Phương pháp nghiên cứu - NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP N- 123docz.net

3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2.2. Phương pháp nghiên cứu

* Phương pháp nghiên cứu nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của các ựiều kiện nuôi cấy ựến khả năng nhân nhanh protocorm và chồi in vitro 02 loài lan Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng.

Thắ nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của các hệ thống nuôi cấy ựến khả năng nhân nhanh protocorm và cụm chồi 02 loài lan Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng.

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 32 + CT1: Trao ựổi khắ có giới hạn: Môi trường nhân protocorm và cụm chồi ựược tiến hành ựổ vào các bình nuôi cấy ựậy lại bằng nút bông và chùm nắp giấy lên trên sau ựó ựem hấp vô trùng (1210C trong 20 phút) rồi ựể nguội và tiến hành cấy mẫu (đC)

+ CT2: Không trao ựổi không khắ: Nút làm bằng nilon, bao trùm lên miệng bình nuôi nhằm ngăn cản sự trao ựổi khắ bên trong bình với phòng nuôị

+ CT3: Trao ựổi không khắ hoàn toàn (Thoáng khắ): nút làm bằng nilon có chứa màng vi lọc khắ ựược thiết kế có thể bao trùm ựược miệng bình nuôi cấỵ Loại nút này ựược hấp vô trùng (1210C trong 20 phút). Sau khi hấp xong ựưa vào trong buồng cấy ựể nguội và tiến hành chùm lên miệng bình ựã ựược cấy mẫụ

+ CT4: Nuôi cấy lỏng tĩnh, nút thoáng khắ: Môi trường nhân protocorm và cụm chồi không có aga ựược hấp vô trùng ựể nguội và tiến hành nuôi cấỵ Sau ựó xếp lên các giàn nuôị

+ CT5: Nuôi cấy lỏng lắc, nút thoáng khắ: Môi trường ựược chuẩn bị như CT4. Sau ựó xếp lên các máy lắc có tốc ựộ lắc 120 vòng/phút

+ CT6: Nuôi cấy bằng bioreactor Plantima (BP): Môi trường nhân protocorm và cụm chồi không có aga ựược rót vào các bình to và ựậy nút sau ựó hấp vô trùng và ựược chiết vào các bình nuôi cấy của hệ thống này ựược vô trùng hoàn toàn ựặt trong buồng cấy mẫu và tiến hành cấy mẫu sau ựó lắp các bình này vào hệ thống BP.

Các công thức thắ nghiệm trên ựược tiến hành với 3 lần lăp lại, mỗi lần 10 bình, mỗi bình 5 cụm, mỗi cụm 5 protocrom hoặc 5 chồị Sau ựó ựếm hệ số nhân protocorm và cụm chồi thu ựược sau 2 tháng nuôi trong ựiều kiện nhiệt ựộ phòng 20 Ờ 250C; Cường ựộ ánh sáng 800-1500lux với thời gian chiếu sáng là 16h/ ngàỵ

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 33

Thắ nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của pH ựến khả năng nhân protocorm và cụm chồi cây Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng trên hệ thống Bioreactor PlantimăBP)

+ CT1: pH = 5,3 + CT2: pH = 5,5 + CT3: pH = 5,7 + CT4: pH = 5,9 + CT5: pH = 6,1

Các công thức thắ nghiệm trên ựược tiến hành với 3 lần lặp lại, mỗi lần 3 bình, mỗi bình 10 cụm, mỗi cụm 5 protocorm hoặc 5 chồị Sau ựó theo dõi hệ số nhân protocorm và cụm chồi sau 2 tháng nuôi cấy với các thông số của hệ thống BP: bơm 5 phút, ngừng bơm 30 phút, môi trường dinh dưỡng thắch hợp cho nhân protocorm và cụm chồi cây Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng.

Thắ nghiệm 3:Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nghỉ phun dung dịch dinh dưỡng ựến khả năng nhân protocorm và cụm chồi cây Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng trên hệ thống bioreactor PlantimăBP)

+ CT1: 10 phút + CT2: 20 phút + CT3: 30 phút + CT4: 40 phút

Các công thức thắ nghiệm trên ựược tiến hành với 3 lần lặp lại, mỗi lần 3 bình, mỗi bình 10 cụm, mỗi cụm 5 protocorm hoặc 5 chồị Sau ựó theo dõi hệ số nhân protocorm và cụm chồi sau 2 tháng nuôi cấy với các thông số của hệ thống BP: bơm 5 phút, môi trường dinh dưỡng thắch hợp cho nhân protocorm và cụm chồi cây Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng.

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 34

* Phương pháp nghiên cứu nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chế ựộ chiếu sáng ựến khả năng sinh trưởng của cây in vitro trên hệ thống bình nuôi cấy thoáng khắ.

Thắ nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại ánh sáng ựến sinh trưởng cây Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng

+ CT1: đèn LED ựơn sắc phổ ánh sáng B/R = 55/45 + CT2: đèn HQ T8 Ờ 36W B/R + CT3: đèn HQ T8 Ờ 36W, deluxe + CT4: đèn HQ T10 Ờ 40W, balast sắt từ (đC) CT1 CT2 CT3 CT4

Hình 3.1: đồ thị quang phổ ánh sáng của các hệ thống chiếu sáng nghiên cứu

Các công thức thắ nghiệm trên ựược tiến hành với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại sử dụng 15 bình, mỗi bình 5 câỵ Sau ựó theo dõi chiều cao cây, số lá/ cây, ựo chỉ số SPAD, diện tắch lá, hàm lượng chất khô sau 2 tháng nuôi cấy với quang chu kỳ 16 giờ chiếu sáng + 8 giờ ngắt sáng, nhiệt ựộ phòng 20 Ờ 250C.

Thắ nghiệm 5: Ảnh hưởng của cường ựộ ánh sáng ựến sinh trưởng của câỵ + CT1: 800lux Giàn 1 bóng

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 35 + CT3: 2300lux Giàn 3 bóng

+ CT4: 2900lux Giàn 4 bóng

Các công thức thắ nghiệm trên ựược tiến hành với 3 lần lăp lại, mỗi lần lặp lại sử dụng 15 bình mỗi bình 5 câỵ Sau ựó theo dõi các chỉ tiêu về chiều cao, số lá, chỉ số SPAD, tỷ lệ ra rễ mới thu ựược sau 2 tháng nuôi trong ựiều kiện nhiệt ựộ phòng 20 Ờ 250C; Thời gian chiếu sáng là 16h/ ngàỵ

Hình 3.2: Sơ ựồ bố trắ thắ nghiệm ảnh hưởng của cường ựộ ánh sáng ựến sinh trưởng của 02 loài lan Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng

Thắ nghiệm 6: Ảnh hưởng của quang chu kỳ chiếu sáng ựến sinh trưởng của câỵ

+ CT1: (16 giờ chiếu sáng + 8 giờ tắt sáng)/ ngày (đC) + CT2: (12 giờ chiếu sáng + 12 giờ tắt sáng)/ ngày + CT3: ( 8 giờ chiếu sáng + 16 giờ tắt sáng)/ ngày

Các công thức thắ nghiệm trên ựược tiến hành với 3 lần lăp lại, mỗi lần lặp lại sử dụng 15 bình. Sau ựó theo dõi các chỉ tiêu về chiều cao, số lá, chỉ số SPAD, tỷ lệ ra rễ mới thu ựược sau 2 tháng nuôi trong ựiều kiện nhiệt ựộ phòng 20 Ờ 250C; Cường ựộ ánh sáng tốt nhất của thắ nghiệm 5.

4 0 0 m m 1 6 0 0 m m 700mm 1500mm m

Bóng ựèn Huỳnh quang T8 Ờ Deluxe, ánh sáng trắng, với công suất bức xạ B = 3,3W, R = 2,0W, P = 33W

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 36

* Phương pháp nghiên cứu nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của các kỹ thuật trồng cây và chăm sóc ựến khả năng sinh trưởng của cây Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng in vitro ở vườn ươm.

Cây lan Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng ựạt chiều cao 5cm, 5 lá trở lên, có 4 Ờ 5 rễ dài khoảng 3 Ờ 4 cm ựược tiến hành ựưa xuống vườn ươm ựặt thắch ứng sau 1 tuần thì ựưa ra khỏi bình nuôi ựể trồng vào các hệ thống nuôi trồng khác nhau

Thắ nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của các phương thức nuôi trồng khác nhau ựến khả năng sinh trưởng của cây ở vườn ươm

+ CT1: Hệ thống khắ canh: Cây con ựược trồng vào các khay xốp ựã ựục lỗ sẵn sao cho cây có thể thả bộ rễ xuống phắa dưới bề mặt xốp. Trong khay xốp của hệ thống khắ canh có các ựầu phun dung dịch nuôi dưỡng ựể cây có thể hấp thụ. Ban ngày phun dung dịch 2 lần

+ CT2: Hệ thống thủy canh: Cây con ựược trồng vào các khay xốp ựã ựục lỗ sẵn sao cho cây có thể thả bộ rễ xuống phắa dưới bề mặt xốp. Trong khay xốp của hệ thống thủy canh có chứa dung dịch nuôi câỵ

+ CT3: Giá thể vỏ dừa: Giá thể ựược cắt thành những miếng nhỏ theo kắch thước 4,0 x 2,0 x 0,5 cm. Cây con ựược quấn giá thể xơ dừa xung quanh gốc và ựặt vào các lỗ trên khay nhựa sao cho cây ựứng thẳng. Ngày tưới 2 lần bằng cách phun sương trên bề mặt trồng.

+ CT4: Giá thể xốp: Giá thể là các mảnh xốp nhỏ có kắch thước 2,0 x 1,0 x 0,7 cm ựược ựặt trong các khay nhựa và trồng cây con vào ựó sao cho phần gốc rễ cây con ựược bao bọc bởi xốp và cây con ựứng thẳng. Ngày tưới 2 lần bằng cách phun sương trên bề mặt giá thể trồng.

+ CT5: Giá thể bột xơ dừa: Giá thể ựược phủ lên trên mặt giàn nuôi, dày 3cm. Cây con ựược cấy nằm ngang trên bề mặt giàn với mật ựộ 200 cây/1m2. Ngày tưới 2 lần bằng cách phun sương trên bề mặt trồng.

Các công thức ựược tiến hành với 3 lần lặp lại, mỗi lần trên 30 cây/ mỗi giống. Cây có chiều cao 5cm, có 5 lá và có 5 rễ. Sau ựó được trồng vào các hệ

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 37 thống nuôi trên các công thức. Theo dõi các chỉ tiêu về chiều cao, số lá và ựánh giá số cây ra rễ mới và số cây sống sau 1 tháng trên các hệ thống nghiên cứụ

Thắ nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của các thời vụ trồng ựến khả năng sinh trưởng của cây ở vườn ươm.

+ Vụ xuân: 01/03/2012 Ờ 01/04/2012 + Vụ xuân Ờ hè: 01/04/2012 Ờ 01/05/2012 + Vụ hè: 01/05/2012 Ờ 01/06/2012

Trên mỗi công thức tiến hành nghiên cứu với 3 lần lặp lạị Mỗi lần 30 cây/ mỗi giống. Cây có chiều cao 5cm, có 5 lá và 5 rễ. Cây ựược trồng trên hệ thống khắ canh với các thời ựiểm khác nhau, sau 2 tháng tiến hành thu kết quả về chiều cao, số lá, tỷ lệ cây sống, chết, ra rễ mớị

Thắ Nghiệm 9: Ảnh hưởng của các dung dịch dinh dưỡng khác nhau ựến sinh trưởng và phát triển cây lan

Hình 3.3: Sơ ựồ hệ thống khắ canh- Viện Sinh học Nông nghiệp Ờ đHNN HN

Cây sau 1 tháng thắch ứng trên các hệ thống khắ canh ựược tiến hành ựưa vào các thắ nghiệm ựánh giá về dinh dưỡng. Cây có chiều cao 5 cm, có 5 lá và 5 rễ.

Vòi phun dung dịch ở dạng sương mù Ống hồi dinh dưỡng Bể dung dịch dinh dưỡng Ống dẫn dinh dưỡng Máy bơm

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 38 + Dung dịch dinh dưỡng I: môi trường dung dịch Knoop (đC)

+ Dung dịch dinh dưỡng II: là sự cải tiến các thành phần khoáng trong môi trường dung dịch Knoop

+ Dung dịch dinh dưỡng III: là sự cải tiến các thành phần khoáng trong môi trường dung dịch Knoop

Mỗi công thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 30 câỵ Cây ựược nuôi dưỡng trên các nền dung dịch trên với pHđ = 6,0 Ờ 6,5 ; EC từ 400 Ờ 500 ộs/cm. Sau 2 tháng nuôi trồng sẽ ựánh giá về chiều cao, số lá, số rễ và số chồi câỵ

Thắ nghiệm 10: Nghiên cứu ảnh hưởng của pH dung dịch ựến sự sinh trưởng của cây trên hệ thống khắ canh.

+ pH = 5,5 + pH = 6,0 + pH = 6,5 + pH = 7,0

Mỗi công thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 30 câỵ Cây trồng trên hệ thống khắ canh có sử dụng nền dung dịch dinh dưỡng III , với EC từ 400 Ờ 500 ộs/cm. Sau 2 tháng nuôi trồng sẽ ựánh giá về chiều cao, số lá, số rễ và số chồi câỵ

Thắ nghiệm 11: Nghiên cứu ảnh hưởng của ựộ dẫn ựiện (Electrical Conductivity : EC) trong dung dịch trên hệ thống khắ canh lên sinh trưởng cây lan.

+ EC = 300 ộs/cm + EC = 400 ộs/cm + EC = 500 ộs/cm + EC = 600 ộs/cm

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 39 + EC = 700 ộs/cm

Mỗi công thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 30 câỵ Cây trồng trên hệ thống khắ canh có sử dụng nền dung dịch III, với pH = 6,0 Ờ 6,5. Sau 2 tháng nuôi trồng sẽ ựánh giá về chiều cao, số lá, số rễ và số chồi câỵ

Thắ nghiệm 12: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nghỉ phun ựến sinh trưởng của câỵ

+ Thời gian nghỉ phun: 6 giờ + Thời gian nghỉ phun: 5 giờ + Thời gian nghỉ phun: 4 giờ + Thời gian nghỉ phun: 3 giờ

Mỗi công thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 30 cây . Cây trồng trên hệ thống khắ canh có sử dụng nền dung dịch III, với pH = 6,0 Ờ 6,5 và ựộ EC = 500 - 550 ộs/cm. sau 2 tháng ựánh giá chiều cao cây, số lá, số rễ và chiều dài rễ.

Thắ nghiệm 13: . Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại thuốc bảo vệ thực vật và các chế phẩm vi sinh ựến khả năng phòng bệnh của cây

Cây sau khi trồng trên hệ thống khắ canh, ựối với cây lan Hoàng Thảo Thạch Hộc ựạt chỉ tiêu cao 8,2cm; 5 lá; 10 rễ; rễ dài 8 - 9 cm trở lên thì có thể tiến hành cấy chuyển vào giá thể. Cây Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng ựạt chỉ tiêu cao 5,7 cm; 5 lá; có 4 Ờ 5 rễ, chiều dài rễ từ 7 Ờ 8cm trở lên thì có thể tiến hành cấy chuyển vào giá thể. Giá thể cấy chuyển cây là vỏ dừạ Cây sau trồng trên giá thể ựược chăm bón bằng phân bón Grow more 20 Ờ 20 Ờ 20 (N- P Ờ K) cứ 10 ngày bón 1 lần.

+ đC: Tưới nước

+ Ridomil: Tưới phun hàng tuần với hàm lượng theo khuyến cáo + Aliette: Tưới phun hàng tuần với hàm lượng theo khuyến cáo

+CPVSV BIMA: Tưới phun hàng tuần với hàm lượng theo khuyến cáo Mỗi công thức tiến hành với 3 lần lặp lạị Mỗi lần 90 câỵ Sau 2 tháng kiểm

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 40 tra các bệnh mà cây thường mắc phải: Bệnh thối nâu; Bệnh thối mềm; Bệnh ựen thân cây con; Bệnh vàng ựốm lá; Bệnh ựốm màu ở lá, Bệnh thán thư, Bệnh thối hạch; Bệnh thối ựen ngọn