NGHIÊN CỨU SỰ LÂY NHIỄM CỦA MACROBRACHIUM ROSENBERGII NODAVIRUS VÀ EXTRA SMALL VIRUS GÂY BỆNH ĐỤC CƠ TRÊN ẤU TRÙNG TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH  LÊ THỊ THÙY TRANG NGHIÊN CỨU SỰ LÂY NHIỄM CỦA MACROBRACHIUM ROSENBERGII NODAVIRUS VÀ EXTRA SMALL VIRUS GÂY BỆNH ĐỤC CƠ TRÊN ẤU TRÙNG TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii) LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 12/2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH ************************* LÊ THỊ THÙY TRANG NGHIÊN CỨU SỰ LÂY NHIỄM CỦA MACROBRACHIUM ROSENBERGII NODAVIRUS VÀ EXTRA SMALL VIRUS GÂY BỆNH ĐỤC CƠ TRÊN ẤU TRÙNG TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii) Chuyên ngành : Công Nghệ Sinh Học Mã số : 60.42.80 LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hướng dẫn Khoa học: TS LÝ THỊ THANH LOAN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 12/2011 i NGHIÊN CỨU SỰ LÂY NHIỄM CỦA MACROBRACHIUM ROSENBERGII NODAVIRUS (MrNV) VÀ EXTRA SMALL VIRUS (XSV) GÂY BỆNH ĐỤC CƠ TRÊN ẤU TRÙNG TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii) LÊ THỊ THÙY TRANG Hội đồng chấm luận văn: Chủ tịch: PGS.TS LÊ ĐÌNH ĐƠN Trường Đại học Nơng Lâm TP.HCM Thư ký: TS NGUYỄN PHÚ HỊA Trường Đại học Nơng Lâm TP.HCM Phản biện 1: TS VĂN THỊ HẠNH Viện Sinh học nhiệt đới TP.HCM Phản biện 2: TS NGUYỄN HỮU THỊNH Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM Ủy viên: TS LÝ THỊ THANH LOAN Viện Nghiên cứu Ni trồng Thủy sản II ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH HIỆU TRƯỞNG ii LÝ LỊCH CÁ NHÂN Tôi tên Lê Thị Thùy Trang sinh ngày 22 tháng 12 năm 1984 huyện Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh Con Ơng Lê Văn Đực Bà Nguyễn Thị Mười Tốt nghiệp Tú tài Trường Trung học phổ thơng Bình Khánh, Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2002 Tốt nghiệp Đại học ngành Chế biến thủy sản, hệ quy Đại học Nơng Lâm, Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2006 Sau làm việc Chi cục QLCL BVNL Thủy sản TP.HCM Tháng 09 năm 2008 theo học Cao học ngành Công nghệ sinh học Đại học Nông Lâm, Thủ Đức, Thành phố Hồ Chí Minh Tình trạng gia đình: độc thân Địa liên lạc: 707 Bình An, Bình Khánh, Cần Giờ, TP.HCM Điện thoại: 0935.182.535 Email: trangthuycg@gmail.com iii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan công bố luận văn trung thực phần đề tài “Xác định tác nhân gây bệnh đề xuất quy trình phòng trị bệnh đục thân tôm xanh (Macrobrachium rosenbergii) trại giống tỉnh An Giang (đề tài cấp Tỉnh Sở KHCN tỉnh An Giang chủ quản), quan chủ trì: Trung Tâm QG Quan Trắc, CB Môi trường PNDB Thủy sản KVNB – Viện NCNT Thủy sản II, TS.Lý Thị Thanh Loan làm chủ nhiệm, đề tài nghiệm thu cấp tỉnh Những số liệu luận văn phép công bố với đồng ý chủ nhiệm đề tài Xác nhận chủ nhiệm đề tài Lê Thị Thùy Trang iv LỜI CẢM ƠN Tôi xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô Trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh truyền đạt cho kiến thức quý báu suốt thời gian học tập trường Với lòng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn TS Lý Thị Thanh Loan tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện giúp tơi hồn thành luận văn Xin cảm ơn anh chị Trung tâm Quốc gia Quan trắc, Cảnh báo Mơi trường Phòng ngừa Dịch bệnh Thủy sản Khu vực Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi q trình thực luận văn Dù cố gắng để hoàn thiện luận văn không tránh khỏi khiếm khuyết định, mong nhận giúp đỡ bảo ý kiến đóng góp quý thầy cô, anh chị bạn Sau cùng, tơi xin cảm ơn gia đình anh chị bạn học viên Cao học ngành Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh ln ln động viên, quan tâm giúp đỡ tơi thời gian học tập v TĨM TẮT Đề tài “Nghiên cứu lây nhiễm Macrobrachium rosenbergii Nodavirus (MrNV) extra small virus (XSV) gây bệnh đục ấu trùng tôm xanh (Macrobrachium rosenbergii)” tiến hành Trung tâm Quốc gia Quan trắc, Cảnh báo Mơi trường Phòng ngừa Dịch bệnh Thủy sản Khu vực Nam Bộ thuộc Viện Nghiên cứu NTTS II, thời gian từ 02/01/2010 đến 30/12/2010 Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên nhằm xác định khả truyền dọc truyền ngang MrNV XSV TCX TCX bố mẹ tiêm dịch chiết virus nuôi đẻ trứng ấp nở ấu trùng Sau thu mẫu bố mẹ, trứng, ấu trùng để kiểm tra MrNV XSV Ngoài ra, thí nghiệm lây nhiễm MrNV XSV từ cá thể nhiễm virus, từ mơi trường nước có ngâm dịch virus từ Artemia nhiễm virus sang cá thể khỏe mạnh thực Các phương pháp Mô bệnh học, RTPCR RT real-time PCR sử dụng đề tài số liệu xử lý phần mềm SPSS 16.0 Excell 2003 Kết nghiên cứu cho thấy trại giống thực nghiệm, MrNV XSV không truyền trực tiếp từ TCX bố mẹ sang ấu trùng mà ấu trùng nhiễm virus từ TCX bố mẹ thông qua môi trường nước Dịch chiết MrNV XSV ngâm nước sau 72 khơng khả gây bệnh đục PL Sau ngày với tỷ lệ 1% PL nhiễm MrNV XSV lây nhiễm MrNV XSV cho cá thể khác quần đàn Artemia vector lây nhiễm MrNV XSV gây bệnh đục ấu trùng TCX vi ABSTRACT The title “Studying on the transmission of Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and extra small virus (XSV) which caused whitish muscle disease in larvae and post larvae of Macrobrachium rosenbergii” was carried out in Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment & Epidemic – Research Institute for Aquaculture No.2, from 02/01/2010 to 30/12/2010 The experiments were completely random designed (CRD) to determine the possibility of vertical and horizontal transmission of MrNV and XSV in M rosenbergii Prawn broodstock were infected by intramuscular injection of MrNV and XSV They were maintained in fiberglass tanks until they spawned and the eggs hatched After that, broodstock, eggs and larvae were sampled to analyze MrNV and XSV In addition, experimental pathogenicity of MrNV and XSV from infected PL, infected cultured water and infected Artemia to healthy PL were carried out Reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RT-PCR), RT real-time PCR and histopathology methods were used in this study The data was analyzed by the software SPSS 16.0 and by the Excell 2003 The results revealed that in the hatcheries as well as in the experimental lab, MrNV and XSV not transmit directly from broodstock to larvae but larvae is infected from the broodstock through cultured water The viral inoculum which is immersed in the water after 72 hours is imposible to cause whitish muscle disease in PL The rate 1% infected PL can infect in the heathy PL population at day postinfection Artemia is possible a vector that transmites MrNV and XSV horizontally in M.rosenbergii PL vii MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG Trang tựa Trang chuẩn y i Lý lịch cá nhân ii Lời cam đoan iii Cảm tạ iv Tóm tắt v Abstract vi Mục lục vii Danh mục chữ viết tắt x Danh mục bảng xi Danh mục hình xii Danh mục sơ đồ xiv MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Đối tượng nghiên cứu 2 TỔNG QUAN 2.1.Tổng quan tôm xanh 2.1.1 Phân loại 2.1.2 Hình thái 2.1.3 Phân bố 2.1.4 Vòng đời tập tính 2.1.5 Đặc điểm sinh sản 2.1.6 Một số bệnh virus tôm xanh viii 2.2 Bệnh đục tôm xanh 2.2.1 Lịch sử phát bệnh 2.2.2 Sinh học virus MrNV XSV 2.2.3 Sự truyền lây 12 2.2.4 Dấu hiệu bệnh đục 14 2.3 Các phương pháp nghiên cứu bệnh đục ấu trùng TCX 15 2.3.1 Phương pháp mô học truyền thống 15 2.3.2 Phương pháp PCR 17 2.3.3 Phương pháp real-time PCR 19 2.3.4 Phương pháp lai Dot-blot 22 2.3.5 Phương pháp ELISA 23 2.3.6 Phương pháp lai chỗ (ISH) 24 2.3.7 Phương pháp LAMP 24 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 3.1 Nội dung nghiên cứu 26 3.2 Thời gian địa điểm thực 26 3.2.1 Thời gian 26 3.2.2 Địa điểm thực 26 3.3 Phương pháp nghiên cứu 27 3.3.1 Vật liệu nghiên cứu 27 3.3.2 Phương pháp tiến hành 27 3.3.2.1 Phương pháp thu bảo quản mẫu 27 3.3.2.2 Phương pháp tách chiết RNA tổng số 27 3.3.2.3 Phương pháp tách chiết dịch virus MrNV XSV 28 3.3.2.4 Phương pháp mô bệnh học 29 3.3.2.5 Phương pháp RT-PCR 32 3.3.2.6 Phương pháp RT real-time PCR 34 3.3.2.7 Phương pháp xác định độc lực virus (LD50 SID50) 37 3.3.2.8 Phương pháp xử lý số liệu 38 ix Phụ lục 3.3: Kết thu trại ĐH AG – đợt TH Mẫu phân tích MrNV XSV MrNV XSV (-) (-) (-) (+) Trứng, màng trứng (-) (-) (-) (+) Ấu trùng giai đoạn (-) (-) (-) (-) Ấu trùng giai đoạn (-) (-) (-) (-) Âu trùng giai đoạn (-) (-) (-) (-) Tôm PL (-) (-) (-) (-) Tôm mẹ (Cơ, mang, chân bơi) Tổng số TH Ghi chú: TH 7 (+): có virus; (–): khơng có virus TH: trường hợp Phụ lục 3.4: Kết mẫu thu trại Lấp Vò – Đồng Tháp – đợt Mẫu TH phân tích MrNV XSV Tôm mẹ Ghi chú: (Cơ, mang, chân bơi) (-) (-) Trứng, màng trứng (-) (-) Ấu trùng giai đoạn (-) (-) Ấu trùng giai đoạn (-) (-) Âu trùng giai đoạn (-) (-) Tôm PL (-) (-) Tổng số TH (+): có virus; (–): khơng có virus TH: trường hợp 93 PHỤ LỤC 4: SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM XÁC ĐỊNH LD50 Phụ lục 4.1: Kết PL chết tích lũy thí nghiệm xác định LD50 Nồng độ virus Số TT bể TN (n=50) (n=50) 100 (n=50) Số tôm chết TB (n=50) (n=50) 10-1 (n=50) Số tôm chết TB (n=50) (n=50) 10-2 (n=50) Số tôm chết TB (n=50) (n=50) 10-3 (n=50) Số tôm chết TB (n=50) (n=50) ĐC (n=50) Số tôm chết TB (24g) 1,67 2,33 2,33 2,00 1,67 (48g) 4 3,67 5 4,00 5 3,67 3,00 2,67 Ngày thí nghiệm (72g) (96g) (120g) (144g) (168g) 15 26 29 35 16 28 32 38 15 26 30 32 7,33 15,33 26,67 30,33 35,00 14 23 26 32 15 25 30 38 10 21 24 31 7,00 13,00 23,00 26,67 33,67 13 23 28 33 10 25 29 30 16 20 32 5,67 10,33 21,33 25,67 31,67 12 16 18 20 13 20 25 10 15 20 4,00 6,67 13,00 17,67 21,67 7 10 10 11 8 10 3,67 5,00 7,33 8,33 9,67 Phụ lục 4.2: Kết phân tích số liệu PL chết sau 120 TN xác định LD50 94 ANOVA Sum of Squares Sau 120g Between (Combined) Groups Linear Term df Mean Square F Sig 748,933 187,233 21,771 ,000 Contrast 710,533 710,533 82,620 ,000 Deviation 38,400 12,800 86,000 10 8,600 834,933 14 Within Groups Total 1,488 ,277 Multiple Comparisons LSD Dependent 95% Confidence Interval Mean Difference Variable (I) LoTN (J) LoTN Sau 120g Lo GN 10^0 Lo GN 10^-1 3,667 2,394 ,157 Lo GN 10^-2 5,333 2,394 ,050 Lo GN 10^-3 13,667 * 2,394 ,000 8,33 19,00 Lo DC 19,333* 2,394 ,000 14,00 24,67 Lo GN 10^-2 2,000 2,201 ,385 -2,90 6,90 Lo GN 10^-3 12,000 * 2,201 ,000 7,10 16,90 Lo DC 24,000 * 2,201 ,000 19,10 28,90 Lo GN 10^-3 10,000* 2,201 ,001 5,10 14,90 Lo DC 22,000* 2,201 ,000 17,10 26,90 Lo GN 10^-3 Lo DC * 2,201 ,000 7,10 16,90 Lo DC Lo GN 10^0 -19,333* 2,394 ,000 -24,67 -14,00 Lo GN 10^-1 -15,667* 2,394 ,000 -21,00 -10,33 Lo GN 10^-2 * 2,394 ,000 -19,34 -8,66 -5,667* 2,394 ,040 -11,00 -,33 Lo GN 10^-1 Lo GN 10^-2 (I-J) Std Error 12,000 -14,000 Lo GN 10^-3 * The mean difference is significant at the 0,05 level 95 Sig Lower Bound Upper Bound -1,67 ,00 9,00 10,67 Phụ lục 4.3: Kết phân tích số liệu PL chết sau 144 TN xác định LD50 ANOVA Sum of Squares Sau 144g df Mean Square F Sig Between (Combined) 929,600 232,400 26,015 ,000 Groups Linear Term Contrast 842,700 842,700 94,332 ,000 86,900 28,967 89,333 10 8,933 1018,933 14 Deviation Within Groups Total 3,243 ,069 Multiple Comparisons LSD Dependent 95% Confidence Interval Mean Difference Variable (I) LoTN (J) LoTN (I-J) Sau 144g Lo GN 10^0 Lo GN 10^-1 3,667 2,440 ,164 -1,77 9,10 Lo GN 10^-2 4,667 2,440 ,085 -,77 10,10 Lo GN 10^-3 12,667* 2,440 ,000 7,23 18,10 * 2,440 ,000 16,56 27,44 Lo GN 10^-2 1,000 2,440 ,691 -4,44 6,44 Lo GN 10^-3 9,000* 2,440 ,004 3,56 14,44 * 2,440 ,000 12,90 23,77 8,000* 2,440 ,008 2,56 13,44 Lo DC 17,333* 2,440 ,000 11,90 22,77 Lo DC 9,333* 2,440 ,003 3,90 14,77 Lo GN 10^0 -22,000 * 2,440 ,000 -27,44 -16,56 Lo GN 10^-1 -18,333* 2,440 ,000 -23,77 -12,90 Lo GN 10^-2 -17,333* 2,440 ,000 -22,77 -11,90 Lo GN 10^-3 * 2,440 ,003 -14,77 -3,90 Lo DC Lo GN 10^-1 22,000 Lo DC Lo GN 10^-2 Lo GN 10^-3 Lo DC Std Error 18,333 Lo GN 10^-3 -9,333 * The mean difference is significant at the 0.05 level 96 Sig Lower Bound Upper Bound PHỤ LỤC 5: SỐ LIỆU THU ĐƯỢC TRONG THÍ NGHIỆM SID50 Phụ lục 5.1: Số tơm nhiễm MrNV XSV lô TN theo (n = 15) Lô TN 100 Số tôm nhiễm theo TN Bể TN 72 96 120 15 15 15 15 15 15 8,33 15,00 15,00 12 MrNV XSV MrNV XSV MrNV XSV (+) (++) (+) (+++) (++) (+++ (+) (++) (+) (+++) (++) (+++ (+++) (++) (+++ 14 (-) (+) (+) (++) (+) (+++ 12 13 (-) (+) (+) (++) (+) (+++ 13 15 (-) (+) (+) (++) (+) (+++ 6,33 12,33 14,00 10 (-) (+) (-) (+) (+) (++) 10 (-) (+) (-) (+) (+) (++) 11 10 (-) (+) (-) (+) (+) (++) 3,67 9,67 10,00 8 (-) (+) (-) (+) (-) (+) 7 (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) 2,33 7,00 7,33 0 (-) (-) (-) (-) (-) (-) 0 (-) (-) (-) (-) (-) (-) 0 (-) (-) (-) (-) (-) (-) 0,00 0,00 0,00 Số tôm nhiễm TB ĐC 120 (+) Số tôm nhiễm TB 10-3 96 (++) Số tôm nhiễm TB 10-2 72 (+) Sô tôm nhiễm TB 10-1 Cường độ nhiễm theo TN Số tôm nhiễm TB 97 Phụ lục 5.2: Kết xử lý thống kê số liệu PL nhiễm sau 96 TN SID50 ANOVA Sum of Squares Sau 96 gio Between (Combined) Groups Linear Term df Mean Square F Sig 400,933 100,233 250,583 ,000 Contrast 381,633 381,633 954,083 ,000 Deviation 19,300 6,433 16,083 ,000 4,000 10 ,400 404,933 14 Within Groups Total Multiple Comparisons LSD Dependent Variable Sau 96 gio 95% Confidence Interval Mean Difference (I) LoTN Lo 10 Lo 10 -1 Lo 10-2 Lo 10 -3 Lo ĐC (J) LoTN (I-J) Std Error Sig Lower Bound Upper Bound -1 * 2,667 ,516 ,000 1,52 3,82 Lo 10-2 5,333* ,516 ,000 4,18 6,48 Lo 10-3 8,333* ,516 ,000 7,18 9,48 Lo ĐC * 15,000 ,516 ,000 13,85 16,15 Lo 10-2 2,667* ,516 ,000 1,52 3,82 Lo 10-3 5,667* ,516 ,000 4,52 6,82 Lo ĐC * Lo 10 ,000 11,18 13,48 -3 * 3,000 ,516 ,000 1,85 4,15 Lo ĐC 9,667* ,516 ,000 8,52 10,82 Lo ĐC 6,667* ,516 ,000 5,52 7,82 * -15,000 ,516 ,000 -16,15 -13,85 Lo 10-1 -12,333* ,516 ,000 -13,48 -11,18 Lo 10-2 -9,667* ,516 ,000 -10,82 -8,52 ,000 -7,82 -5,52 Lo 10 Lo 10 Lo 10 -3 12,333 ,516 * -6,667 ,516 * The mean difference is significant at the 0,05 level 98 Phụ lục 5.3: Kết xử lý thống kê số liệu PL nhiễm sau 120 TN SID50 ANOVA Sum of Squares sau120g Between (Combined) Groups Linear Term df Mean Square F Sig 435,067 108,767 326,300 ,000 Contrast 403,333 403,333 1,210E3 ,000 Deviation 31,733 10,578 31,733 ,000 3,333 10 ,333 438,400 14 Within Groups Total Multiple Comparisons LSD Dependent Variable sau120g 95% Confidence Interval Mean Difference (I) LoTN Lo 10 Lo 10 -1 Lo 10-2 Lo 10 -3 Lo ĐC (J) LoTN (I-J) Std Error Sig Lower Bound Upper Bound -1 1,000 ,471 ,060 -,05 2,05 Lo 10-2 5,333* ,471 ,000 4,28 6,38 Lo 10-3 7,667* ,471 ,000 6,62 8,72 Lo ĐC * 15,000 ,471 ,000 13,95 16,05 Lo 10-2 4,333* ,471 ,000 3,28 5,38 Lo 10-3 6,667* ,471 ,000 5,62 7,72 Lo ĐC * Lo 10 ,000 12,95 15,05 -3 * 2,333 ,471 ,001 1,28 3,38 Lo ĐC 9,667* ,471 ,000 8,62 10,72 Lo ĐC 7,333* ,471 ,000 6,28 8,38 * -15,000 ,471 ,000 -16,05 -13,95 Lo 10-1 -14,000* ,471 ,000 -15,05 -12,95 Lo 10-2 -9,667* ,471 ,000 -10,72 -8,62 ,000 -8,38 -6,28 Lo 10 Lo 10 Lo 10 -3 14,000 ,471 * -7,333 ,471 * The mean difference is significant at the 0,05 level 99 PHỤ LỤC 6: SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM LÂY NHIỄM MrNV VÀ XSV SANG PL TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC THEO THỜI GIAN Phụ lục 6.1: Số liệu PL chết tích lũy TN (n=100) Lơ TN Lơ ĐC Bể TN Tỷ lệ chết TB (%) Lô Tỷ lệ chết TB (%) Lô Tỷ lệ chết TB (%) Lô Tỷ lệ chết TB (%) Lô 24 Tỷ lệ chết TB (%) Lô 48 Tỷ lệ chết TB (%) Lô 72 Tỷ lệ chết TB (%) Ngày Ngày Ngày Ngày 8 2,00 3,33 6,33 8,00 24 50 53 63 21 51 55 66 25 51 53 65 23,33 50,67 53,67 64,67 24 50 55 60 23 45 58 61 23 46 59 60 23,33 47,00 57,33 60,33 20 26 32 50 15 30 40 55 18 30 38 52 17,67 28,67 36,67 52,33 15 20 30 36 12 21 35 40 13 20 33 40 13,33 20,33 32,67 38,67 14 18 20 30 14 15 21 29 15 20 24 30 14,33 17,67 21,67 29,67 3 2,33 3,00 5,67 8,00 Ngày 11 Ngày 13 Ngày 15 10 10 11 11 10 10 8,67 10,00 10,33 72 89 100 73 89 99 75 90 100 73,33 89,33 99,67 70 85 98 70 84 97 68 85 98 69,33 84,67 97,67 53 65 70 56 68 73 55 70 75 54,67 67,67 72,67 38 45 55 40 44 51 42 46 50 40,00 45,00 52,00 31 40 43 32 39 44 33 40 44 32,00 39,67 43,67 10 10 11 11 10 12 12 9,33 10,67 11,00 Phụ lục 6.2: Kết xử lý thống kê số liệu PL chết sau 15 ngày TN 100 ANOVA Sum of Squares Ngay15 Between (Combined) Groups Linear Term Contrast Deviation Within Groups Total 101 df Mean Square F Sig 24586,952 4097,825 1,831E3 ,000 2596,298 2596,298 1,160E3 ,000 21990,655 4398,131 1,965E3 ,000 31,333 14 2,238 24618,286 20 Multiple Comparisons LSD Dependent 95% Confidence Interval Mean Difference Variable (I) LoTN (J) LoTN Ngay15 Lo DC Lo gio -89,333* 1,222 ,000 -91,95 -86,71 Lo gio -87,333 * 1,222 ,000 -89,95 -84,71 Lo gio -62,333 * 1,222 ,000 -64,95 -59,71 Lo 24 gio -41,667* 1,222 ,000 -44,29 -39,05 Lo 48 gio -33,333* 1,222 ,000 -35,95 -30,71 Lo 72 gio -,667 1,222 ,594 -3,29 1,95 Lo gio 2,000 1,222 ,124 -,62 4,62 Lo gio 27,000* 1,222 ,000 24,38 29,62 Lo 24 gio 47,667 * 1,222 ,000 45,05 50,29 Lo 48 gio 56,000* 1,222 ,000 53,38 58,62 Lo 72 gio 88,667* 1,222 ,000 86,05 91,29 Lo gio 25,000* 1,222 ,000 22,38 27,62 Lo 24 gio 45,667 * 1,222 ,000 43,05 48,29 Lo 48 gio 54,000* 1,222 ,000 51,38 56,62 Lo 72 gio 86,667* 1,222 ,000 84,05 89,29 Lo 24 gio 20,667 * 1,222 ,000 18,05 23,29 Lo 48 gio 29,000* 1,222 ,000 26,38 31,62 Lo 72 gio 61,667* 1,222 ,000 59,05 64,29 Lo 48 gio 8,333 * 1,222 ,000 5,71 10,95 Lo 72 gio 41,000* 1,222 ,000 38,38 43,62 Lo 72 gio 32,667* 1,222 ,000 30,05 35,29 Lo gio Lo gio Lo gio Lo 24 gio Lo 48 gio (I-J) Std Error * The mean difference is significant at the 0,05 level 102 Sig Lower Bound Upper Bound Phụ lục 6.3: Kết định lượng tương đối hàm lượng cDNA MrNV XSV TN lây nhiễm MrNV XSV sang PL môi trường nước Mẫu Gen Chu kì ngưỡng IP[MrNV] IP[XSV] C(t) giờ 24 48 72 MrNV 17,14 XSV 16,12 Deca 29,32 MrNV 25,22 XSV 23,65 Deca 35,26 MrNV 27,51 XSV 25,06 Deca 31,73 MrNV 32,87 XSV 25,12 Deca 34,01 58,46 54,98 71,52 67,07 86,70 73,86 96,65 78,98 MrNV ND XSV Deca ND 31,95 Ghi chú: ND: không phát Deca: gen tham chiếu có gen tơm IP[MrNV]: tỉ lệ % Ct[MrNV]/Ct[Deca] IP[XSV]: tỉ lệ % Ct[XSV]/Ct[Deca] 103 PHỤ LỤC 7: SỐ LIỆU THU ĐƯỢC TRONG THÍ NGHIỆM PL NHIỄM MrNV XSV SANG PL KHỎE MẠNH Phụ lục 7.1: Số liệu PL chết tích lũy TN (n=100) Lô TN Bể TN Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày 11 Ngày 13 Ngày 15 5 6 Lô ĐC 2 4 (-) 4 5 Tỷ lệ chết TB (%) 2,00 3,33 4,33 4,67 5,33 6,33 8,3 12 22 32 58 64 66 Lô 1% 10 20 28 57 62 65 21 30 60 63 65 Tỷ lệ chết TB (%) 10,33 21,00 30,00 58,33 63,00 65,33 67,3 10 25 30 62 65 68 Lô 5% 14 24 28 60 64 70 10 25 30 60 64 69 Tỷ lệ chết TB (%) 12,67 24,67 29,33 60,67 64,33 69,00 74,3 18 36 48 78 82 86 Lô 20 40 48 78 82 85 10% 15 38 46 76 81 85 Tỷ lệ chết TB (%) 17,67 38,00 47,33 77,33 81,67 85,33 88,3 20 38 50 96 100 100 10 Lô 15 36 49 96 100 100 10 20% 21 40 50 97 100 100 10 Tỷ lệ chết TB (%) 18,67 38,00 49,67 96,33 100,00 100,00 100,0 30 60 100 100 100 100 10 Lô ĐC 30 59 100 100 100 100 10 (+) 27 60 100 100 100 100 10 Tỷ lệ chết TB (%) 29,00 59,67 100,00 100,00 100,00 100,00 100,0 104 Phụ lục 7.2: Kết phân tích số liệu PL chết TN PL nhiễm MrNV XSV sang PL khỏe mạnh ANOVA Sum of Squares Ngay15 Between Groups Mean Square 17726,278 3545,256 4,667 12 ,389 17730,944 17 Within Groups Total df F Sig 9,116E3 ,000 Multiple Comparisons LSD Dependent 95% Confidence Interval Mean Difference Variable (I) LoTN (J) LoTN (I-J) Ngay15 Lo DC (-) Lo 1% -59,000* ,509 ,000 -60,11 -57,89 Lo 5% -66,000* ,509 Lo 10% Lo 1% Lo 5% Std Error Sig Lower Bound Upper Bound ,000 -67,11 -64,89 * ,000 -81,11 -78,89 * -80,000 ,509 Lo 20% -91,667 ,509 ,000 -92,78 -90,56 Lo DC (+) -91,667* ,509 ,000 -92,78 -90,56 -7,000* ,509 ,000 -8,11 -5,89 Lo 5% * Lo 10% -21,000 ,509 ,000 -22,11 -19,89 Lo 20% -32,667* ,509 ,000 -33,78 -31,56 Lo 10% -14,000* ,509 ,000 -15,11 -12,89 * Lo 20% -25,667 ,509 ,000 -26,78 -24,56 Lo 10% Lo 20% -11,667* ,509 ,000 -12,78 -10,56 Lo DC Lo DC (-) 91,667* ,509 ,000 90,56 92,78 (+) Lo 1% 32,667* ,509 ,000 31,56 33,78 * Lo 5% 25,667 ,509 ,000 24,56 26,78 Lo 10% 11,667* ,509 ,000 10,56 12,78 -1,11 1,11 Lo 20% ,000 ,509 * The mean difference is significant at the 0,05 level 105 1,000 PHỤ LỤC 8: SỐ LIỆU THU ĐƯỢC TRONG THÍ NGHIỆM PL KHỎE MẠNH ĂN ARTEMIA NHIỄM MrNV XSV Phụ lục 8.1: Số liệu PL chết tích lũy TN PL khỏe mạnh ăn Artemia nhiễm MrNV XSV (n=100) Lô TN Bể TN Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày 11 Ngày 13 10 10 11 11 10 11 11 12 13 Lô ĐC 10 12 12 Tỷ lệ chết TB (%) 4,00 8,67 10,00 10,30 11,70 12,00 32 38 58 70 84 85 Lô TN 30 38 60 71 87 90 30 38 58 71 85 88 Tỷ lệ chết TB (%) 30,67 38,00 58,67 70,67 85,33 87,67 Ghi chú: Lô ĐC: PL ăn Artemia không nhiễm virus Lô TN: PL ăn Artemia nhiễm virus Phụ lục 8.2: Kết định lượng tương đối hàm lượng cDNA MrNV XSV TN PL khỏe mạnh ăn Artemia nhiễm MrNV XSV Mẫu Gen Chu kì IP[MrNV] IP[XSV] ngưỡng (Ct) Artemia gây MrNV 26,43 nhiễm sau XSV 25,95 ngày Deca 30,51 PL ăn Artemia MrNV 25,12 XSV 19,31 Deca 32,04 Ghi chú: Deca: gen tham chiếu có mẫu IP[MrNV]: tỉ lệ % Ct[MrNV]/Ct[Deca] IP[XSV]: tỉ lệ % Ct[XSV]/Ct[Deca] 106 86,62 85,05 78,40 60,26 Ngày 11 13 12 12,0 85 91 88 88,0 Phụ lục 8.3: Kết phân tích số liệu PL chết thí nghiệm PL khỏe mạnh ăn Artemia nhiễm MrNV XSV sau 15 ngày kết thúc TN ANOVA Sum of Squares Ngay15 Between Groups Within Groups Total df Mean Square 8664,000 8664,000 20,000 5,000 8684,000 F Sig 1,733E3 ,000 Paired Samples Test Paired Differences 95% Confidence Interval Std Error Mean Pair Lô TN - Lô DC 76,000 Std Deviation 2,000 107 Mean 1,155 of the Difference Lower 71,032 Upper 80,968 Sig (2t 65,818 df tailed) ,000 ... Complementary deoxyribonucleic acid Da : Dalton DEPC : Diethyl Pyrocacbonat DIG : Digoxigenin DNA : Deoxyribonucleic Acid ĐBSCL : Đồng sông Cửu Long ĐC : Đối chứng ĐT : Đồng Tháp EtBr : Ethidium... vector that transmites MrNV and XSV horizontally in M.rosenbergii PL vii MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG Trang tựa Trang chuẩn y i Lý lịch cá nhân ii Lời cam đoan iii Cảm... after 72 hours is imposible to cause whitish muscle disease in PL The rate 1% infected PL can infect in the heathy PL population at day postinfection Artemia is possible a vector that transmites