NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH NHÂN NUÔI NẤM Trichoderma virens, SẤY KHÔ VÀ XAY NGHIỀN TẠO CHẾ PHẨM NLU – Tri

Bên cạnh đó, biện pháp phòng trừ sâu bệnh hại bằng thuốc hoá học ồ ạt như hiện nay có trên 400 hoạt chất nông dược sử dụng ở Việt Nam, cục BVTV, 2008, nông dân thường pha thuốc với nồng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH

NHÂN NUÔI NẤM Trichoderma virens, SẤY KHÔ VÀ XAY

NGHIỀN TẠO CHẾ PHẨM NLU – Tri

Họ và tên sinh viên: NGUYỄN THÀNH LỢI Ngành: NÔNG HỌC

Niên khóa: 2006 – 2010

12/2010

NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH NHÂN NUÔI NẤM Trichoderma virens,

SẤY KHÔVÀ XAY NGHIỀN TẠO CHẾ PHẨM NLU – Tri

Tác giả

NGUYỄN THÀNH LỢI

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu

cấp bằng kỹ sư ngành Nông học

Giáo viên hướng dẫn:

TS LÊ ĐÌNH ĐÔN

12/2010

LỜI CẢM TẠ

Để hoàn thành khóa luận này không chỉ là thành quả của tôi mà còn là công sức và tấm lòng của tất cả thầy cô, gia đình và bạn bè

Tôi xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Lê Đình Đôn, người đã luôn theo sát

và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này

Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành nhất đến anh Đinh Văn Cương đã luôn hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện khóa luận Chân thành cảm

ơn đến bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất để tôi hoàn thành tốt khóa luận

Tôi xin tỏ lòng biết ơn đến Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, các thầy cô trong khoa Nông Học, những người luôn tận tụy truyền đạt kiến thức cho các thế hệ sinh viên

Con muốn giành sự biết ơn sâu sắc tới cha mẹ và gia đình cùng những người thân đã nuôi dạy, cổ vũ, động viên và giúp đỡ con trong suốt quá trình học tập để hoàn thành chương trình học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp

phẩm phòng trừ sinh học NLU – Tri phục vụ cho nhu cầu phòng trừ sinh học của

người dân, cải tiến môi trường nhân nuôi, làm khô nấm sau khi nhân nuôi, nghiền để thu nhận bào tử nấm

Đề tài gồm ba thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM

 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu cải tiến môi trường thứ cấp nhân nuôi cấy

nấm Trichoderma virens

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố, gồm 6 nghiệm thức, 5 lần lặp lại gồm các công thức phối trộn môi trường trong phòng thí nghiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

Kết quả thí nghiệm: Dựa vào các chỉ tiêu mật số bào tử sống, độ ẩm của sản phẩm, mật số bào tử sống sau khi sấy ở 30 0

C và 35 0C, hiệu quả kinh tế, chọn ra được môi trường nuôi cấy nấm thích hợp là môi trường cám : trấu : tấm với tỷ lệ 1:2:1 và 50

% nước, nấm được sấy ở nhiệt độ 30 0

C

 Thí nghiệm 2: Cải tiến quy trình làm khô nấm sau khi nuôi cấy

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố, gồm 4 nghiệm thức và 4 lần lặp lại là các biện pháp làm khô nấm sau khi nhân nuôi trên môi trường cám : trấu : tấm với tỷ lệ 1:2:1 và 50 % nước được 12 ngày, tất cả các nghiệm thức được sấy ở 30 0

nấm nhân nuôi trên môi trường cám : trấu : tấm với tỉ lệ 1:2:1 và 50 % nước được 12 ngày rồi đổ ra khay hong trong phòng 2 – 3 ngày trước khi sấy sẽ tiết kiệm được thời

gian sấy, số bào tử/gam chế phẩm Trichoderma virens cũng đạt tối đa

 Thí nghiệm 3: Cải tiến quy trình xay nghiền chế phẩm Trichoderma

 Tóm lại, sau khi hoàn thành cả 3 thí nghiệm thì chọn ra được môi trường nhân nuôi nấm phù hợp đạt hiệu quả kinh tế cao nhất là môi trường trấu : tấm : cám với tỷ lệ 1:2:1 và 50 % nước, phương pháp làm khô nấm thích hợp là hong nấm trong phòng kín 2 ngày, sau đó sấy nấm ở 30 0C, nghiền với cỡ sàng là 0,3 mm

MỤC LỤC

Trang tựa i

Lời cảm tạ ii

Tóm tắt iii

Mục lục v

Danh sách các chữ viết tắt viii

Danh sách các hình ix

Danh sách các bảng x

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu 2

1.2.1 Mục tiêu 2

1.2.2 Yêu cầu 3

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Nguồn gốc của Trichoderma 4

2.2 Đặc điểm của nấm Trichoderma 4

2.2.1 Hình thái, sự sinh trưởng và sự hình thành bào tử của Trichoderma 4

2.2.1.1 Đặc điểm hình thái 4

2.2.1.2 Sự sinh trưởng của Trichoderma 5

2.2.1.3 Sự hình thành bào tử trên môi trường 5

2.2.2 Điều kiện sống trong tự nhiên của nấm Trichoderma 6

2.2.2 Tiềm năng sử dụng Trichoderma trong phòng trừ sinh học 7

2.3 Vai trò của quần thể nấm Trichoderma trong đất 7

2.3.1 Khả năng đối kháng của Trichoderma 8

2.3.2 Cơ chế đối kháng của nấm Trichoderma 10

2.3.3 Vai trò của Trichoderma trong xử lý hạt giống 11

2.3.4 Các sản phẩm trao đổi của nấm Trichoderma 12

2.4 Các phương pháp lên men tạo chế phẩm sinh học 13

2.4.1 Phương pháp lên men chìm 13

2.4.2 Phương pháp lên men bề mặt không vô trùng tạo chế phẩm nấm 14

2.4.3 Phương pháp lên men hai giai đoạn tạo chế phẩm nấm 14

2.4.4 Phương pháp lên men xốp tạo chế phẩm nấm 15

2.5 Phương pháp lên men xốp tạo chế phẩm nấm Trichoderma 15

2.6 Những nghiên cứu trong nước và ngoài nước về nấm Trichoderma 17

2.6.1 Nghiên cứu ngoài nước 17

2.6.2 Nghiên cứu trong nước 19

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 23

3.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu cải tiến môi trường thứ cấp nhân nuôi cấy nấm Trichoderma virens 23

3.1.1 Mục đích 23

3.1.2 Vật liệu thí nghiệm 23

3.1.3 Phưong pháp thí nghiệm 23

3.2 Thí nghiệm 2: Hoàn thiện quy trình làm khô nấm sau khi nuôi cấy 26

3.2.1 Vật liệu thí nghiệm 26

3.2.2 Phưong pháp thí nghiệm 26

3.3 Thí nghiệm 3: Hoàn thiện quy trình xay nghiền chế phẩm Trichoderma virens 27

3.3.1 Vật liệu thí nghiệm 27

3.3.2 Phương pháp thí nghiệm 27

3.4 Xử lý số liệu 28

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu cải tiến môi trường thứ cấp nhân nuôi cấy nấm Trichoderma virens 29

4.1.1 Mật số bào tử sống 29

4.1.2 Ẩm độ và mật số bào tử sống của các nghiệm thức sau sấy theo thời gian 30

4.1.3 Hiệu quả kinh tế 33

4.2 Thí nghiệm 2: Hoàn thiện quy trình làm khô nấm sau khi nuôi cấy 34 4.3 Thí nghiệm 3: Hoàn thiện quy trình xay nghiền chế phẩm

Trichoderma virens 35

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38

5.1 Kết luận 38

5.2 Đề nghị 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

PHỤ LỤC 42

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

NSC : ngày sau cấy

NT : nghiệm thức

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1: Toàn cảnh thí nghiệm nghiên cứu cải tiến môi trường thứ cấp

nhân nuôi cấy nấm Trichoderma virens 44

Hình 2: Bào tử Trichoderma virens ở môi trường cám : tấm : trấu

với tỷ lệ 1:2:1 và 50 % nước được 12 ngày sau khi cấy nấm 44 Hình 3: Làm khô nấm trong phòng kín và sấy bằng máy 45

Hình 4: Nấm Trichoderma virens khi sấy trực tiếp bằng máy

và hong trong phòng sau 36 giờ 45

Hình 5: Bào tử nấm Trichoderma virens trước và sau khi sấy ở 30 0

C 46

Hình 6: Chế phẩm NLU – Tri 47

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 4.1: Mật số bào tử sống ở các nghiệm thức môi trường

theo thời gian nuôi cấy 29 Bảng 4.2: Ẩm độ của từng nghiệm thức ở 30 0

C và 35 0C theo thời gian sấy 31 Bảng 4.3: Mật số bào tử sống của các nghiệm thức khi sấy ở 30 0

C

và 35 0C ở các giai đoạn 32 Bảng 4.4: Ảnh hưởng của môi trường thứ cấp tới khối lượng

chế phẩm thô tạo ra, hiệu quả kinh tế và chênh lệch

lợi nhuận so với nghiệm thức đạt hiệu quả cao nhất 33 Bảng 4.5: Ảnh hưởng của thời gian hong ở nhiệt độ phòng tới thời gian sấy,

tỉ lệ nhiễm tạp và mật số bào tử/gam chế phẩm thô tạo ra 34 Bảng 4.6: Ảnh hưởng của kích cỡ sàng máy nghiền tới tỉ lệ hao hụt bào tử sống

và tỉ lệ hao hụt khối lượng chế phẩm thô 36 Bảng 4.7: Ảnh hưởng của kích thước lỗ sàng đến độ hòa tan sản phẩm thô

trong nước, độ vón cục và số lần tắc vòi phun 37

Công tác phòng trừ sâu bệnh hại cây trồng hiện nay được áp dụng bằng nhiều biện pháp Trong đó, biện pháp hoá học vẫn được xem là hữu hiệu nhất Một vài hoá chất trừ sâu có tính chọn lọc cao, ít độc hại cho môi trường đã được sử dụng, nhưng những hoá chất này thường quá đắt chỉ để sử dụng cho phạm vi nông trại nhỏ Bên cạnh đó, biện pháp phòng trừ sâu bệnh hại bằng thuốc hoá học ồ ạt như hiện nay (có trên 400 hoạt chất nông dược sử dụng ở Việt Nam, cục BVTV, 2008), nông dân thường pha thuốc với nồng độ cao và phun nhiều lần cho một vụ trồng đã thể hiện rõ những mặt trái của nó như làm cho các loại sâu bệnh hại trở nên kháng thuốc, gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng nông sản, sức khỏe của người sản xuất cũng như người tiêu thu, đặc biệt là gây ô nhiễm môi trường một cách nghiêm trọng

Trước tình hình đó, biện pháp phòng trừ sâu bệnh hại bằng sinh học đã được nhiều nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu Nhiều tác nhân ký sinh, đáng chú ý là một số loại nấm, chúng có thể đối kháng trên một số loại tác nhân gây bệnh hại gây ra tổn thất cho cây trồng Đồng thời, không những ngăn chặn được một số bệnh hại trên

đồng ruộng, những chế phẩm nấm đối kháng không ảnh hưởng đến những loài thiên địch bản xứ trong tự nhiên như động vật ăn thịt, ký sinh và côn trùng có ích

Sự bảo tồn các loài thiên địch tự nhiên này là chìa khoá vững chắc để phòng trừ sâu bệnh hại trên cây trồng một cách an toàn và hiệu quả Một số kết quả đã đạt được của việc phòng trừ nấm gây bệnh bằng phương pháp sinh học cho thấy tính hiệu quả của nó, nấm gây bệnh không kháng thuốc, không gây ô nhiễm môi trường Theo Cook và Barker (1983), phòng trừ sinh học là việc sử dụng một hoặc nhiều sinh vật nhằm làm giảm lượng độc tố hoặc hoạt động gây hại của tác nhân gây bệnh Định nghĩa này bao gồm việc sử dụng các biến thể ít độc lực của mầm bệnh, sự sử dụng ký chủ kháng bệnh và vi sinh đối kháng

Hiện nay, phòng trừ dịch hại cây trồng bằng biện pháp sinh học được đẩy mạnh ở nhiều nước, được coi như là một lĩnh vực quan trọng Biện pháp chủ yếu là khai thác và sử dụng khả năng đối kháng của một số loại nấm đối với các loại nấm gây

hại cây trồng Nhiều công trình nghiên cứu về nấm Trichoderma và sản xuất chế phẩm của nấm Trichoderma để hạn chế những nấm gây hại cho cây trồng như nấm

Rhizoctonia, Sclerotium, Fusarium, Pythium và Botrytis gây bệnh trên lúa, ngô và một

số cây trồng khác đã thu được những kết quả mong muốn Tuy nhiên, hiện nay vẫn

chưa tìm ra được một quy trình cụ thể để sản xuất Trichoderma phục vụ cho nhu cầu

của người dân, tìm ra một môi trường thích hợp để nhân nuôi nấm, làm khô nấm sau khi nhân nuôi, nghiền để thu nhận bào tử nấm

Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu cải tiến quy trình nhân nuôi nấm Trichoderma virens, sấy khô và xay nghiền tạo chế phẩm NLU – Tri” đã được tiến hành tại phòng

thí nghiệm của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM dưới sự hướng dẫn của TS Lê Đình Đôn

1.2 Mục đích và yêu cầu

1.2.1 Mục tiêu

− Tìm ra một môi trường thích hợp để nhân nuôi nấm

− Tìm ra cách làm khô nấm phù hợp sau khi nhân nuôi

− Tìm ra phương pháp nghiền để thu nhận bào tử nấm

1.2.2 Yêu cầu

− Theo dõi tỉ lệ bào tử nảy mầm, mật số bào tử nấm Trichoderma

virens/gam được nuôi trên môi trường thứ cấp và tỉ lệ nhiễm tạp

− Theo dõi ẩm độ của các nghiệm thức sau khi hong trong phòng kín, thời gian sấy khô của các nghiệm thức, tỉ lệ sống, tỉ lệ nhiễm tạp trong quá trình sấy và

mật số bào tử/gam chế phẩm Trichoderma virens

− Ghi nhận chỉ tiêu tỉ lệ hao hụt do nghiền, tỉ lệ hao hụt bào tử nấm do nghiền, độ tan của bào tử trong nước

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Nguồn gốc của Trichoderma

Trichoderma được tìm thấy khắp mọi nơi trừ những vĩ độ cực Nam và cực Bắc Chúng phổ biến trong những khu rừng nhiệt đới ẩm hay cận nhiệt đới hơn là

những khu rừng ôn đới hay rừng phương bắc Trichoderma tồn tại trong những môi

trường như rễ cây, thân cây, trong đất, sống trên xác thực vật đã chết, xác hữu cơ hay

kí sinh trên những loại nấm khác

2.2 Đặc điểm của nấm Trichoderma

2.2.1 Hình thái, sự sinh trưởng và sự hình thành bào tử của Trichoderma

2.2.1.1 Đặc điểm hình thái

Trichoderma là một loại nấm mốc Đa số chúng phát triển nhanh ở nhiệt độ tối

ưu giữa 25 – 30 0C, một vài loài phát triển tốt ở 35 0C, một ít là phát triển ở 40 0

C Khuẩn lạc: Theo Persoon ex Gay (1801), trên cùng một môi trường nuôi cấy

mỗi loài Trichoderma có hình dạng khuẩn lạc khác nhau Khuẩn lạc Trichoderma,

phát triển nhanh chóng và thành thục trong vòng 5 – 7 ngày Trên môi trường PDA, ở

25 0C ban đầu đám khuẩn lạc có màu trắng, khi bào tử xuất hiện thì chuyển sang xanh đậm hoặc xanh vàng Ở một số loài còn có khả năng tiết ra một số chất làm thạch (môi trường PDA) hoá vàng (Tăng Thị Ánh Thơ, 2005)

Cuống bào tử: Những loài Trichoderma thì chưa được xác định rõ ràng về đặc

điểm của cuống bào tử Cuống bào tử mọc lên trong những cụm hay những nốt sần dọc theo sợi nấm hay trong khu vực tỏa ra của khóm những nốt sần có kích thước từ 1 – 7

mm, chúng có thể rất rắn chắc hoặc chúng có thể có dạng như bông và không rắn chắc (Samuels,2004); (trích dẫn bởi Trần Tấn Đạt, 2005)

Bào tử: Trichoderma có bào tử có màu xanh đặc trưng, nhưng có thể là màu

trắng, vàng hay xanh xám tùy thuộc vào loài Bào tử luôn luôn đơn bào Ở đa số loài chúng có dạng hình elip đến dạng chữ nhật với tỉ lệ dài/rộng từ 1,0 – 1,1 µm, bào tử

luôn luôn dài dưới 5 µm Có loài thì bào tử trơn láng có loài thì bào tử có nhiều nốt sần (Trần Thị Mộng Thi, 2005)

Chlamydospores: Đây là những bào tử có tính chống chịu cao, những bào tử chlamydospore được tin rằng là những cấu trúc ở dạng ngủ, mà những cấu trúc này làm tăng khả năng sống sót trong đất, vốn là môi trường sống nguyên thuỷ của loài

Trichoderma Chalamydospores có thể được tận dụng trong điều chế chất kiểm soát sinh học do khả năng sóng sót của chúng (Samuels, 2004); (trích dẫn bởi Trần Tấn Đạt, 2005)

2.2.1.2 Sự sinh trưởng của Trichoderma

Trichoderma là một loại nấm hoại sinh trong đất nên Trichoderma có khả

năng sử dụng nguồn hỗn hợp cacbon và nitrogen Nguồn cacbon và năng lượng

Trichoderma sử dụng được là đường đơn và đường đa, cùng với hỗn hợp purines, pyrinidines, acid amin, tanmins và caechins cô đọng và acid hữu cơ Đặc biệt là acid béo, methanol methylamine, formate và NH3 là nguồn đạm bắt buộc phải có trong môi

trường nhân nuôi Trichoderma

Môi trường có nhiều dinh dưỡng, muối, các nguồn sulfat và các hỗn hợp vitamin cũng có ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh trưởng của Trichoderma Nhưng

muối sodium chloride sẽ làm giảm sự sinh trưởng và phát triển của một số nấm

Trichoderma Do đó trong môi trường nuôi trồng không được có mặt của muối này

Nồng độ CO2 trong môi trường nuôi trồng cũng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm đối kháng trong đất Tuy nhiên ảnh hưởng của CO2 đến khả năng sinh

trưởng và sản xuất của Trichoderma phụ thuộc vào nồng độ pH của môi trường đất

CO2 nồng độ 10 % không ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng của Trichoderma Tốc độ mọc nhanh của Trichoderma ở nồng độ CO2 cao trong môi trường kiềm, có thể giải

thích tại sao Trichoderma thường sống trong môi trường đất phèn, ẩm ướt, ít hiện diện

trên đất kiềm vì thế CO2 có ảnh hưởng đến sinh trưởng của Trichoderma tại độ pH có

giá trị cao

2.2.1.3 Sự hình thành bào tử trên môi trường

Phần lớn các loài Trichoderma có cảm quan, dễ nảy mầm ở nhiều điều kiện

môi trường tự nhiên và nhân tạo dưới điều kiện tối sáng lẫn lộn, hay bào tử có thể xuất hiện trong điều kiện sáng Môi trường agar trong khoảng 20 – 30 giây ánh sáng 85 Lux

làm tăng hiệu quả nảy mầm Nhiều tác giả công bố Trichoderma không hình thành bào

tử ở bước sóng dưới 254 nm hoặc trên 1100 nm và hình thành bào tử nhiều nhất ở bước sóng 380 – 440 nm

Các bào tử cảm quan hạn chế phát triển dưới ảnh hưởng của các hóa chất Các hỗn hợp như azaguanime, 5–fluorouracil, actiomycin D, cycloheximide, phenethyl alcohol và ethidium bromide ngăn cản sự hình thành các hậu mô bào tử, đây là một cấu trúc đặc biệt của cơ thể rất quan trọng trong hình thái học, làm tăng tiềm năng trong phòng trừ sinh học Trichoderma harzianum, Trichoderma hamatum,

Trichoderma viride và Trichoderma virens ở trong cả môi trường lỏng và rắn có nồng

độ acid thích hợp cho bào tử nảy mầm hơn là trong môi trường trung tính

2.2.2 Điều kiện sống trong tự nhiên của nấm Trichoderma

Đa số các loài Trichoderma phát triển mạnh ở 25 – 30 0C, phát triển chậm ở

35 – 37 0C Thêm vào đó, hình thái khác nhau cũng xuất hiện ở các mức nhiệt độ khác nhau Ở 35 0C chúng tạo ra những khuẩn lạc rắn dị thường với sự hình thành bào tử nhỏ và ở mép bất thường, trong khi ở 37 0C thậm chí không tạo bào tử sau 7 ngày nuôi cấy (Samuels, 2004)

Đất tự nhiên có khả năng kháng nấm và khả năng này sẽ mất dần Điều này

có liên quan đến sự xuất hiện và mật độ phân bố cơ học của Trichoderma Bào tử phân sinh của Trichoderma có khả năng kháng nấm cao và liên quan đến hiện tượng giảm

khả năng kháng nấm trong đất Độ nhạy cảm đất kháng nấm được công bố trên đất trung tính, đất kiềm chua và đất acid Bào tử phân sinh kháng nấm ở trong đất nhiều hơn bào tử chống chịu, sợi nấm ít kháng nấm hơn bào tử phân sinh (Papavizas, 1985)

 Sự thiết lập quần thể và hiện tượng nảy mầm trong đất:

− Vi sinh vật trong đất hoạt động phụ thuộc vào nhiều loại chất nền, có nhiều phương pháp xác định khác nhau Khi cấy sợi nấm non (chưa có bào tử) vào đất đều liên quan mật thiết đến thành phần môi trường đất Bào tử sẽ được nhân lên và thiết lập quần thể cân bằng trong đất (mật độ cân bằng duy trì trong đất từ 9 – 36 tuần sau khi cấy nấm vào trong đất) Điều này phụ thuộc vào tuổi của nấm và liên quan đến

thành phần thức ăn của nấm Việc hình thành quần thể sợi nấm Trichoderma từ thành phần nuôi cấy không liên quan đến loại đất Khi lên men Trichoderma, nếu thêm vào

chất Pyrax khô giúp tăng quần thể từ 5 x 103

lên 6 – 7 x 106bào tử/gam đất (Papavizas

và Lewis, 1989)

− Thiết lập quần thể tại vùng rễ cây: Trichoderma đã được phân lập từ rễ

cây và có khả năng dùng vào việc phòng trừ sinh học tại vùng rễ cây bị bệnh Hiệu quả

của Trichoderma không chỉ xử lý hạt mà còn tiếp tục thiết lập quần thể dưới vùng rễ cây sau khi xử lý hạt Trichoderma xử lý hạt phát triển nhanh xung quanh hệ rễ tạo các bào tử ngăn cản bệnh xâm nhiễm vào cây trồng Nếu Trichoderma được cấy vào trong

đất với tác dụng chống bệnh cho cây thì bắt buộc phải cấy dọc theo bề mặt rễ

Những nghiên cứu gần đây cho thấy Trichoderma harzianum không thiết

lập quần thể xung quanh hệ rễ cây họ đậu và cây đậu Hà Lan con Quan sát bào tử trên

vùng rễ cây gồm rễ, vỏ, lá mầm, hạt bị thối cho thấy số lượng bào tử Trichoderma trên mỗi gam đất xung quanh hệ rễ luôn luôn ít Bào tử của Trichoderma ít thiết lập quần thể hay ít di chuyển vào vùng rễ cây Với Trichoderma harzianum vài bào tử được tìm

thấy cách xung quanh hệ rễ cây 10 cm trên cây được xử lý hạt nhưng số lượng bào tử được tìm thấy nhiều trên lá mầm Đậu Hà Lan bị thối và vỏ hạt giống kể cả mẫu bệnh xung quanh rễ (Harma và ctv., 1983)

Có nhiều giải thích về số lượng bào tử Trichoderma tăng hoặc giảm trong đất và Trichoderma không có khả năng thiết lập quần thể ở vùng rễ cây: thiếu dinh

dưỡng, thể hiện chất độc trong rễ cây hay sự hiện diện của chất kháng hoặc sự hiện

diện của vi sinh vật đối lập với Trichoderma tại vùng rễ của cây (Ví dụ: Pseudomonas

sản xuất chất độc chuyển đổi gây ảnh hưởng đến sự phát triển của bào tử nấm

Trichoderma) (Hubbard và ctv., 1983)

2.3 Tiềm năng sử dụng Trichoderma trong phòng trừ sinh học

2.3.1 Vai trò của quần thể nấm Trichoderma trong đất

Trichoderma có khả năng tái tạo lại quần thể, được xem là một hiện tượng

phòng trừ sinh học vẫn chưa được giải thích về cơ chế Trichoderma có khả năng thiết

lập quần thể và tái hoạt động rất nhanh trên đất đã được xử lý khử trùng, xông hơi

bằng carbon disulfide để diệt nấm Armillaria mellea trên cây cam, quýt nhưng không công bố bằng chứng quần thể nấm Trichoderma phòng chống bệnh Ohr và ctv (1973)

đã cung cấp bằng chứng thuyết phục nhất về khả năng phòng trừ nấm Armillaria

mellea của quần thể Trichoderma trên đất đã được xử lý xông hơi bằng Methyl

Bromide (trích dẫn bởi Nguyễn Thân, 2004)

Thêm vào những bằng chứng về vai trò quần thể Trichoderma trong đất

trong vấn đề phòng trừ sinh học như thêm sulfur vào đất để duy trì độ pH dưới 3,9 làm tăng khả năng phòng trừ bệnh thối rễ và thối ngọn dứa ở Úc Cách phòng trừ này đã

làm giảm túi bào tử của nấm phytophthora và làm tăng tính ưa acid của Trichoderma

viride (Cook và Baker, 1983) Khả năng hoạt động phòng trừ sinh học của

Trichoderma ở các thể tiềm sinh và sợi nấm được công bố không chỉ trong phòng thí nghiệm (Cook và Baker, 1982) mà còn trong đất (Hubbard và ctv., 1983)

Trichoderma có khả năng khuếch tán chất độc của các nấm trong phòng thí nghiệm kể

cả các chất hữu cơ trong đất cũng như khả năng kéo dài phòng trừ sinh học của

Trichoderma

Ngoài ra, khả năng thứ hai của Trichoderma là kháng nấm Trichoderma

hamatum có rất nhiều trong đất hữu cơ tại vườn ươm ở Colombia có khả năng ngăn

chặn nấm Rhizoctonia solani và Trichoderma harzianum có nhiều khi phân lập từ đất

tại Mêxico có khả năng ngăn chặn nhiều loại nấm đất Dưới nhiệt độ và tia phóng xạ

gama không thể diệt được nấm Rhizoctonia solani, ngược lại trên môi trường

Trichoderma harzianum có thể diệt được nấm này, đây là vai trò chính của

Trichoderma trong phòng trừ sinh học

Khả năng ngăn cản của đất đến những loại nấm gây bệnh trong đất, đặc biệt

là R solani, Pythium spp., có liên quan đến nấm Trichoderma đã được công bố rộng

rãi và là vấn đề được nghiên cứu trong nhiều năm nay

2.3.2 Khả năng đối kháng của Trichoderma

Những loài Trichoderma được ứng dụng làm chế phẩm để chống lại bệnh

hại trên nhiều loại cây trồng như bông, nho, bắp, hành, đậu, mận, táo mà nguyên nhân

gây ra là do nấm Pythium, Phytophthora, Rhizoctonia, Sclerotium, Botrytis, Fusarium

và Crinipellis Trichodema không những ảnh hưởng trực tiếp lên mầm bệnh mà còn

ảnh hưởng gián tiếp lên hệ rễ giả, bằng khả năng loại bỏ mầm bệnh hay hỗ trợ cung cấp thêm dưỡng chất cho cây Những dữ kiện gần đây cho rằng những ảnh hưởng quan

trọng nhất của Trichoderma trong đấu tranh sinh học với những mầm bệnh trên cây là

tạo ra sức đề kháng cho cây chủ (Samuels, 2004)

Theo Harman (1990), khi cộng sinh trên rễ, Trichoderma ăn mòn, kí sinh và

cạnh tranh dinh dưỡng từ các loại nấm khác Chúng phát triển mạnh cho cả hai cơ chế

kí sinh những loài nấm khác và tăng sự phát triển của cây và rễ Cơ chế đối kháng của

Trichoderma là nấm kí sinh, tạo kháng sinh, cạnh tranh dinh dưỡng và không gian, chịu đựng những căng thẳng, tăng cường sự phát triển của rễ cây, hoà tan và cô đọng dinh dưỡng vô cơ, gây ra sự đối kháng, tiết ra enzyme làm mất hoạt tính của mầm bệnh

Theo Samuels (2004), cơ chế đối kháng của Trichoderma được mô tả là tiết

ra nhiều loại chất kháng sinh để ức chế sự phát triển của nấm bệnh như:

− Gliotoxin và gliovirin được sản xuất bởi Trichoderma virens Chúng kiềm chế sự nẩy mầm và phát triển của các loài Rhizoctonia solani và Pythium

− Alkyn pyrones (hương dừa): gồm có Trichoderma atroviride,

Trichoderma viride, Trichoderma koningii, Trichoderma hamatum Hoạt động của

phytotoxin có thể ngăn chặn sự nẩy mầm của những noãn bào tử của Phytophthora

cinnamomea và bào tử đính của Botrytis cinerea

− Isonitriles: gồm có Trichoderma hamatum, Trichoderma harzianum,

Trichoderma viride, Trichoderma koningii và Trichoderma polysporum, hạn chế sự phát triển của nấm gây bệnh

− Polyketides: Tiết ra từ Trichoderma harzianum

− Peptaibols: sản xuất ra từ Trichoderma polysporum, Trichoderma

harzianum, Trichoderma koningii hoạt động trên màng của nấm bệnh để ngăn cản sự tổng hợp enzyme membrane – associated trong sự hình thành tế bào Peptaibols hoạt động hỗ trợ enzyme phá hủy thành tế bào ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh

− Sesquiterpenes: Acid heptalidic được tạo ra bởi Trichoderma koningii,

Trichoderma viride, Trichoderma virens

− Steroids: viridin sản xuất bởi Trichoderma virens, hạn chế sự nẩy mầm

của bào tử Nó có khả năng như một độc tố thực vật có hiệu lực như là một loại thuốc diệt cỏ

Ngoài ra, 3 loại enzyme ngoại bào khác sinh ra từ nấm Trichoderma đã

được tách chiết, tinh sạch cũng có hoạt tính phân hủy chitine N – acetylglucosaminase, chitosesidase và endochitinase

Theo Cao Cường và Nguyễn Đức Lượng (2003), Trichoderma có thể đối

kháng với nhiều loài vi sinh vật nhờ nhiều cơ chế khác nhau như cạnh tranh dinh dưỡng và không gian, ký sinh hoặc quấn lấy sợi nấm gây bệnh, tạo ra kháng sinh hay tiết ra các enzyme (chitinase, β–1,3–glucanase) phân hủy vách tế bào chủ

Ngoài khả năng kiểm soát mầm bệnh thực vật, Trichoderma còn có khả

năng cải tạo đất trồng, làm tăng độ phì nhiêu cho đất nhờ khả năng phân giải một số phân lân khó tan và do nhiều enzyme phân hủy ngoại bào như là cellulase Dưới tác động của các enzyme các chất hữu cơ trong đất phân hủy nhanh hơn, làm tăng chất dinh dưỡng dưới dạng dễ hấp thu cho cây trồng sinh trưởng và phát triển tốt (Tăng Thị Ánh Thơ, 2005)

Ngoài chất độc và kháng sinh, Trichoderma còn tiết ra nhiều chất khác như

exon và endoglucanase, cellobiase và chitinase có khả năng phân hủy thành tế bào của

nấm gây bệnh Nấm Trichoderma cũng tương tự một số nấm mốc khác như

Gliocladium, Calvatia cho lượng enzyme chitanase cao Loại enzyme này có nhiều chức năng, trong đó chức năng phân hủy chitine là một chức năng chính, chitine là thành phần chính cấu tạo vách tế bào nấm, yếu tố quan trọng trong hoạt động ký sinh nhằm đối kháng lại các loài nấm gây bệnh thực vật Chitine có cấu tạo và chức năng giống cellulose, chitine có thể thay thế một phần hay toàn bộ cellulose trong thành tế bào của một số loài thực vật Chitine là chất rắn vô định hình, không tan trong nước, kiềm, alcohol, hầu hết các acid và các dung môi hữu cơ khác Chitine có thể bị phân hủy bởi các acid vô cơ mạnh (HCl đậm đặc, H2SO4 đậm đặc) hoặc bằng enzyme sinh vật (Võ Ngọc Trân, 2005)

2.3.3 Cơ chế đối kháng của nấm Trichoderma

Sự đối kháng của nấm Trichoderma thông qua nhiều cơ chế Weidling (1932), đã mô tả hiện tượng nấm Trichoderma ký sinh nấm gây bệnh và đặt tên cho

hiện tượng đó là “giao thoa sợi nấm” Hiện tượng giao thoa gồm 3 giai đoạn như sau:

− Giai đoạn 1: Sợi nấm Trichoderma vây quanh sợi nấm gây bệnh

− Giai đoạn 2: Sợi nấm Trichoderma thắt chặt lấy sợi nấm gây bệnh cây

− Giai đoạn 3: Cuối cùng, sợi nấm Trichoderma đâm xuyên làm thủng

vách tế bào của nấm gây bệnh, làm cho chất nguyên sinh trong nấm gây bệnh bị phân hủy và gây chết nấm bệnh

Rouscu và ctv (1996), đã quan sát dưới kính hiển vi về hiện tượng ký sinh

của nấm Trichoderma và mô tả như sau: Tại những điểm nấm Trichoderma tiếp xúc

với nấm gây bệnh đã làm cho nấm gây bệnh teo lại và chết Ngược lại, ở những điểm

không có sự tiếp xúc của nấm Trichoderma với nấm gây bệnh nhưng nấm gây bệnh

vẫn chết thì các nhà nghiên cứu cho là tác động của chất kháng sinh từ nấm

Trichoderma đã gây độc cho nấm gây bệnh (Michrina và ctv., 1996) (trích dẫn bởi Trần Thị Vân, 2010)

2.3.4 Vai trò của Trichoderma trong xử lý hạt giống

Có nhiều ghi nhận về khả năng kháng bệnh phòng trừ sinh học trên cây

trồng bị bệnh Mặc dù có nhiều loài nấm Trichoderma có khả năng dùng vào phòng

trừ sinh học nhưng chưa có một sản phẩm thương mại nào được đăng ký tại Mỹ (Papavizas và Lewis, 1981) Có nhiều lý do, một trong những lý do này là cần một số lượng lớn nguyên liệu phòng trừ sinh học trên một diện tích đất thí nghiệm lớn (Harman và ctv., 1980); (trích dẫn bởi Nguyễn Thân, 2004)

Sử dụng Trichoderma vào việc xử lý hạt giống có liên quan đến khả năng xâm nhập của Trichoderma vào trong đất, phương pháp này đòi hỏi một số lượng lớn

bào tử để áp dụng Tuy nhiên đây là một phương pháp rất có ý nghĩa trong việc phòng trừ nấm gây bệnh ở giai đoạn hạt đến giai đoạn cây con Khả năng phòng trừ sinh học

của nấm Trichoderma với bệnh chết rạp cây con do nấm Rhizoctonia solani và

Pythium spp, có hiệu quả trên hạt giống đậu Hà Lan và củ cải đường (Haman và ctv., 1980) Hạt giống bắp được xử lý bằng Trichoderma harzianum và hạt giống đậu nành được xử lý Trichoderma pseudokoningii có hiệu quả làm ngăn chặn nguồn bệnh và làm tăng năng suất trong việc phòng trừ nấm Rhizoctonia trên cánh đồng nhiễm nấm này và có hiệu quả khi dùng nấm Trichoderma harzianum xử lý hạt bông phòng trừ nấm Rhizoctonia solani tại Israel

Hiệu quả thành công trong việc dùng Trichoderma xử lý hạt giống ảnh

hưởng từ nhiều yếu tố phân lập: tuổi của hạt giống gieo trồng, nhiệt độ và tái hoạt động của đất, loại đất và vi sinh vật hiện diện trong đất, dinh dưỡng trong quá trình cấy nấm, mật độ nấm khi cấy vào đất, tiềm năng bệnh gây hại trong đất, và tuổi của cây trồng (Papavizas và Lewis, 1981); (trích dẫn bởi Nguyễn Thân, 2004)

Trichoderma có hiệu quả nhất trong việc phòng trừ bệnh chết rạp cây con, khả năng tạo sinh khối trong đất và hệ rễ ngăn cản bệnh gây hại cây bằng cách cạnh tranh, kí sinh trên nấm hoặc kháng sinh học Ngoài ra chúng còn gây ảnh hưởng mạnh đến vi khuẩn và các loại nấm khác trong đất (Hadar và ctv., 1984)

2.3.5 Các sản phẩm trao đổi của nấm Trichoderma

Theo Weidling (1932) là tác giả đầu tiên công bố sản phẩm được trao đổi

của Trichoderma Weidling và Emerson (1939), đã phân lập được chất kết tinh từ chất trao đổi hữu cơ rất độc khi pha loãng nhiều lần khi dùng Trichoderma chống

Rizoctonia solani Chất này tên thông thường: Gliotoxin chất độc thứ 2 do Brian và

Mc Growan (1958), công bố là viridin sản xuất từ Trichoderma viride Webster và

Lomas ghi nhận là 2 chất kháng sinh này đều hiện diện trên môi trường được lọc từ

Trichoderma viride sau đó Weidling cô lập ra sản phẩm gọi là gliotoxin, Brian và Mc

Growan cô lập viridin Dennis và Webstre (1965), ghi nhận Trichoderma spp Có khả

năng sinh ra các độc tố kháng với các loại nấm gây bệnh, khác với Gliotoxin và Viridin, sản phẩm đó là chất kháng sinh (trích dẫn bởi Nguyễn Thân, 2004)

Ngoài chất độc là chất trao đổi và kháng sinh ra, Trichoderma còn có thể tiết

ra nhiều enzyme khác như exo và endoglucanases, cellobiase và chitinase có khả năng phân hủy thành tế bào của nấm gây bệnh

Nấm Trichoderma cũng như một số nấm mốc khác như Gliocladium cho

lượng enzyme chitinase cao Chitinase có nhiều chức năng, một trong những chức năng chính là khả năng phân hủy chitine là thành phần chất dính cấu tạo vách tế bào nấm, yếu tố này rất quan trọng trong hoạt động ký sinh nhằm đối kháng lại các loài nấm gây bệnh thực vật

Chitine có cấu tạo và chức năng giống như cellulose, trong tự nhiên chitine

là thành phần hữu cơ chiếm thứ hai sau cellulose về số lượng Chitine có thể thay thế một phần hay toàn bộ cellulose trong thành phần tế bào của một số loài thực vật

Chitine là chất rắn vô định hình, nó không tan trong nước, hầu hết các acid, kiềm, alcohol và các dung môi hữu cơ khác Chitine có thể bị phân hủy bởi acid vô cơ mạnh (HCl đậm đặc, H2SO4 đậm đặc) hoặc bằng enzyme sinh vật Quá trình thủy phân sẽ cắt các liên kết β – glycoside cho ra olisaccharide

Trong quá trình ký sinh trên nấm bệnh, Trichoderma có thể tiết ra các loại

enzyme để phân hủy thành tế bào của nấm gây bệnh

Ngoài ra, 3 loại enzyme ngoại bào khác sản sinh ra từ nấm Trichoderma đã

được tách chiết, tinh sạch cũng có hoạt tính phân hủy chitine N acetylglucoamidase, Chitosesidase và Endochitinase

2.4 Các phương pháp lên men tạo chế phẩm sinh học

Hiện nay, trên thế giới có nhiều phương pháp lên men tạo chế phẩm sinh học để trừ nấm bệnh, sâu hại cây trồng trong nông nghiệp Người ta đã xây dựng những quy trình để thu nhận sản phẩm lên men khá hoàn chỉnh và được áp dung vào thực tế sản xuất lớn ở quy mô công nghiệp Tuy nhiên, quy trình lên men vẫn đang còn trong giai đoạn tìm kiếm một phương pháp thích hợp, chọn lựa điều kiện và môi trường nuôi cấy tối ưu để đạt số lượng bào tử gồm chất khô cao, giá thành sản phẩm rẻ đồng thời sản phẩm tạo ra dễ bảo quản, giữ được hoạt tính lâu bền ở nhiệt độ bình thường

Một số phương pháp lên men chế tạo chế phẩm sinh học đã được nghiên cứu và ứng dụng như sau:

2.4.1 Phương pháp lên men chìm

Nhiều tác giả đã áp dụng phương pháp lên men chìm để nuôi cấy các nấm

diệt sâu như nấm Beauveria bassiana (Samsinakova, 1961), Metarrhizium anisopliae

(Adamek, 1965) Nấm nuôi cấy chìm phát triển cho dạng Chlamydospores, còn khi nuôi bề mặt hoặc nấm phát triển cho dạng conidia (Nguyễn Thân, 2004)

Khi nuôi cấy chìm nấm thường phát triển qua 6 giai đoạn:

− Giai đoạn 1: bào tử phồng lên, tạo thành một hay nhiều ống mầm

− Giai đoạn 2: các sợi nấm phân nhánh

− Giai đoạn 3: tạo thành chlamydospores lần thứ nhất

− Giai đoạn 4: các chlamydospores phát triển lại tạo thành sợi nấm

− Giai đoạn 5: sợi nấm phát triển bắt đầu tạo chlamydospores lần thứ 2

− Giai đoạn 6: tạo thành chlamydospores lần 2

Nếu tiếp tục nuôi cấy sẽ xảy ra sự phân ly hoàn toàn của sợi nấm Lượng chlamydospores lần thứ 2 ổn định một thời gian, sau đó cũng giảm đi

Nhược điểm của phương pháp lên men chìm là chỉ thu được chế phẩm ở dạng bào tử chồi chlamydospores, không bền vững, dễ bị mất hoạt tính vì có thời gian sống ngắn, có cấu trúc không bền vững

2.4.2 Phương pháp lên men bề mặt không vô trùng tạo chế phẩm nấm

Phương pháp lên men bề mặt không vô trùng tạo chế phẩm nấm đã được thực hiện bởi Evlacchova (1968), đã áp dụng phương pháp lên men này để tạo chế

phẩm Boverin, chất diệt sâu vi sinh trên cơ sở nấm Beauveria bassiana Môi trường

dinh dưỡng được đun sôi ở 100 0C và khi nguội cho thêm chất kháng sinh Streptomycine (0,01%) để ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình lên men (Nguyễn Thân, 2004)

Tuy nhiên, để thực hiện phương pháp này có hiệu quả cần thực hiện 5 nguyên tắc chủ yếu sau:

− Nguyên tắc 1: Bào tử nấm được cấy phủ kín khắp bề mặt môi trường dịch (đã đun sôi 100 0C/20 phút) Các bào tử nấm sau khi cấy sẽ tự điều hòa khuyếch tán thành một màng mỏng khắp bề mặt môi trường, ngăn ngừa vi sinh vật lạ phát triển

− Nguyên tắc 2: Lượng bào tử trên một đơn vị bề mặt môi trường được cấy một lượng lớn đủ áp đảo được phát triển ban đầu của các vi sinh vật lạ (1 – 2 tỉ bào tử/cm2

2.4.3 Phương pháp lên men hai giai đoạn tạo chế phẩm nấm

Phương pháp lên men hai giai đoạn thực chất là phương pháp lên men chìm (giai đoạn 1) và sau đó chuyển sang lên men bề mặt (giai đoạn 2)

Như đã nêu trong phương pháp lên men chìm, sự phát triển của nấm xảy ra gồm 6 pha phát triển, thuận lợi nhất cho sự chuyển sang giai đoạn nuôi bề mặt là kết thúc pha 3 và bắt đầu pha 4, nghĩa là trong dịch nuôi cấy tạo nhiều Chlamydospores lần thứ nhất, bắt đầu phát triển thành sợi nấm

Mục đích cuối cùng khi sản xuất nấm là thu được một lượng lớn dạng conidia (bào tử có cấu trúc bền vững, có thời gian sống lâu, giữ hoạt tính bền lâu hơn) trên một thể tích môi trường dinh dưỡng Vì vậy, cần phải nghiên cứu điều kiện tạo conidia khi nuôi bề mặt ở giai đoạn 2

Khi nhiệt độ nuôi trong khoảng 26 – 32 0C có hiệu suất tạo conidia cao nhất, ngược lại hiệu suất giảm khi nhiệt độ thấp hơn 24 0C và cao hơn 35 0

C Ẩm độ không khí cao từ 90 – 100 % thúc đẩy nhanh sự tạo thành màng nấm trên bề mặt dịch nuôi và tạo nhiều conidia, ẩm độ không khí từ 70 – 80 % sẽ cản trở sự tạo thành màng nấm và tạo ít conidia

2.4.4 Phương pháp lên men xốp tạo chế phẩm nấm

Là phương pháp được áp dụng rộng rãi nhất vì đây là quá trình lên men đơn giản, dễ thành công hơn các quy trình khác Trong quy trình này, các loại cơ chất dùng

để làm môi trường cho nấm đối kháng phát triển là cám, trấu, bột gạo, bột bắp cùng với dịch dinh dưỡng để nuôi cấy nấm

Lên men xốp sẽ thu nhận được chế phẩm sinh học dạng đính bào tử (conidiospore) của các nấm đối kháng, ổn định và bề vững hơn dạng chlamydospores (bào tử chồi), vì vậy phương pháp này đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm đầu tư

Khi nuôi nấm đối kháng trên môi trường xốp theo Solivey F.F (1984) đã đạt hiệu suất bào tử so với các phương pháp lên men khác để chống sâu bệnh Tuy nhiên, khả năng sống của bào tử trong chế phẩm không chỉ phụ thuộc vào điều kiện bảo quản

mà còn phụ thuộc vào sự sấy khô và cơ chất dinh dưỡng Kết quả cho thấy các chế

phẩm sinh học nấm diệt sâu Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana nếu bảo

quản ở nhiệt độ 5 – 10 0C có thể giữ được hoạt tính trong 6 – 8 tháng Ngược lại bảo quản ở nhiệt độ phòng thì chỉ giữ được 6 – 8 tuần Như vậy các chế phẩm sinh học từ nấm được sản xuất ra cần phải được bảo quản ở nhiệt độ lạnh, nơi khô ráo và sẽ có khả năng giữ được hoạt tính của chế phẩm trong khoảng thời gian 6 – 8 tháng (trích dẫn bởi Nguyễn Thân, 2004)

2.5 Phương pháp lên men xốp tạo chế phẩm nấm Trichoderma

Người ta cũng thường áp dụng quy trình lên men xốp để tạo sinh khối, đã áp dụng trong sản xuất để diệt các loại nấm gây hại cây trồng Bởi vì môi trường lên men

xốp cho lượng bào tử/gam chế phẩm cao, quy trình đơn giản dễ thực hiện, giá thành sản phẩm tạo ra thấp, đáp ứng được nhu cầu của người nông dân

Để có được sản phẩm tạo ra có nhiều bào tử, các điều kiện môi trường như

ẩm độ tương đối không khí Rh = 95 %; nhiệt độ đạt 30 – 32 0C và thời gian nuôi cấy là

5 – 8 ngày

Thành phần các loại môi trường dùng để lên men xốp, cũng là tạo chế phẩm

nấm Trichoderma như sau:

(1) Bột ngô + bã đậu phộng (2) Cám gạo + bột ngô (3) Cám gạo + bột ngô + bột đậu nành (4) Cám gạo + bột ngô + bã đậu ngô (5) Lúa nấu chín

(6) Gạo nấu chín Ngoài ra các nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Tú (1997) còn thử nghiệm trên 3

loại môi trường khác nhau để nhân sinh khối Trichoderma đó là: môi trường 1 gồm

các thành phần là cám, trấu; môi trường 2 gồm than, bùn; môi trường 3 gồm bột thạch cao, tẩm, mật rỉ 10 % Thí nghiệm được tiến hành trong cùng điều kiện về ẩm độ, nhiệt

độ và thời gian nuôi cấy và hai dòng Trichoderma được chọn là Trichoderma 1 và

Trichoderma 2 Kết quả của thí nghiệm như sau:

− Môi trường cám trấu cho sản phẩm Trichoderma có số lượng bào tử

trong chế phẩm khô đạt 109 bào tử/gam, số lượng bào tử cao nhất và bảo quản ở nhiệt

độ phòng

− Môi trường than bùn và bột thạch cao tẩm mật rỉ cho số lượng bào tử/gam chế phẩm khô thấp hơn, khoảng 107

, 108 bào tử/gam

Tiếp tục thử nghiệm về thời gian bảo quản của chế phẩm Trichoderma 1 và

Trichoderma 2 đã lên men từ môi trường cám trấu sau 3 tháng bảo quản ở nhiệt độ phòng (29 – 32 0C) số lượng bào tử tính được trên một gam chất khô như sau:

Trichoderma 2 còn 2,72 x 109 bào tử/gam và Trichoderma 1 còn 0,65 x 109

bào tử/gam so với ban đầu là 5,88 x 109 bào tử/gam ở Trichoderma 2 và 2,24 x 109

bào

tử/gam ở Trichoderma 1

Tuy nhiên, chế phẩm Trichoderma tốt nhất là không nên để quá 9 tháng

Với chế phẩm nhân chưa bảo quản số lượng bào tử/gam là cao nhất nhưng sau quá trình bảo quản, lượng bào tử giảm dần, nhất là sau 12 tháng thì lượng chế phẩm giảm đáng kể Như vậy thời gian bảo quản càng lâu thì càng ảnh hưởng đến chất lượng của chế phẩm

2.6 Những nghiên cứu trong nước và ngoài nước về nấm Trichoderma

2.6.1 Nghiên cứu ngoài nước

Theo Kubicek và Harman (1998), từ đầu thế kỷ 19 giống Trichoderma đã được biết đến và có sự liên quan của nó với teleomorphs trong Hypocrea, nhưng sự phân loại loài sinh học là cực kỳ khó đối với giống này về mặt hình thái Trước đây,

Trichoderma được phân loại thuộc: lớp Deutermycete, bộ Moniliales, họ Moniliaceae

Nhưng kiểu phân loại này không còn sử dụng nữa Hiện nay, Trichoderma được xếp

thuộc giới nấm Fungi, ngành Ascomycota, lớp Ascomycetes, bộ Hypocreales, họ

Hypocreaceae, giống Trichoderma (Samuels, 2004)

Những nghiên cứu về trao đổi chất thứ cấp là phương pháp phân loại bổ sung cho thấy sự đa dạng trong giống này (Okura và ctv., 1982) Ngoài ra, những đặc điểm sinh lý học có thể hữu ích trong việc định danh Những mô tả sơ lược về các enzyme phân lập được cũng là một công cụ định danh hiệu quả (Samuels và ctv., 1994)

Đến cuối thế kỷ 20, các dữ liệu phân tử và kết quả phân tích DNA cũng được sử dụng trong định danh và phân loại Theo Samuels (2004), nhiều kết quả nghiên cứu đặc điểm về gen và hình thái đã được công bố Một số kết quả đó là:

Trichoderma viride, Trichoderma atroviride, Trichoderma koningii có quan hệ rất gần

nhau Trichoderma atroviride có hình thái rất giống với Trichoderma harzianum,

nhưng điểm khác đó là loài này sản xuất ra mùi dừa có hoạt lực cao (chất kháng sinh – pyrone) và loài này không thể phát triển ở 35 0C Xu hướng của Trichoderma

atroviride là dùng trong ứng dụng kiểm soát sinh học (Kuhls và ctv, 1997) (Trần Thị Vân, 2010)

Emxep V.T (1989) cho biết nấm Trichoderma không chỉ tiêu diệt rất nhiều

loài nấm gây bệnh cây trồng trong đất mà còn có tác dụng cải thiện cấu trúc và thành phần hóa học của đất, đẩy mạnh sự phát triển các vi khuẩn nốt sần cố định đạm có ích

trong đất và kích thích sinh trưởng, phát triển của cây trồng (Nguyễn Thị Phương Hoàng, 2005)

Loài Trichoderma harzianum thì thường thay đổi về mặt di truyền và hình thái Những thay đổi này đã đưa đến những đề xuất là có hơn một loài được nói đến (Grondona và ctv., 1997) Chaverri và ctv (2003) đã kết hợp những kết quả của sự sắp

xếp của 4 gen để chứng minh rằng Trichoderma harzianum là một loài phức tạp, trong

giới hạn của những phổ hệ phát sinh loài và hình thái học của loài này tồn tại Có

nhiều sự khác nhau về gen và hình thái trong những loài này Trichoderma harzianum

đã được nhận diện như là nguyên nhân gây mốc xanh trên những nấm lớn được phát triển thương mại ở Châu Âu và Bắc Mỹ Việc phân tích chuỗi DNA và quan sát một cách cẩn thận về hình thái đã cho thấy rằng loại nấm gây ra mốc xanh trên nấm lớn là

một loài mới, mặc dù có quan hệ rất gần với Trichoderma harzianum Loài mới này là

Trichoderma aggressivum, phát triển kém ở 35 0

C, trong khi Trichoderma harzianum

phát triển và hình thành bào tử rất tốt ở 35 0

C

Với hơn 200 loài Hypocrea đã được mô tả, chỉ có một số loài có mối liên hệ

với Trichoderma, như thế khả năng là có đến hàng trăm loài Trichoderma vẫn chưa

được mô tả Theo tổng hợp của Kubicek và Harman (1998) đã từng nhấn mạnh đến

những khó khăn trong việc định danh loài Trichoderma về mặt hình thái để phục vụ

cho việc phân loại Samuels (1996), đã cung cấp những quan sát chi tiết và nhận xét về

sự hữu ích của đặc tính hình thái để định danh loài Trichoderma Như vậy, định danh

trên cơ sở hình thái vẫn là phương pháp căn bản

Đặc điểm khuẩn lạc có thể là đặc trưng nổi bật của loài Tuy nhiên, khó mô

tả chính xác để định danh, tốc độ tăng trưởng trong môi trường nuôi cấy có thể hữu ích

để xác nhận những loài tương tự khác Sự sản sinh bào tử đính từ những cành sinh bào

tử đính hoặc cuống bào tử đính kết khối trong các cụm, các chùm thường là đặc tính của một loài Những sắc tố khuếch tán cũng có thể là một đặc trưng, mặc dù màu của

nó không biến đổi nhiều ở Trichoderma Những mẫu có liên quan điển hình với phân

nhóm Longibrachiatum có những sắc tố vàng – hơi xanh sáng nổi bật, tối thiểu là khi phân lập lần đầu tiên Những sắc tố vàng mờ đục thì phổ biến ở nhiều loài, nhưng lại không phải là đặc điểm phân biệt thực sự Ngược lại, vài loài hoàn toàn không có sắc

tố hoặc đôi khi có sự xuất hiện của sắc tố hơi đỏ Duy nhất loài Trichoderma

aureoviride sản xuất tinh thể đặc trưng trong môi trường đã từng được báo cáo Mùi

mục mốc nổi bật được tạo ra phổ biến bởi những dòng Trichoderma khác nhau

Trichoderma viride thường tạo ra mùi thơm ngát giống như hương dừa, đôi khi

Trichoderma atroviride cũng vậy (Samuels, 2004)

Kiểu phân nhánh của cuống bào tử đính và sự tập kết của nó thành cụm (chùm) hay mụn thì hữu dụng để định danh các dòng đến nhóm hoặc nhóm loài Những cụm pustules nén lại là đặc trưng của nhiều loài trong phân nhóm Pachybasium, mặc dù nhiều dòng trong những nhóm khác cũng thế Thể bình có thể được sắp xếp theo kiểu mọc vòng đều đặn, hoặc kết thành đôi, luân phiên hoặc sắp xếp không đều đặn Hình dạng của thể bình là đặc trưng của nhóm Những thể bình ngắn

và tròn một cách đặc trưng ở nhóm Pachybasium, trong khi ở phân nhóm Longibrachiatum chúng kéo dài ra và thuôn gần như là hình trụ Những thể bình tận cùng ở hầu hết các loài có khuynh hướng dài và hẹp hơn, thon nhọn ít nhiều Những tế bào cận cuối của cuống bào tử đính có thể tạo ra bào tử từ chỗ eo ngắn một phía

Trichoderma có khả năng thích nghi với điều kiện ẩm độ thấp, biên độ nhiệt

độ lớn và trên nhiều cơ chất khác nhau Tuy nhiên chưa có tài liệu nào cho thấy có thể

phân lập được Trichoderma trong các lớp mô thực vật nằm sâu dưới lớp vỏ cây Gần đây, Samuels và ctv (2005), đã công bố tìm thấy hai loài Trichoderma mới trên trái bị bệnh thối vỏ (do nấm Moniliophthora roreri) và cành cây ca cao khoẻ mạnh Đặc biệt,

cả hai loài nêu trên đều có khả năng tấn công trực tiếp Moniliophthora roreri bằng cơ

chế tiết kháng sinh bay hơi hoặc khuyếch tán hoặc cả hai

Samuels (2004) cho rằng hiện nay có khoảng 80 loài Trichoderma/Hypocrea

khác nhau về di truyền đã được xác định Dữ liệu phân tử cho phép kiểm tra kết quả phân loại về hình thái và tìm ra những khác biệt giữa các cá thể trong cùng một loài, tạo điều kiện cho việc quản lý, khai thác và bảo tồn chúng có hiệu quả hơn

2.6.2 Nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, nấm Trichoderma được bắt đầu quan tâm từ năm 1987 đến năm 1990, Viện Bảo Vệ Thực Vật đã tiến hành phân lập các chủng Trichoderma từ các nguồn khác nhau và xác định khả năng ức chế của Trichoderma đối với một số

nấm gây bệnh, tìm phương pháp nuôi cấy để tạo chế phẩm Các chủng nấm

Trichoderma đã thu thập được có hiệu quả ức chế từ 67,7 – 85,5 % đối với các nấm

gây bệnh như Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Fusarium spp., Aspergillus spp

Phòng vi sinh thuộc Phân Viện Sau Thu Hoạch đã phân lập được nấm

Trichoderma từ các nguồn nguyên liệu như đất vườn cây tiêu, sầu riêng, bã mía, gỗ

mục và đã định danh được 14 mẫu Trichoderma thuộc 9 loài: Trichoderma

pseudokoningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma parceramosum, Trichoderma harzianum, Trichoderma reesei, Trichoderma citrinoviride (Đinh Minh Hiệp, 2005)

Đã có một số công trình nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, ẩm độ đến sự tăng trưởng tạo sinh khối, sản sinh bào tử, các công trình nghiên cứu về khả năng tiết enzyme phân hủy chất hữu cơ và các nghiên cứu ứng dụng Trichoderma để phòng trừ

bệnh cây, kích thích sự tăng trưởng cây trồng, phân hủy rác thải Theo kết quả nghiên cứu của Cao Cường và Nguyễn Đức Lượng (2003) chitin vách tế bào nấm là một cơ

chất cảm ứng tốt đối với cellulase và chitinase Trichoderma harzianum có khả năng

kháng nấm bệnh là nhờ tiết enzyme ngoại bào trong đó có 2 enzyme quan trọng là cellulase và chitinase

Theo Đỗ Tấn Dũng và ctv (2001), đã khảo sát: “Đặc tính sinh học và khả

năng chống một số bệnh, nấm hại rễ cây trồng cạn của nấm đối kháng Trichoderma

viride ” đã kết luận rằng chế phẩm Trichoderma viride có thể sử dụng như một biện

pháp sinh học trong phòng chống nhóm bệnh nấm gây hại vùng rễ cây trồng cạn đối với bệnh lở cổ rễ, héo rũ trắng gốc cà chua, dưa chuột, đậu tương trong giai đoạn hạt

và cây con

Theo Quách Nhiên Hải (2003), Trichoderma lignorum có khả năng sản xuất

enzyme cenlullase khá mạnh và có khả năng phân hủy rác thải Chúng có khả năng làm giảm 25,1 % thể tích đống rác sau 21 ngày xử lý Enzyme cenllulase hoạt động hiệu quả ở nhiệt độ 40 0

C và pH = 4,5

Trichoderma spp có khả năng sống tốt trong môi trường lỏng được sục khí, chế phẩm dạng lỏng này có thể tồn trữ đến 30 ngày, và chúng có khả năng hạn chế bệnh chết cây con trên cây cải ngọt đồng thời làm tăng năng suất, khi xử lý

Trichoderma năng suất đạt 11,6 kg/m2so với 7,02 kg/m2(Trần Tấn Đạt, 2005)

Nghiên cứu của Nguyễn Thân (2004) cho thấy, Trichoderma phối trộn với

phân chuồng hoai mục giúp cây sầu riêng sinh trưởng tốt hơn và có khả năng phòng

trừ bệnh do Phytophthora gây ra Trichoderma asperellum (T32) và Trichoderma

virens (T41) đối kháng với nấm Phytophthora spp gây bệnh trên cây tiêu và sầu riêng

Có thể sử dụng chế phẩm Trichoderma ở dạng lỏng với nồng độ 100 g/lít phun ướt cây

tiêu 2 – 3 lần hoặc dùng dạng rắn bón sẽ cho hiệu quả phòng trừ bệnh tốt

Theo Nguyễn Xuân Thành (2003), nấm Trichoderma phân huỷ mạnh

celluloza nhờ tiết vào môi trường hệ thống celluloza hoàn chỉnh và chúng có thể tổng hợp các enzyme bền nhiệt hơn vi khuẩn, có thể phát triển ở pH = 3,5 – 6,6 Chúng được sử dụng để phân hủy rác sinh hoạt và các phế thải nông nghiệp Cũng theo

Nguyễn Xuân Thành (2003), nấm Trichoderma được dùng để xử lý phế thải rắn từ vỏ

cà phê Sau 2 – 3 tháng ủ tỉ lệ cenlullase trong vỏ cà phê giảm 60 – 80 % so với đối chứng Sau khi ủ 3 – 4 tháng các phế phẩm được tái chế làm phân bón cho cây trồng Việc bón các loại phân hữu cơ vi sinh này cho thấy:

Mía: tăng số nhánh hữu hiệu, tăng năng suất thực thu 4 –16 %

Ngô: tăng số cây 2 bắp, tăng số hạt trên hàng, năng suất tăng 12 – 25 %

Cà phê: giảm tỉ lệ rụng trái, tăng năng suất 11 – 19 % so với đối chứng Cao su: tăng tỉ lệ mủ sau một lần cạo mủ

Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thế Quyết và cộng sự (2003) ba

chủng nấm Trichoderma koningii, Trichoderma piluliferum, Trichoderma viride ức chế nấm bệnh Colletotrichum và có khả năng tạo amylase, protease ngoại bào

Trong những năm gần đây, một số sản phẩm Trichoderma của Viện Sinh

Học Nhiệt Đới đã đưa vào thử nghiệm trên cây rau ở Củ Chi – Thành phố Hồ Chí Minh, chế phẩm của Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật – Trường Đại Học Cần Thơ đều cho những kết quả rất khả quan Cho tới nay, theo các quyết định của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn số 22/2005/QĐ – BNN ngày 22/4/2005, số 25/2006/QĐ – BNN ngày 10/4/2006, số 108/2006/QĐ – BNN ngày 08/12/2006, có 6 sản phẩm chứa

Trichoderma được phép lưu hành có tên thương mại như TriB1, Vi–ĐK, Tricho–ĐHCT, Promot Plus WP, Promot Plus DD và NLU–Tri

Trong nước, những nghiên cứu sinh học tập trung về phân loại và đánh giá tính đối kháng trong phòng thí nghiệm còn chưa nhiều, chưa có những nghiên cứu về

di truyền và sinh hóa của quần thể nấm ở các vùng sinh thái khác nhau Tìm hiểu quần thể nấm có trong nước hay tại địa phương là rất quan trọng trước những tác động của

sự biến đổi sinh thái nghiêm trọng như hiện nay

Ch ương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu cải tiến môi trường thứ cấp nhân nuôi cấy nấm

Trichoderma virens

3.1.1 Mục đích

Nhằm cải tiến môi trường thứ cấp nhân nuôi cấy nấm Trichoderma virens

thích hợp để chuẩn bị cho việc hoàn thiện quy trình sấy khô và xay nghiền tạo chế

phẩm NLU – Tri

3.1.2 Vật liệu thí nghiệm

− Nguyên liệu:cám, tấm, trấu, nấm nguồn cấp 2

− Bọc đựng môi trường, kệ đựng nấm lên men xốp

− Nồi hấp khử trùng, cân, buồng đếm hồng cầu, đĩa petri, lam, lamen

− Tủ cấy vô trùng, máy sấy, máy nghiền, máy trộn

Ngoài ra, thí nghiệm còn sử dụng các dụng cụ và trang thiết bị tại phòng thí nghiệm thực tập bệnh cây thuộc Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật – Khoa Nông Học – Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

3.1.3 Phưong pháp thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố (công thức phối hợp môi trường) gồm 6 nghiệm thức (NT), 5 lần lặp lại trong phòng thí nghiệm của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM Các nghiệm thức gồm:

NT1: Môi trường cám : trấu : tấm, tỷ lệ 1:1:1 + (50 % nước)

NT2: Môi trường cám : trấu, tỷ lệ 1:1 + (50 % nước)

NT3: Môi trường cám : trấu : tấm, tỷ lệ 1:2:1 + (50% nước)

NT4: Môi trường cám : trấu : tấm, tỷ lệ 1:1:1 + (60 % nước)

NT5: Môi trường cám : trấu, tỷ lệ 1:1 + (60 % nước)