CẢI TIẾN QUY TRÌNH TỔNG HỢP SỢI ĐÔI DOUBLE STRANDED RNA TRONG GIẢI PHÁP CHUYỂN ĐỔI GIỚI TÍNH TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CẢI TIẾN QUY TRÌNH TỔNG HỢP SỢI ĐÔI DOUBLE STRANDED RNA TRONG GIẢI P

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

CẢI TIẾN QUY TRÌNH TỔNG HỢP SỢI ĐÔI DOUBLE STRANDED RNA TRONG GIẢI PHÁP CHUYỂN ĐỔI

GIỚI TÍNH TÔM CÀNG XANH

khoa học

Ị LIÊN HÀ

ÁO DỤC V ÔNG LÂM CÔNG NG

* * *

UẬN T

TỔNG H RONG GI

TỐT N

HỢP SỢI IẢI PHÁ CÀNG X

NGHIỆ

I ĐÔI DO

ÁP CHUY XANH

hiện

UYÊN THUUẬN

i

LỜI CẢM ƠN

Em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành đề tài tốt nghiệp này Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trường Đại Học Nông Lâm đã tận tình dạy dỗ, truyền đạt cho em kiến thức cho em

Xin được gửi lời tri ân sâu sắc tới Thạc sĩ Bùi Thị Liên Hà đã cất công hướng dẫn, chỉ bảo, truyền đạt lại cho em nhiều kiến thức, kĩ năng, thao tác thực hành và cũng là người tạo điều kiện tốt nhất giúp em hoàn thành tốt đề tài này

Xin chân thành cám ơn các thầy, cô, anh chị làm việc tại Trung Tâm Quan TrắcCảnh Báo Môi Trường Và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực phía Nam, các anh chị ở trại thực nghiệm Thủ Đức đã chỉ bảo tận tình, giúp đỡ em hết mình để

em sớm hoàn thành đề tài này

Con xin chân thành ghi tạc công ơn sinh thành, dạy dỗ của ba mẹ đã cho con một hình hài hoàn chỉnh và cho con được học hành để con có được thành quả ngày hôm nay

Xin Cám ơn các bạn của tôi đã luôn bên cạnh tôi!

Sau một thời gian thực tập tại phòng Sinh học thực nghiệm và trại thực nghiệm Thủ Đức, em đã hoàn thành đề tài tốt nghiệp này Do kinh nghiệm phòng thí nghiệm còn non yếu, kiến thức khoa học còn hạn hẹp và hạn chế về thời gian thực tập nên không thể tránh khỏi sai sót trong bài luận văn này Kính mong nhận được sự góp ý chân thành từ phía các thầy cô, Hội đồng tốt nghiệp và các bạn!

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2013

Nguyễn Chuyên Thuận

ii

TÓM TẮT

Tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) là một trong những đối

tượngthủy sảnnước ngọt có giá trị kinh tế cao ở Việt Nam và nhiều nơi trên thế giới

Trọng lượng tôm càng lớn thì lợi nhuận càng cao Khi tôm bước vào giai đoạn trưởng thành thì tôm đực thường có khối lượng lớn hơn tôm cái vì trong giai đoạn này con cái tập trung dinh dưỡng cho quá trình sinh sản Do đó, trong quá trình nuôi, đàn toàn đực sẽ cho năng suất cao hơn hẳn so với đàn toàn cái hoặc đàn có cả cái lẫn đực

Nhằm đem lại lợi nhuận cao nhất cho người nuôi đối tượng này, đã có nhiều công trình nghiên cứu nhằm tăng chất lượng tôm, cải thiện quy trình ương nuôi, chế độ dinh dưỡng, tôm bố mẹ, chọn giống,… Trong đó, nghiên cứu về sản xuất đàn tôm giống toàn đực là một hướng nghiên cứu mới lạ có ưu thế vượt trội hơn cả so với các biện pháp khác nhằm đem lại lợi nhuận cao cho người nuôi tôm

Không ngoài mục đích trên, nghiên cứu ứng dụng giải pháp công nghệ chuyển giới tôm càng xanh bằng công nghệ RNA can thiệp nhằm tạo ra đàn tôm toàn đực Kết quả nghiên cứu rất khả quan khi sợi đôi RNA đã được tổng hợp thành công Sau khi tổng hợp được sợi đôi dsRNA, giải trình tự và kết quả có trình tự tương đồng 99% so với trình tự của mRNA mã hóa cho hormone tuyến đực do Sagi và Ventura công bố trên NCBI năm 2009

iii

SUMMARY

Thesis: “Optimization of dsRNA synthesis protocol to aly to make neo – female

Macrobrachium rosenbergii”

Freshwater Prawn (Macrobrachium rosenbergii) is an importantcomponent of

shrimp exports and an earner foreign exachange

Males of the giant freshwater prawn M rosenbergiigrow faster and reachhigher

weight at harvest than females since females use considerable energy in egg production This is a fact which makes the culture of all - male populations desirable

Up to now, there are many works to improve raising proceed, freshsprawn parents’s qualify, increase nutrions content, select good gender to make the highest income for farmer and using double – stranded RNA to make neo-female from male is one of the best and newest method bring us same aim.Cause of this reason, we carry

out a research into this method to make neo - female Macrobrachium rosenbergii

After a long time, we have gotten some satisfactory results We had dsRNA with the same sequence with mRNA encode Androgenic Gland Hormone publicized in NCBI by Sagi et al in 2009 with 99% ofidentities

Key words: Macrobrachium rosenbergii, neo – female, dsRNA, RNAi

iv

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn i 

Tóm tắt ii 

Summary iii 

Mục lục iv 

Danh sách các chữ viết tắt vii 

Danh sách các bảng và biểu đồ viii 

Danh sách các hình ix 

Chương 1 MỞ ĐẦU 1 

1.1. Đặt vấn đề 1 

1.2. Yêu cầu của đề tài 2 

1.3. Nội dung của đề tài 2 

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 

2.1. Tôm càng xanh 3 

2.1.1.  Phân loại 3 

2.1.2.  Phân bố 3 

2.1.3.  Vòng đời của tôm càng xanh 4 

2.2. Tuyến đực của tôm càng xanh 5 

2.2.1.  Phụ bộ đực của tôm càng xanh 5 

2.2.2.  Tuyến đực ở tôm càng xanh 5 

2.2.3.  Hormone tuyến đực 8 

2.3. Tác động của tuyến đực lên sự phân hóa giới tính ở tôm càng xanh 8 

2.4. Công nghệ chuyển giới tôm càng xanh 9 

2.4.1.  Cơ sở lý thuyết tạo dòng tôm càng xanh toàn đực 9 

2.4.2.  Các phương pháp tạo tôm cái giả 10 

2.4.2.1 Dùng hormone 10 

2.4.2.2 Cắt bỏ tuyến Androgenic tạo tôm cái giả ZZ 10 

2.4.2.3 Cấy tuyến đực vào tôm cái 11 

v

2.4.3.  Các công trình nghiên cứu chuyển giới trên tôm càng 11 

2.5. RNAi, cơ chế tác động và ứng dụng RNAi trong tạo tôm càng xanh cái giả 12 

2.5.1.  Tổng quan về RNAi 12 

2.5.2.  Các công trình nghiên cứu về RNAi trên giáp xác 13 

2.5.3.  Cơ chế tác động 13 

2.5.4.  Ứng dụng trong việc tạo tôm càng xanh chuyển cái 14 

Chương 3VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 

3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện nghiên cứu 15 

3.2. Vật liệu 15 

3.2.1.  Vật liệu chuẩn bị cho DNA mạch khuôn 15 

3.2.1.1 Tăng sinh dòng vi khuẩn E coli JM109 mang vector tái tổ hợp 15 

3.2.1.2 PCR để có lượng lớn DNA mạch khuôn 16 

3.2.1.3 Tinh sạch vector pGEMT - Mr - IAG 16 

3.2.1.4 Giải trình tự 16 

3.2.2.  Vật liệu cho kiểm tra chất lượng DNA mạch khuôn trước khi tổng hợp sợi đôi

16 

3.2.2.1. Kiểm tra bằng phản ứng PCR với mồi đặc hiệu 16 

3.2.2.2. Dùng enzyme cắt giới hạn xử lý vector 16 

3.2.2.3. Giải trình tự 16 

3.2.3.  Vật liệu cho tổng hợp sợi đôi dsRNA 16 

3.2.4.  Vật liệu kiểm tra sợi đôi dsRNA sau tổng hợp 16 

3.2.5.  Vật liệu cho tiêm thử nghiệm sợi đôi dsRNA trên tôm PL17 và PL25 17 

3.3. Dụng cụ thí nghiệm: 17 

3.4. Phương pháp nghiên cứu 18 

3.4.1.  Kiểm tra sự hiện diện của tế bào E.coli JM109 mang vector tái tổ hợp 18 

3.4.2.  Tăng sinh khối tế bào E coli JM 109 mang vector tái tổ hợp 18 

3.4.3.  Giải trình tự hai chiều 19 

3.4.4.  Tổng hợp Mr - IAG ds RNA theo bộ kit Promega 19 

3.4.5.  Tiêm thử nghiệm trên tôm để khảo sát tần suất tiêm tạo tôm cái giả 20 

3.4.6.  Kiểm tra kết quả tiêm thử nghiệm trên tôm 21 

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 

vi

4.1. Kiểm tra chất lượng của DNA mạch khuôn trước khi tổng hợp sợi đôi dsRNA 22 

4.1.1.  Khuếch đại môi trường vi khuẩn E coli mang vector tái tổ hợp pGEMT – Mr - IAGđã tinh sạch với các cặp mồi đặc hiệu 22 

4.1.2.  Dùng enzyme cắt giới hạn xử lý vector tái tổ hợp pGEMT - Mr IAG 23 

4.1.3.  Giải trình tự để so sánh với trình tự Mr – IAG do Sagi và ctv công bố trên NCBI năm 2009 23 

4.2. PCR để có lượng lớn DNA mạch khuôn 25 

4.3. PCR sợi đơn cDNA sense và antisense và tinh sạch bằng bộ kit 25 

4.4. Tổng hợp các sợi đơn RNA sense và antisense 26 

4.5. Kiểm tra phản ứng tổng hợp sợi đôi dsRNA bằng các loại enzyme 27 

4.6. Kết quả khảo sát tần suất tiêm thí nghiệm trên PL17 và PL25 29 

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35 

5.1. Kết luận 35 

5.2. Đề nghị 35 

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 

PHỤ LỤC 40 

vii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AGH : Androgenic Gland Hormone

ATP : Adenosine Triphosphate

bp : base pair

cdna : Complementary deoxyribonucleic acid

ctv : cộng tác viên

DEPC : Diethyl Pyrocarbonate

DNA : Deoxyribonucleic acid

DNase : Deoxyribonuclease

dsRNA : double - stranded Ribonucleotide Acid

ĐBSCL : Đồng bằng song Cửu Long

FAO : Food and Agriculture Organization

RNAi : interference Ribonucleotide Acid

LB : Luria - Bertani

Mr – IAG : Macrobrachium rosenbergii Androgenic Gland specific insulin-like

NCBI : National Center for Biotechnology Information

NST : Nhiễm sắc thể

PCR : Polymerase Chain Reaction

PTGS : post - transcriptional gene silencing

RISC : Ribonucleotide induced silencing complex

RNA : Ribonucleotide Acid

Rnase : Ribonuclease enzyme

sRNAi : small interfering Ribonucleotide Acid

TBE : Tris bonic acid

UV : Ultra Violet - tia cực tím

viii

DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ

Bảng 3.1 Trình tự mồi của hỗn hợp phản ứng 20

Bảng 3.2 Thí nghiệm thức tiêm thử nghiệm trên tôm đợt 1 21

Bảng 3.3Thí nghiệm thức tiêm thử nghiệm trên tôm đợt 2 21

Bảng 4.1 Tỉ lệ tôm sống sau từng tháng thí nghiệm đợt 1 29

Bảng 4.2 Tỉ lệ tôm sống sau từng tháng thí nghiệm đợt 2 29

Bảng 4.3 Tỉ lệ tôm chuyển cái sau khi tiêm dsRNA 2 tháng đợt 1 30

Bảng 4.4 Tỉ lệ tôm chuyển cái sau 2 tháng tiêm dsRNA đợt 2 31

Biểu đồ 4.1Sự thay đổi giữa số lượng tôm ương và số lượng tôm còn sống sau 1, 2 và 3 tháng 29

Biểu đồ 4.2 Số lượng tôm đã ươm so với tôm còn sống trong 1; 2 và 3 tháng của đợt tiêm thí nghiệm thứ 2 30

ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Tôm càng xanh M rosenbergii 3

Hình 2.2 Vòng đời tôm càng xanh (Warangkana, 2008) 4

Hình 2.3 Phụ bộ đực tôm càng xanh 5

Hình 2.4 Hormone tuyến đực trên Armadilidium vulgare(Martin và ctv, 1999) 8

Hình 2.5 Sơ đồ tạo dòng đơn tính đực 9

Hình 2.6 Cơ chế hoạt động của RNAi 13

Hình 3.1 Vector pGEM®-T Easy 15

Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm của phản ứng PCR khuếch đại số lượng mạch khuôn với 3 cặp mồi đặc hiệu 22

Hình 4.2Kết quả điện di trên agarose 1,5% ở 100V trong 65 phút sản phẩm của quá trình cắt vector tái tổ hợp bằng EcoRI 23

Hình 4.3Kết quả BLAST nucleotide trình tự cDNA với trình tự Mr – IAG do Sagi và ctv công bố trên NCBI 24

Hình 4.4Kết quả điện di sản phẩm PCRthu lượng lớn DNA mạch khuôn 25

Hình 4.5Điện di kiểm tra sợi sense và antise sau khi PCR 26

Hình 4.6Kết quả điện disợi sense và antisense sau khi ủ trên gel agarose 27

Hình 4.7 Kết quả xử lý các sợi sense, antisense, dsRNA bằng các loại enzyme 27

Hình 4.8Tôm chuyển cái mang thuần thục về sinh dục, mang trứng trên đầu 31

Hình 4.9Tôm đực, tôm cái và kiểm tra chân bơi dưới kính hiển vi 32

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Việt Nam là một nước có nền nông nghiệp tương đối phát triển cả về trồng trọt lẫn chăn nuôi, nuôi trồng Đặc biệt, trong năm 2011 ngành nông nghiệp có 4 mặt hàng đạt kim ngạch xuất khẩu trên 3 tỷ USD là thủy sản (6,1 tỷ USD), đồ gỗ (4,1 tỷ USD), cao su (3,3 tỷ USD) Tính chung trong năm 2011, tổng kim ngạch xuất khẩu nông - lâm - thủy sản đạt gần 25 tỷ USD, tăng 29% (tăng trên 5 tỷ USD) so với năm 2010 Thặng dư thương mại toàn ngành đạt trên 9,2 tỷ USD, góp phần giảm nhập siêu cho cả nước (http://www.dangcongsan.vn)

Tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) là một trong những đối

tượngthủy sảnnước ngọt có giá trị kinh tế cao ở Việt Nam và nhiều nơi trên thế giới Sản lượng tôm càng xanh toàn cầu năm 2007 đạt 213.000 tấn,ước tính trị giá hơn 943 triệu đôla Mỹ (FAO, 2009) Sản lượng tôm càng xanh của Việt Nam đạt khoảng 3.000 tấn vào những năm 90, tăng lênkhoảng 10.000 tấn vào năm 2002 (Nguyễn Thanh Phươngvà Lý Văn Khánh, 2006) Tôm càng xanh là đối tượng ưu tiên phát triển nuôi trồng của nước ta, chính phủ đề ra mục tiêu phát triển nuôi tôm càng xanh trêndiện tích 32.000 ha và đạt sản lượng 60.000 tấn vào năm 2010 (Chính phủ Việt Nam, 1999)

Theo thống kê năm 2003, ở ĐBSCL thì số lượng tôm càng xanh giống sản xuất nhân tạo vào khoảng 92 triệu con và sản lượng tôm nuôi khoảng 1.300-1.500 tấn (Bộ Thủy sản, 2004) Kết quả này cho thấy đã có một sự phát triển đáng kể về nghề nuôi tôm càng xanh ở ĐBSCL, đặc biệt là việc thả nuôi bằng nguồn giống sản xuất nhân tạo (Lý Văn Khánh và Nguyễn Thanh Phương, 2006) Ngoài việc tìm nguồn giống tốt, tăng trưởng nhanh, chất lượng tốt thì nhà nông còn phải tìm mọi cách hạn chế hiểm họa từ khí hậu, thời tiết có ảnh hưởng bất lợi và bệnh tật cho thủy hải sản

Nhằm giúp đỡ người nuôi tăng thêm thu nhập thông qua việc tăng trọng lượng tôm nuôi thương phẩm, chúng tôi tiến hành thử nghiệm này là cần thiết bởi vìtrong quá trình tăng trưởng, con đực thường lớn nhanh hơn con cái Khi chiều dài cơ thể đạt trung bình 8 - 14cm và trọng lượng 10 - 20g, tốc độ phát triển của con đực và con cái tương đương nhau (Lê Quang Khôi, 2009) Khi chiều dài cơ thể vượt quá 14cm, con

đực thường lớn nhanh hơn con cái (Lê Quang Khôi, 2009) Ở giai đoạn này con cái ngưng phát triển và tập trung dưỡng chất cho việc sinh sản (Ra’anan và Cohen, 1984) Tôm đực lớn nhất có thể đạt 110g, trong khi tôm cái lớn nhất chỉ đạt 50g sau bảy tháng nuôi (Lê Quang Khôi, 2009) Giá trị kinh tế càng cao khi con tôm có khối lượng càng lớn và do đó, năng suất và lợi nhuận cũng sẽ tăng cao nếu như số lượng tôm trong ao toàn là tôm đực Chính vì thế, việc tiến hành nghiên cứu“Cải tiến quy trình tổng hợp sợi đôi double stranded RNA trong giải pháp chuyển đổi giới tính tôm càng xanh

(Macrobrachium rosenbergii) ”là cần thiết

1.2 Yêu cầu của đề tài

Mục tiêu của đề tài là cải tiến và ổn định quy trình thử nghiệm tạo sợi đôi dsRNA nhằm ứng dụng trong việc chuyển giới tôm càng xanhcho mục đích sản xuất ra quần thểtôm toàn đực

1.3 Nội dung của đề tài

- Tối ưu lại quy trình tổng hợp Mr-IAG RNA mạch đôi (sợi đôi RNA của gene

Insulin-like ảnh hưởng đến hormone quy định giới tính tôm càng xanh của tuyến đực)

- Khảo sát độ tuổi tiêm tôm

- Khảo sát tần suất và thời gian tiêm tôm

Chương 2TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Lớp phụ giáp xác bậc cao: Malocostraca

Bộ mười chân: Decapoda

Bộ phụchân bụng: Natantia

Phân bộ: Caride

Họ: Palaemonidae

Giống: Macrobrachium

Loàitôm càng xanh:Macrobrachium rosenbergiide Man 1879

Tên tiếng Anh: Giant prawn

2.1.2 Phân bố

Hầu hếtcác loài tôm nước ngọt được nuôi hiện nay đều thuộc

chiMacrobrachium, chi lớn nhất của họ Palaemonidae Hiện nay có khoảng 200 loài

tôm nước ngọt đã được mô tả và hầu hết chúng sinh sống trong vùng nước ngọt, ít nhất

là trong một khoảng thời gian nào đó trong vòng đời của nó Trong khoảng 200 loài tôm Macrobrachium trên thế giới thì có khoảng 49 loài đã được thương mại hóa và 27 loài trong số đó được tìm thấy ở Châu Á và Thái Bình Dương Hầu hết chúng sống ở vùng nước ngọt.Một số ít sống ở vùng nước lợ ở cửa sông (Warangkana, 2008)

Tôm càng xanh M rosenbergiiphân bố rộng khắp ở các khu vực nhiệt đới và á

nhiệt đới như khu vực Indo-pacific ở Malaysia, Thái Lan, Philiin, Ấn Độ, Shri Lanka, Bangladesh, Myanmar, Indonesia và Việt Nam Chúng thường được tìm thấy ở khu nước ngọt, ao, song, hồ, mương, kênh đào, vùng đất trũng….và cả vùng cửa sông Tôm càng xanh phát triển ở nhiệt độ khoảng 14oC - 35oC, khoảng pH và nhiệt độ tối

ưu cho tôm phát triển là 7,0 - 8,5 và 29oC - 31oC Hầu hết chúng trải qua các giai đoạn đầu tiên ở khu nước lợ cửa sông gián tiếp hoặc trực tiếp đổ ra biển.Sau đó, chúng ngược dòng nước, bơi về ao hồ, ruộng lúa cách biển khoảng 200 km Hình thức di cư

Hình 2.1 Tôm càng xanh

M rosenbergii

này không chỉ có ở tôm càng xanh mà còn có ở các loại tôm càng khác nữa (Narksen, 2008)

Ở Việt Nam,tôm càng xanh phân bố từ Nha Trang trở vào Việt Nam có sản lượngtôm càng xanh trong tự nhiên lớn hơn cả so với một số nước trong khu vực Đông Nam Á, với sản lượng khai thác khoảng6000 tấn trên năm (1980), trong khi đó ở Thái Lan là 400 ÷ 500 tấn trên năm, Malaysia là 120 tấn trên năm (Nguyễn Thị Thanh Thủy, 2002).Ở nước ta, trong ao nuôi hay trong khai thác tự nhiên, xuất hiện hai dạng tôm càng được gọi làtôm càng xanh và tôm càng lửa Tôm càng xanh phân bố ở tất cả các thủy vực nước ngọt (đầm, ao, sông, rạch, ruộng lúa ) và kể cả ở vùng nước lợ cửa sông

2.1.3 Vòng đời của tôm càng xanh

Theo Narksen (2008), trứng của loài tôm nước ngọt này có hình elip và độ dài trục lớn của hình elip này khoảng 0,6 - 0,7 mm và thường có màu vàng cam sáng Ấu trùng nở ra suốt đêm và trong suốt giai đoạn này, chúng cần tồn tại trong môi trường nước lợ Trong trường hợp ấu trùng nở ra ở khu vực nước ngọt thì chúng không thể sống sót nếu như không đưa chúng vào điều kiện nước lợ trong vòng 2-3 ngày

Trong tự nhiên, ấu trùng ăn động vật nổi, côn trùng nhỏ, ấu trùng của thủy sinh vật không xương sống.Ấu trùng cần ít nhất 26 ngày sau khi nở để phát triển thành hậu

ấu trùng.Theo Uno và Kwon (1969), thì ấu trùng trải qua 11 lần lột xác tương ứng mỗi giai đoạn có hình thái và kích thước khác nhau Giai đoạn 1 dài khoảng 2mm, giai

Hình 2.2 Vòng đời tôm càng xanh (Warangkana, 2008)

ực phát triể

Hình 2 ựcở tôm càn

ư con cái (Scái giả này

Giai đoạn hyếu bằng cá

Macrobrac

hoá các tínhSagi và Coh

y để tiến hàn

hậu ấu trùngách bò nhiều

và tiến về p

h

u ở tôm cànxuất hiện và

g, tổng chiềChung Quan

đực tôm càn

phát hiện vàniaux - Cot

á tính đực vào ống dẫn

oá khi được

chium rosen

h trạng sinhhen, 1990, S

nh một số c

g có hình d

u hơn là bơphía trước

dạng giống n

ơi lội tự do

c nó xuất hi

n khoảng 7m) đến gia

i đoạn non

p và thứ cấ , 1989) K

Sự cắt bỏ tu

có thể gây

ấp và con vậKatakura (1

47 ở

h vai uyến 987) uyến

y đảo

ật có 989)

h hậu

thế đã cho kết luận là tôm càng xanh thuộc loài dị giao tử cái và khi lai con cái giả ZZ với con đực ZZ thì cho ra 100% con đực

Phương pháp nghiên cứu giải phẫu mô tế bào cho phép khám phá ra tuyến đực bao gồm biểu mô tế bào gắn với phần sau ống dẫn tinh,biểu hiện bằng nhiều sợi với 1

tế bào, 1 sợi 1 tế bào hoặc chỉ 1 sợi có mối quan hệ với khối lượng của tế bào Tuyến

đực ởA Vulgarenằm ở đầu của mỗi bộ 3 cặp tinh hoàn (Narksen, 2008)

Năm 2002, Hasegawa và ctvđã tiến hành thí nghiệm để xác định sự phân bố của tuyến đực ở hệ thống sinh dục đực bằng một thí nghiệm hóa mô miễn dịch sử dụng một kháng thể chống lại các thành phần khác của phân tử tiền hormone tuyến đực Kết quả cho thấy có phản ứng miễn dịch mạnh mẽ ở cả ba loại kháng thể này trong khi đó tinh hoàn, tinh dịch và cả ống dẫn tinh lại không cho phản ứng màu miễn dịch

“Ở giáp xác, tinh sào là nơi tạo tinh trùng còn cơ quan tạo hormone là tuyến đực Nếu ở con đực động vật có xương sống, tuyến sinh dục đực (tinh sào) có hai chức năng căn bản là tạo tinh trùng và nội tiết như testosterone thì ở tôm càng xanh hai chức năng này thực hiện bởi hai cơ quan riêng rẽ Tinh sào ở tôm càng xanh chuyên tạo

tinh, còn tuyến đực (androgenic gland)-một cơ quan biệt lập khác có chức năng tiết ra

hormone, tham gia vào sự biệt hóa giới tính và phát triển những đặc điểm sinh dục thứ cấp, ảnh hưởng lên kích thước và sự tăng trưởng” (Sagi, 2005)

Nghiên cứu hoạt động tiết hormone của tuyến đực ởA Vulgarecho thấycác hạt

chứa AGH được chuyển từ ngoại bào vào nội bào qua các kênh chuyên biệt được hình thành để vận chuyển hormone (Narksen, 2008)

Theo Okumura (2004), tuyến đực là một cơ quan gắn liền với ống dẫn tinh Tuyến này chủ yếu gồm hai loại tế bào I và II Tế bào loại I có kích thước tương đối nhỏ, tế bào chất bị bắt màu đậm với thuốcnhuộm là Hematoxylin, tế bào loại II tương đối lớn hơn và bắt màu nhẹ khi nhuộm với Hematoxylin Dưới kính hiển vi điện tử, tế bào chất của tế bào loại I và II chứa đầy lưới nội chất hạt, chứng tỏ rằng các tế bào này đang hoạt động tổng hợp protein Ở tế bào loại I, lưới nội chất hạt trong tế bào chất dường như co cụm, tập trung và dày đặc hơn trong khi đó, ở tế bào loại II chúng có vẻ

ít hơn và phân tán hơn Mật độ điện tử trong tế bào chất ở tế bào loại II thấp Hai loại

tế bào này gần như thể hiện rõ sự khác biệt giữa các pha hoạt động của tế bào Theo dõi sự hiện diện của ti thể ở hai loại tế bào này nhưng sự kích thích bài tiết các hạt nhỏ (granules) thì không được theo dõi Tuyến Androgenic chứa cả hai loại tế bào trong cả

ba loại hình thái khác nhau: càng xanh, càng lửa và con đực nhỏ Tuyến này lớn nhất ở tôm càng xanh và nhỏ nhất ở con đực nhỏ Cấu trúc hiển vi của tế bào loại I được so sánh trong ba kiểu hình, tế bào loại I thể hiện nhiều sản phẩm protein điển hình hơn các tế bào loại II.Ở tôm càng xanh đực thì tế bào loại I trong tế bào chất phát triển tốt hơn và bao gồm cả sự phát triển của hệ thống màng lamellar Đặc tính này không thay đổi trong suốt quá trình lột xác của tôm càng lửa và tôm đực nhỏ

Cắt bỏ phụ bộ đực đang phát triển và càng thì tinh hoàn teo lại và ống dẫn tinh vẫn xuất hiện trong khi đó quá trình sinh tinh giảm sút Tuy nhiên, sự “ cái hóa” bao gồm sự sinh trứng và sự phát triển của nang trứng kèm theo đó là lông tơ sinh dục hình thành (Nagamine, 1980a) Ngược lại, khi cấy tuyến đực vào con cái thì lại xảy ra hiện tượng “đực hóa” Bằng chứng ghi nhận sự “đực hóa” này là sự xuất hiện của phụ bộ đực, gai sinh dục đực, ống dẫn tinh vàcàng phát triển Trong khi hoàn thiện các tính trạng đực thì noãn hoàng vẫn không được hoàn thiện (Nagamine, 1980b)

Khi cắt tuyến đực của tôm đực nhỏ, nó có thể biến dạng thành tôm càng cam nhưng không thể biến thành tôm càng màu xanh dương Khi cắt tuyến đực của tôm càng cam, nó vẫn biến thành tôm càng màu xanh dương Ở cả hai trường hợp này thì

cơ quan sinh dục ngoài đều biến mất cùng với nó là sự tiêu biến ống dẫn tinh cũng như tinh sào (Sagi và Cohen, 1990) Sau khi giải phẫu, các cá thể bị cắt tuyến đực có càng nhỏ hơn và lớn chậm rõ rệt so với nhóm đối chứng không bị cắt chân và nhóm bị “giả cắt” (sham operated) Khoảng 84% tôm bị cắt tuyến đực đã phát triển tuyến sinh dục cái, trong đó, 44% đẻ trứng và không thể phân biệt được về hình dáng bên ngoài với tôm cái bình thường Cho giao phối giữa những con cái này với những con đực bình thường cho kết quả: quần thể thứ nhất 100% đực, quần thể thứ hai chỉ có một con cái duy nhất (Sagi và Cohen, 1990)

Trong một thí nghiệm khác của Machela (1992), người ta cấy mô tuyến đực từ tôm càng xanh đực trưởng thành cho những con tôm được giả định là tôm cái còn non

Kết quả là những con tôm cái có kích thước vỏ đầu ức trong khoảng từ 6,5 - 7,5 mm

chuyển thành tôm đực gần như 100% Phối giống cho những con tôm này với những con cái bình thường Kết quả thu được 1 con đực/ 3,2 con cái, phù hợp với giả thuyết

về cơ chế NST quy định giới tính tôm càng xanh là ZW

2.2.3 Hormone tuyến đực

Một protein gồm có 3 chuỗi peptide A (chứa 29 aa), B (44 aa), và C (45 aa), ngoài ra trên chuỗi A ở aa thứ 18 còn có thêm một nhóm carboxyl, chúng được tìm

thấy trên giáp xác Armadilidium vulgare (Martin và ctv, 1999)

Hình 2.4 Hormone tuyến đựctrên Armadilidium vulgare(Martin và ctv, 1999)

2.3 Tác động của tuyến đực lên sự phân hóa giới tính ởtôm càng xanh

Tuyến androgenic có vai trò trong điều khiển giới tính của giáp xác bộ mười chân Nó làm xuất hiện những đặc điểm hình thể bên ngoài của con đực (Taketomi và ctv, 1990).Tuyến androgen (AG) là cơ quan nội tiết của con đực, có vai trò quan trọng trong việc hình thành giới tính và các đặc tính sinh dục thức cấp AG nằm cuối ống dẫn tinh, gần lỗ mở sinh dục và liên kết lỏng lẻo với ống dẫn tinh Theo Fingerman (1997) AGH là hormone điều khiển biệt hóa giới tính thành con đực và phát triển các đặc điểm sinh dục đực thứ cấp Sự tiết GSH và GIH được cho là do quy định của một

số chất dẫn truyền thần kinh và tác động trực tiếp vào buồng trứng của con cái Ở con đực, GIH tác động lên tinh hoàn gián tiếp bởi sự điều khiển AG và sau đó giảm tiết AGH Hormone kích thích tuyến sinh dục là cần thiết để có sự sinh tinh xảy ra trong tinh hoàn

Tuyến androgenic có nhiều nhất là ở tôm càng xanh đực, chứa trong mạng lưới nội chất sần sùi của tế bào chất Hoạt động của tuyến androgenic đóng vai trò kiểm

soát hoạt động phát dục của M rosenbergii (Okumura và Hara, 2004)

Sự phát triển của mạng lưới nội chất sần sùi trong tế bào chất của tuyến androgenic có liên quan đến hoạt động sinh sản của con đực ở một vài loài giáp xác mười chân (King, 1964; Taketomi và ctv, 1986, 1990, 1996; Kim và ctv, 2002)

Nếu không có AG hoặc sự tiết AGH không đủ thì tuyến sinh dục sẽ biệt hóa thành tuyến sinh dục cái Sự phát triển của AG được cho là dấu hiệu của tín hiệu di truyền Việc loại bỏ tuyến androgen trong giai đoạn sớm của sự phát triển dẫn đến sự phát triển ngược thành con cái và khi cấy tuyến đực vào con cái thì chúng phát triển thành con đực

2.4 Công nghệ chuyển giớitôm càng xanh

2.4.1 Cơ sở lý thuyết tạo dòngtôm càng xanh toàn đực

Cặp nhiễm sắc thể giới tính ở tôm càng xanh đực là đồng giao tử (ZZ) và con cái là dị giao tử (WZ) Để tạo dòng đơn tính toàn đực (100% tôm đực ZZ) thì cần có tôm bố và tôm mẹ có cùng NST ZZ Sơ đồ tạo dòng đơn tính đực được trình bày trên hình 2.5

Hình 2.5 Sơ đồ tạo dòng đơn tính đực

Để tạo dòng toàn đực việc cần thiết là phải tạo tôm cái giả mang NST ZZ (Ra’anan và Cohen, 1984)

2.4.2 Các phương pháp tạo tôm cái giả

2.4.2.1 Dùng hormone

Năm 2004, Baghel và ctv đã nghiên cứu ảnh hưởng chuyển đổi giới tính khi cho ấutrùng tôm càng xanh ăn artemia đã làm giàu với 17α-methyltestosterone, dạng steroid của động vật có xương sống, kết quả cho thấy 17α-methyltestosterone có tác dụng chuyển đổi giới tính của tôm càng xanh từ cái thành đực

Năm 2006, Ohsvà ctv dùng 17α-methyltestosteron bổ sung vào thức ăn để chuyển giới tính tôm càng xanh, tuy nhiên kết quả lại cho thấy 17α-methyltestosteron không có tác dụng trong việc chuyển đổi giới tính tôm càng xanh Ohs và ctvcho hậu

ấu trùng của tôm càng xanh thường (50% đực, 50% cái) ăn thức ăn có bổ sung dopamine với 3 nồng độ 0,15; 1,5; và 15m trong vòng 60 ngày Kết quả ở nhóm đối chứng có tỷ lệ tôm cái là 62,6%, trong khi đó 3 nghiệm thức cho tôm ăn thức ăn bổ sung dopamine với nồng độ 0,15; 1,5 và 15mg/kg có tỷ lệ tôm cái lần lượt là: 80,9%; 88%; và 71% Kết quả cho thấy có sự chênh lệch đáng kể giữa nhóm không và có cho

ăn thức ăn có bổ sung dopamine Thử nghiệm đã tạo ra một tiềm năng sử dụng dopamine để tạo ratôm càng xanh toàn đực phục vụ cho sản xuất

2.4.2.2 Cắt bỏ tuyến Androgenic tạo tôm cái giả ZZ

Sagi và Cohen (1990) đã cho biết “Khi cho những con cái chuyển giới khoẻ mạnh lai với con đực thông thường sẽ cho ra một dòng con toàn đực Điều này mở ra tiềm năng của công nghệ tạo con cái để có thể sản xuất ra quần thể hoàn toàn đơn tính

đực đối vớitôm càng xanhM rosenbergii

Kết quả của những nghiên cứu loại bỏ tuyến đực cho thấy kích cỡ và độ tuổi của tôm loại bỏ tuyến đực ảnh hưởng trực tiếp đến sự hình thành và phát triển các đặc điểm sinh dục thứ cấp Loại bỏ tuyến đực làm cho lỗ mở sinh dục ở gốc chân bò 5 biến mất, ống dẫn tinh, túi tinh thoái hóa, gai sinh dục đực và ống ampullae tiêu biến … (Sagi và ctv., 1990) Loại bỏ tuyến đực là nguyên nhân làm tôm phát triển tuyến sinh dục bất thường, nếu tôm đã lớn việc loại bỏ tuyến đực chỉ sẽ làm giảm sự phát triển của tinh hoàn Nếu tôm chưa có dấu hiệu sinh dục thứ cấp, việc loại bỏ tuyến đực làm cho tôm có sự biểu hiện đặc điểm sinh dục của con cái trong con đực như hình thành trứng, phát triển ống dẫn trứng và lỗ mở sinh dục cái (Nagamine và ctv., 1980), tạo noãn hoàng thứ cấp xuất hiện trong huyết tương và một lượng lớn tế bào trứng tích lũy noãn hoàng trong buồng trứng (Khalaila và ctv., 1996), phát triển thành con cái, có

khả năng giao phối với tôm đực bình thường và sinh ra thế hệ con toàn đực (Sagi và ctv., 1999)

Việc loại bỏ AG ở con đực, làm mất AGH gây nên hiện tượng con đực thành con cái mang NST ZZ Kỹ thuật vi phẫu loại bỏ tuyến androgenic được thực hiện lần đầu tiên bởi Sagi và ctv năm 1990 Ở Việt Nam, kỹ thuật vi phẫu đã được thực hiện vào năm 2004 (Nguyễn Văn Hảovà ctv, 2004)

Ngược lại với ứng dụng rộng rãi những phương pháp chuyển giới tạo dòng đơn tính trên cá, ở đối tượng tôm nuôi, việc tạo quần thể đơn tính vẫn còn hạn chế và chưa

đủ để đáp ứng nhu cầu thực tế Vài nỗ lực bước đầu đã được nghiên tính cứu ứng dụng nuôi quần thể đơn tính trên cả loài tôm nước mặn và nước ngọt (Sagi và ctv., 2005; Malecha và ctv., 2004)

2.4.2.3 Cấy tuyến đực vào tôm cái

Trong một thí nghiệm người ta đã cấy mô tuyến đực từ tôm càng xanh đực trưởng thành cho những tôm giả định là cái còn non Những con cái với kích thước vỏ đầu ngực 6,5 - 7,5mmđã chuyển đổi giới tính thành đực gần như 100% Người ta đã phối giống những con đực chuyển giới từ cái với những con cái bình thường Kết quả thu được 1 đực /3,2 cái, phù hợp với giả thuyết cơ chế NST định đoạt giới tính ở tôm càng xanh là ZW (Malecha và ctv, 1992)

2.4.3 Các công trình nghiên cứu chuyển giới trên tôm càng

Năm 1990, Sagi và ctv đã thực hiện vi phẫu thành công loại bỏ tuyến đực của tôm càng xanh tạo ra tôm cái giả

Trong một thí nghiệm của mình, Machela và ctv (1992) đã cấy tuyến đực từ tôm càng xanh đực cho những con tôm cái giả định còn non, kết quả cũng thu nhận được tôm cái giả như mong muốn

Tiếp nối thành công của nghiên cứu về hình thái và cấu trúc của tuyến

Androgen ở tôm càng Macrobrachium nionenese de Haans năm 2003 của mình, một

năm sau đó, Nguyễn Mộng Hùng, Bùi Việt Anh đã chuyển đổi thành công tôm càng đực thành tôm càng cái nhờ vi phẫu loại bỏ tuyến này

Năm 2004, Baghel cùng các ctv tiến hành thí nghiệm bổ sung hormone 17α - methyl testosteronevào thức ăn cho tôm với liều lượng khác nhau nhưng kết quả chuyển đổi giới tính không tốt như thí nghiệm của Ohs năm 2006

Năm 2005, Ventura, Sagi và ctv đề xuất ba phương án tạo dòng tôm đơn tính bằng cách: kết hợp giữa thu hoạch có chọn lọc thủ công, cắt bỏ càng; vi phẫu loại bỏ tuyến đực; dựa vào hoạt tính sinh học của sản phẩm tạo ra từ tuyến đực AG

Đến năm 2006, Rungsin và ctv đã thành công tạo ra quần thể tôm toàn đực bằng công nghệ tạo tôm càng xanh cái giả ở Thái Lan Số tôm cái giả thuần thục ở tháng thứ

5, 6 và 8 lần lượt là 2; 2; 15 (trong tổng số 21 tôm chuyển cái) Tất cả tôm cái giả cuối cùng đều có buồng trứng và có khả năng mang trứng

Năm 2006, Nguyễn Văn Hảo và Aflalo đã đề xuất nguyên tắc “hai bước” để tạo

ra tôm càng xanh giả cái Với phương pháp này thì người ta tiến hành bước 1 là tiểu phẫu loại bỏ tuyến nội tiết đực của hậu ấu trùng 25 - 60 ngày tuổi Ở bước II, đàn con (giả thuyết là tôm đực) của con cái giả ở bước I được lloại bỏ tuyến nội tiết đực ở giai đoạm sớm hơn (PL20-30) Qui trình hai bước này cho phép tạo ra một số lượng lớn tôm đực giống cho quá trình loại bỏ tuyến nội tiết đực

Năm 2009, Ventura, Sagi và ctv một lần nữa thành công khi tạo tôm cái giả Nhưng lần này họ dùng kỹ thuật can thiệp bằng RNAi để bất hoạt hormone tuyến đực

2.5 RNAi, cơ chế tác động và ứng dụng RNAi trong tạo tôm càng xanh cái giả 2.5.1 Tổng quan về RNAi

RNAi là sợi kép RNA (dsRNA) có khả năng bắt cặp đặc hiệu với trình tự mRNA được mã hóa bởi gene đích, thúc đẩy sự phân hủy gen đích và ngăn chặn sự biểu hiện của nó dsRNA can thiệp gián tiếp vào quá trình phiên mã gen làm bất hoạt gen (PTGS), kéo dài trong suốt quá trình tiến hóa Sợi RNA mạch đơn (sense hoặc antisense) có khả năng bất hoạt yếu hoặc không có khả năng bất hoạt trong khi RNA mạch đôi có khả năng bất hoạt gene rất hiệu quả (Đỗ Năng Vịnh, 2007)

dsRNA gây bất hoạt một cách rất đặc thù, nó chỉ phân hủy một phân tử mRNA

có các trình tự tương đồng với nó, các phân tử mRNA khác không bị ảnh hưởng Các sợi dsRNA chỉ có khả năng gây bất hoạt gene khi có trình tự tương đồng với mRNA

đã trưởng thành (mature RNA) (tức là mRNA đã ở ngoài tế bào chất và không còn mang các trình tự intron); Các trình tự tương đồng với intron hoặc promoter đều không

có tác dụng (Fire và ctv, 1998)

2.5.2 Các công trình nghiên cứu về RNAi trên giáp xác

Năm 2004, Guan, Mark, Chan và ctv, 2004 kết luận dsRNA làm giảm sự biểu hiện của GIHsau khi thí nghiệm trên tôm bằng cách tiêm dsRNA có trình tự tương đồng

với gene mã hóa gonad inhibiting hormon (GIH) trong tôm cát Metapenaeus ensis Kim, Behlke và ctv , 2005 cho rằngDicer-2 góp phần vào chức năng miễn dịch

không đặc hiệu ở tôm bằng cách nâng cao hiệu lực của RNAi Còn Chen, Jia, Zhao và

ctv.,2011kết luận ởtôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) thì Dicer-2 bao gồm

miễn dịchkhông đặc hiệu chống lại virus

Năm 2009, Ventura và Sagi thành công với nghiên cứu tiêm dsRNA vào tôm

Macrobrachium rosenbergiingăn cản sự phát triển đặc điểm sinh dục thứ phát “gai phụ

sinh dục đực” và giảm thông số tăng trưởng vốn thể hiện mạnh ở con đực

Năm 2010, Snell và ctv đã nghiên cứu nhằm tăng cường khả năngđánh giá những tính năng di truyền đặc biệt quan trọng ảnh hưởng đến vòng đời của luân trùng Brachionus plicatilis nhờRNAi (Snell và ctv., 2010)

2.5.3 Cơ chế tác động

Hình 2.6 Cơ chế hoạt động của RNAi

(www.rnaiweb.com)

Khi vào trong cơ thể, RNA sợi kép (dsRNA) bị một endonuclease (dicer) cắt thành những mảnh nhỏ (sRNAi) Sau đó, sợi kép ngắn lại được mở xoắn để tạo ra 2 sợi đơn ngắn và 1 trong 2 sợi đó là sợi antisense (sợi đối nghĩa) Sợi antisense ngắn (sRNAi) kết hợp vào phức hợp RISCbao gồm protein Argonaute (Ago) như là thành phần chính Ago tách ra và loại bỏ các thành phần không có tác dụng (sense) của sRNAi có ảnh hưởng đến hoạt động của RISC Các sợi antisense của sRNAi vẫn tồn tại và đóng vai trò như là sợi dẫn đường để các RISC tác động vào các mRNA tương đồng với nó, dẫn đến sự phân cắt các endonucleotide của mRNA đích (Fire và ctv, 1998) Phức hợp RISC bắt cặp với mRNA bằng liên kết tương đồng giữ các base Phần

dư ra của sợi mRNA sẽ bị RISC phân cắt Do đó sợi mRNA thông tin bị phân hủy và kết quả là protein được dịch mã từ mRNA này không được tổng hợp Quá trình dịch

mã gene bị bất hoạt

2.5.4 Ứng dụng trong việc tạo tôm càng xanhchuyển cái

Kỹ thuật RNAi được sử dụng cho giải pháp chuyển đổi giới tínhtôm càng xanh dựa trên nguyên tắc thiết kế các đoạn trình tự mạch đôi dsRNA giải mã ngược (cDNA)

từ hormone giới tính đực của tôm càng xanh (androgen hormone) Các đoạn trình tự (dsRNA) này sẽ được đưa vào bên trong cơ thể ấutrùng tôm càng xanh tại giai đoạn sớm từPL25-PL30 (trước khi có sự biệt hóa giới tính) nhằm can thiệp hoạt động mã hóa

và giải mã của hormone giới tính đực (Ventura và ctv 2009, Nguyễn Văn Hảo và ctv, 2004)

Chương 3VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện nghiên cứu

Thời gian thực hiện: Đề tài được thực hiện từ ngày 15 tháng 12 năm 2012 đến ngày 15 tháng 5 năm 2013

Địa điểm: Phòng Sinh học thực nghiệm, viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II,

số 116, Nguyễn Đình Chiểu, phường Đakao, quận 1, thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu

Hóa chất điện di: agarose, TBE 0,5 X, Gel red, 6X DNA loading dye, thang DNA ladder

3.2.1 Vật liệu chuẩn bị cho DNA mạch khuôn

3.2.1.1 Tăng sinh dòng vi khuẩn E coliJM109 mang vector tái tổ hợp

Môi trường LB lỏng có bổ sung ampicilline 100 µg/ml

Dòng vi khuẩn mang pGEMT- Mr -IAG lưu trữ từ ngày 16 tháng 7 năm 2011

trong tủ - 80oC( vector pGEMT – Mr – IAG được tạo ra bằng cách sử dụng plasmid pGEM®-T Easy, enzyme cắt giới hạn EcoRI và enzyme nối ligase để chèn đoạn cDNA mục tiêu vào plasmid tạo ra vector tái tổ hợp pGEMT –Mr – IAG Sau đó, dùng phương pháp sốc nhiệt để chuyển vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E coli JM109)

Hình 3.1 Vector pGEM®-T Easy

(http://www.promega.com/~/media/images/resources/figures/1400-1499/1473vaw4.gif?la=en )