân giống lan Dendrobium in vitro, 1mg/l BA+ 0,1mg/l IBA là tổ hợp chất ựiều tiết sinh trưởng thắch hợp cho nhân protocorm chi lan nàỵ Hàm lượng nước dừa (ND) 15% là chất hữu cơ bổ sung hữu hiệu nâng cao hiệu quả phát sinh chồi trong quá trình nhân giống hoa lan
Dendrobium. Môi trường MS + 0,1mg/l BA + 20%ND là môi trường tổ hợp các chất ựiều tiết sinh trưởng và chất hữu cơ bổ sung ựạt hiệu quả cao trong tái sinh chồi và chiều cao của chồi lan Dendrobium in vitrọ
Theo Trịnh Cẩm Tú, Bùi Trang Việt (2006) sự ra hoa của Dendrobium sp.
liên quan ựến sự chuyển tiếp mô phân sinh tạo lá và thân sang mô phân sinh tạo hoạ Mô phân sinh hoa tự là vị trắ phát sinh cơ quan liên tục với một vùng nhỏ các tế bào gốc ựa năng. đời sống và hoạt ựộng của mô phân sinh hoa tự liên quan ựến số nụ hoa trên hoa tự ựược quan sát bằng cách sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinh hoa tự trên môi trường MA có bổ sung zeatin 1mg/l, AIA 0,5mg/l và GA3 1mg/l. Với BA 5mg/l, mô phân sinh hoa tự của phát hoa tạo cụm chồi dinh dưỡng thay vì tiếp tục tạo phát hoạ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 27 Theo Vũ Ngọc Phượng, Thái Xuân Du (2007) có thể sử dụng ánh sáng tự nhiên như một giải pháp tiết kiệm ựiện máy lạnh và ựèn chiếu sáng ựể nuôi cấy phong lan Dendrobium. Dendrobium có tốc ựộ lớn nhanh và khi sử dụng tinh bột thay cho ựường tỷ lệ nhiễm giảm. Lượng agar dùng làm ựông môi trường giảm ựị Trong ựiều kiện ánh sáng tự nhiên chiếu mạnh cây có sắc tố tắm ựỏ. Kết quả nghiên cứu cho thấy ở môi trường ánh sáng tự nhiên việc sử dụng carbohydrat ở dạng tinh bột tốt hơn so với dùng ựường. Kể từ ngày 30 trở ựi bắt ựầu ghi nhận ựược sự khác biệt với cây sống trên môi trường chứa ựường. Trong vòng 60 ngày, thời gian nuôi cấy càng kéo dài về sau thì sự vượt trội càng rõ rệt.
Bùi Thị Tường Thu, Trần Văn Minh (2007) sử dụng môi trường VW bổ sung BA, NAA, kinetin, TDZ, ND, ựường sucrose nuôi cấy phát sinh và tăng sinh tế bào soma, phát sinh và tái sinh phôi giả (PLB) của cây hoa lan Dendrobium.
Nguyễn Thị Mỹ Duyên, (2006) ựã ựưa ra quy trình vi nhân giống lan
Dendrobium anosmum. Quả lan sau khi ựược tự thụ 4 tháng, khử trùng và gieo cấy hạt vào môi trường sau 3 tháng gieo cấy tỷ lệ nảy mầm ≥ 85% trên môi trường MS + 1 mg/l NAA và môi trường MS + 1mg/l BA + 0,2 mg/l NAẠ Chồi lan
Dendrobium anosmum phát triển tốt nhất trên môi trường MS + 2 mg/l BA, ở thời gian 3 tháng sau khi cấy ựạt HSN chồi 3,17 lần, chồi cao 20,6 mm. Chồi lan tạo rễ tốt nhất trên môi trường MS + 1mg/l NAẠ Sau 3,5 tháng tạo đwwocj cây hoan chỉnh, ựạt tiêu chuẩn ựưa ra vườn ươm.
Quy trình vi nhân giống lan Dendrobium mini thì chồi lan phát triển tốt trên môi trường MS có bổ sung 1 mg/l BẠ Và sau 2 tháng nhân chồi ựạt HSN là 3,8 chồi, chồi cao 1,26 cm. Môi trường 1/2 MS + 0,2 mg/l NAA cho kết quả ra rễ tốt và sau 2 tháng chồi lan tạo rễ hình thành cây hoàn chỉnh ựể ựưa ra vườn ươm. Khi thắch ứng cây ra vườn ươm trên nhiều loại giá thể khác nhau thì thấy rằng ựối với lan D.mini trong giai ựoạn ựàu nuôi trồng (từ cây mới ra mô ựến khi cây đwwocj 7,5 tháng tuổi) thì giá thể thắch hợp nhất cho cây là dớn và dà miếng.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 28 Nguyễn Văn Song và cs (2011) ựề xuất khi nhân giống in vi tro lan
Dendrobium chrysotoxum thì nguyên liệu là quả lan 3 tháng tuổị Môi trường thắch hợp cho nảy mầm và phát sinh protocorm là môi trường MS + 20g/l sucrose + 8 g agar + 15% ND + 2,0 mg/l BAP. Môi trường nhân nhanh protocorm tốt nhất là MS + 20g/l sucrose + 8 g agar + 15% ND + 2,0 mg/l BAP. Môi trường MS + 30g/l sucrose + 8 g agar + 1g/l THT + 15%ND + 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAẠ thắch hợp nhất cho tái sinh chồi từ protocorm và sinh trưởng của chồi in vitrọ Môi trường MS + 20g/l sucrose + 8 g agar + 15% ND + 1,0 mg/l NAA là thắch hợp cho tạo rễ của chồi in vitrọ
Vũ Ngọc Lan và cs, 2011 ựã ựưa ra quy trình nhân giống in vitro giống lan Hoàng Thảo Thạch Hộc (D.nobile Lindl.) môi trường nhân cụm protocorm là KnudsonC + 100ml ND + 10g saccharoza + 60g khoai tây/lắt môi trường, trong 2 tháng cho hệ số nhân ựạt 4,2 lần. Nhân nhanh cụm chồi trên môi trường MS (1962) + 100ml ND + 30g sacroza + 60g chuối chắn, sau 2 tháng nuôi cấy cho hệ số nhân 3,15 lần và tạo cây hoàn chỉnh trên môi trường RE + 10g sacroza + 0,5g THT.
Nguyễn Thị Sơn và cs, 2012 ựã ựưa ra quy trình nhân giống in vitro giống lan Long nhãn (D.frimbriayum Hook.) môi trường nhân cụm protocorm là KC + 100ml ND + 10g Sacaroza + 60g khoai tây/ Lắt môi trường ựạt hệ số nhân 4,63 lần. Môi trường tối ưu cho nhân cụm chồi là MS + 100ml ND + 20g sacaroza + 90g chuối chắn/ lắt môi trường ựạt hệ số nhân 3,44 lần
Tuy nhiên trong các công trình nghiên cứu trên mới chỉ tiến hành ựược nghiên cứu tìm ra môi trường nuôi dưỡng và bước ựầu thắch ứng cây ngoài vườn ươm mà chưa ựi sâu vào việc tiến hành cải tiến phương pháp, áp dụng các thiết bị tiên tiến trong nhân giống và nuôi trồng các loài lan trên nhằm mục tạo ựược nguồn mẫu giống lớn và có chất lượng phục vụ ựời sống con người cũng như bảo tồn các loài lan này trước sự sụt giảm về số lượng và nguy cơ của tuyệt
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 29 chủng. Trong những năm gần ựây việc ứng dụng các thiết bị và hệ thống chăm sóc cây trồng ựã ựược ứng dụng nhiều trong các phòng nuôi cấy mô và các nhà vườn hiện naỵ Tại viện Sinh học nông nghiệp Ờ đại học Nông nghiệp ựã tiến hành ứng dụng hệ thống khắ canh trong công tác nhân giống các loại cây trồng như cà chua, khoai tây ựã ựạt ựược nhứng kết quả rất khả quan.
Qua tiến hành thực tế, cây lan Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng ựã có những kết quả về nhân nhanh nhưng việc nuôi trồng chúng ở vườn ươm tại khu vực Hà Nội còn gặp nhiều khó khăn. Vì vậy chúng tôi tiến hành thực hiện ựề tài : Nghiên cứu cải tiến quy trình nhân giống in vitro một số giống lan thuốc thuộc chi Hoàng Thảo (Dendrobium).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 30