Xác định tác nhân gây bệnh đục thân trên ấu trùng tôm càng xanh (macrobrachium rosenbergii) và vị trí nhiễm của mầm bệnh

Đại Học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN DOÃN DUẨN XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỤC THÂN TRÊN ẤU TRÙNG TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii) VÀ VỊ TRÍ NHIỄM CỦA MẦM BỆNH Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 12 năm 2008 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH Cán hướng dẫn khoa học : TS LÝ THỊ THANH LOAN Cán chấm nhận xét : Cán chấm nhận xét : Luận văn thạc sĩ bảo vệ HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày tháng năm TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA PHÒNG ĐÀO TẠO SĐH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM ĐỘC LẬP – TỰ DO – HẠNH PHÚC Tp HCM, ngày tháng năm 2008 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Nguyễn Doãn Duẩn Phái: Nam Ngày, tháng, năm sinh: 18/08/1981 Nơi sinh: Hà Tĩnh Chuyên ngành: Công nghệ sinh học MSHV: 03106667 I- TÊN ĐỀ TÀI: XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỤC THÂN TRÊN ẤU TRÙNG TƠM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii) VÀ VỊ TRÍ NHIỄM CỦA MẦM BỆNH II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: – Xác định tác nhân gây bệnh đục thân ấu trùng TCX – Xác định vị trí có diện mầm bệnh ấu trùng TCX bị bệnh đục thân III- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 21/01/2008 IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : 15/10/2008 V- CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : TS LÝ THỊ THANH LOAN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CN BỘ MÔN QL CHUYÊN NGÀNH TS LÝ THỊ THANH LOAN Nội dung đề cương luận văn thạc sĩ Hội đồng chuyên ngành thông qua Ngày TRƯỞNG PHÒNG ĐT – SĐH tháng năm TRƯỞNG KHOA QL NGÀNH LỜI CẢM ƠN Trân trọng cảm ơn thầy trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh truyền đạt cho kiến thức quý báu suốt thời gian học tập trường Chân thành cảm ơn TS Lý Thị Thanh Loan tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện giúp tơi hồn thành luận văn Xin cảm ơn anh Đoàn Văn Cường anh chị Trung tâm Quốc gia quan trắc cảnh báo mơi trường phịng ngừa dịch bệnh thủy sản Nam Bộ, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi q trình thực luận văn Cảm ơn anh chị bạn học viên cao học ngành Công nghệ sinh học, trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh giúp đỡ truyền đạt cho kinh nghiệm kiến thức thời gian học tập i TÓM TẮT Nghề nuôi TCX phải đối mặt với thiệt hại kinh tế bệnh đục thân gây giai đoạn ấu trùng Ấu trùng bị bệnh có tượng bị trắng đục sữa, tỉ lệ chết đến 100% Tác nhân gây bệnh xác định Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) Extra small virus (XSV) Các phương pháp mô bệnh học, RT-PCR kỹ thuật lai chỗ (In situ hybridization) sử dụng nghiên cứu Thí nghiệm cảm nhiễm thực phương pháp ngâm, ấu trùng thí nghiệm xuất dấu hiệu bị đục thân, tỉ lệ tử vong sau 22 ngày 63% Kết kiểm tra phương pháp RT-PCR phát đồng thời MrNV XSV ấu trùng bị đục thân Nghiên cứu kỹ thuật lai chỗ ghi nhận vị trí nhiễm MrNV XSV mô cơ, chân bơi quan gan tụy Kết nghiên cứu đề tài xác định MrNV XSV tác nhân gây bệnh đục thân ấu trùng TCX ii ABSTRACT Giant freshwater prawn (Macrobrachium rosenbergii) culture is facing important economic losses attributed to white tail disease which affects larvae and post-larvae The clinical sign of this disease is an opaque whitish appearance of the muscles The mortality may reach 100% in some hatcheries The causative agents have been identified as Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and extra small virus (XSV) by previous studies Histopathology, RT-PCR and in situ hybridization were used for studying The experimental pathogenicity of MrNV XSV to healthy post-larvae of M rosenbergii was carried out by immersion challange, the viral inoculum caused 63% mortality at 22 days post-infection, opaque whitish muscle was observed in experimental post-larvae RT-PCR assay ravealed the presence of both viruses in opaque whitish post-larvae The nonradioactive DNA probes were used to successfully detect MrNV and XSV infection in the muscle tissues, pleopods and hepatopancreas by in situ hybridization The results of study confirm the causative agents of this disease are MrNV and XSV iii MỤC LỤC TÓM TẮT i ABSTRACT ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT viii MỞ ĐẦU Phần TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan tôm xanh .3 1.1.1 Phân loại hình thái 1.1.2 Vịng đời tơm xanh 1.1.3 Sự phân bố 1.1.4 Đặc điểm phát triển ấu trùng 1.2 Một số bệnh tôm xanh 1.2.1 Các bệnh virus 1.2.2 Các bệnh vi khuẩn 1.2.3 Bệnh Ricketsia 1.2.4 Bệnh nấm 1.2.5 Bệnh động vật nguyên sinh 1.2.6 Một số bệnh chưa xác định rõ tác nhân gây bệnh .8 1.3 Bệnh đục thân tôm xanh .8 1.3.1 Lịch sử phát bệnh 1.3.2 Dấu hiệu bệnh đục thân 1.3.3 Tác nhân gây bệnh 1.4 Các phương pháp nghiên cứu bệnh đục thân tôm xanh .10 1.4.1 Phương pháp nghiên cứu mô bệnh học .11 1.4.2 Phương pháp RT-PCR 13 1.4.3 Phương pháp lai Dot-blot 15 1.4.4 Phương pháp ELISA 16 1.4.5 Phương pháp lai chỗ 17 1.5 Các nghiên cứu nước nước .21 1.5.1 Các nghiên cứu nước 21 1.5.2 Các nghiên cứu nước .21 Phần VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Vật liệu .24 2.1.1 Mẫu tôm 24 2.1.2 Thang DNA .24 2.1.3 Mồi 25 2.1.4 Bộ kit tổng hợp đánh dấu mẫu dò 25 2.1.5 Bộ kit tách chiết tinh DNA từ gel agarose .26 iv 2.2 Phương pháp .26 2.2.1 Thu bảo quản mẫu 27 2.2.2 Tách chiết RNA tổng số 28 2.2.3 Phương pháp tách chiết dịch virus MrNV XSV 29 2.2.4 Bố trí thí nghiệm cảm nhiễm 30 2.2.5 Phương pháp mô bệnh học 32 2.2.6 Phương pháp RT-PCR điện di gel agarose .34 2.2.7 Phương pháp tổng hợp đánh dấu mẫu dò .36 2.2.8 Phương pháp tinh mẫu dò từ gel agarose 38 2.2.9 Phương pháp lai chỗ 39 Phần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 3.1 Kết kiểm tra MrNV với kỹ thuật RT-PCR 43 3.2 Kết khảo sát mô bệnh học 46 3.3 Kết thí nghiệm cảm nhiễm 49 3.4 Kết phát mầm bệnh với kỹ thuật lai chỗ .54 3.4.1 Kết tổng hợp đánh dấu mẫu dò cho MrNV XSV .54 3.4.2 Kết phát MrNV XSV phương pháp lai chỗ .56 Phần KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 62 4.1 KẾT LUẬN 62 4.2 ĐỀ NGHỊ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO .63 Phần tiếng Việt 63 Phần tiếng Anh 64 v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Các cặp mồi sử dụng để phát MrNV RT-PCR 25 Bảng 3.1: Kết kiểm tra MrNV XSV 36 mẫu TCX RT-PCR 45 Bảng 3.2: So sánh kết khảo sát phương pháp mô bệnh học ấu trùng TCX bị đục thân với tác giả khác .48 Bảng 3.3: Bảng theo dõi kết thí nghiệm cảm nhiễm 52 Bảng 3.4: Kết kiểm tra MrNV XSV kỹ thuật RT-PCR ấu trùng TCX thí nghiệm cảm nhiễm .54 Bảng 3.5: So sánh kết xác định vị trí lây nhiễm MrNV ấu trùng TCX với tác giả khác 59 Bảng 3.6: So sánh kết lai chỗ MrNV XSV 61 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cấu tạo M rosenbergii Hình 1.2: Tơm xanh có dấu hiệu bị bệnh đục thân Hình 1.3: Ảnh chụp kính hiển vi điện tử MrNV XSV 10 Hình 1.4: Đặc điểm mô học TCX bị nhiễm bệnh đục thân 13 Hình 1.5: Phát MrNV kỹ thuật lai Dot-blot 16 Hình 1.6: Kết lai chỗ mơ TCX bị nhiễm MrNV 20 Hình 2.1: Thang DNA 100 gel agarose 2% 24 Hình 3.1: Kết kiểm tra MrNV XSV RT-PCR 43 Hình 3.2: Các thay đổi mơ bệnh học mô ấu trùng TCX bị đục thân 46 Hình 3.3: Đặc điểm mô bệnh học quan gan tụy ấu trùng TCX 47 Hình 3.4: Ấu trùng TCX bị bệnh đục thân thí nghiệm cảm nhiễm .50 Hình 3.5: Tỉ lệ PL chết thí nghiệm cảm nhiễm MrNV XSV 51 Hình 3.6: Kết RT-PCR MrNV XSV PL cảm nhiễm 53 Hình 3.7: Kết đánh dấu mẫu dò cho MrNV XSV 55 Hình 3.8: Phản ứng oxi hóa-khử tạo kết tủa màu xanh dương phương pháp lai chỗ 56 Hình 3.9: Kết lai chỗ với mẫu dò đặc hiệu cho MrNV gan tụy 57 Hình 3.10: Lai chỗ với mẫu dị đặc hiệu cho MrNV mơ chân bơi 58 Hình 3.11: Kết lai chỗ với mẫu dò đặc hiệu cho XSV .60 64 13 Trần Văn Vỹ (chủ biên), Phạm Văn Trang, Nguyễn Duy Khoát, 1995 Kỹ thuật ni tơm phịng trị bệnh tơm Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội Phần tiếng Anh 14 AGDAFF–NACA, 2007 Aquatic Animal Diseases Signiicant to Asia-Paciic: Identiication Field Guide Australian Government Department of Agriculture, Fisheries and Forestry Canberra 15 Arcier J.M., Herman F., Lightner D.V., Redman R., Mari J., Bonami, J.R., 1999 A viral disease associated with mortalities in the hatchery-reared postlarvae of the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii Dis Aquat Org 38, 177-181 16 Bell T A and Lightner D V., 1988 A handbook of normal penaeid shrimp histology World Aquaculture Society Baton Rouge, LO, USA 17 Bhavan P S., Geraldine P., 2000 Histophathology of the hepatopancreas and gills of the prawn Macrobrachium malcolmsonii exposed to endosulfan Aquatic toxicology 50, 331-339 18 Bonami J.R., Shi Z., Qian D and Widada J.S., 2005 White tail disease of the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii: separation of the associated virions and characterization of MrNV as a new type of nodavirus Journal of Fish Disease 28, 23-31 19 Brown T A., 2001 Gene cloning and DNA analysis Blackwell Science 20 Cheng W and Chen J.-C., 1998 Isolation and characterization of an Enterococcus-like bacterium causing muscle necrosis and mortality in Macrobrachium rosenbergii in Taiwan Diseases of Aquatic Organisms 34, 93101 21 Chia Y Hsieh, Po C Chuang, Li C Chen, Chien Tu, Maw S Chien, Kwo C Huang, Hui F Kao, Ming C Tung, Shinn S Tsai, 2006 Infectious hypodermal 65 and haematopoietic necrosis virus (IHHNV) infections in giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii Aquaculture 258, 73–79 22 Gall J G., Pardue, M L., 1969 Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations Proc Natl Acad Sci USA 63, 378-383 23 Hsieh C.-Y., Wu Z.-B., Tung, Tu C., Lo S.-P., Chang T.-C., Chang C.-D., Chen S.-C., Hsieh Y.-C and Tsai S.-S., 2006a In situ hybridization and RT-PCR detection of Macrobrachium rosenbergii nodavirus in giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii (De Man), in Taiwan Journal of Fish Diseases 29, 665-671 24 Hsieh C Y., Chuang P C., Chen L C., Tu C., Chien M S., Huang K C., Kao H F., Tung M C., Tsai S S., 2006b Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus (IHHNV) infections in giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii Aquaculture 258, pages 73-79 25 Jayaprakash N S., Rejish Kumar V J., Rosamma Philip, Bright Singh I S., 2006 Vibrios associated with Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1879) larvae from three hatcheries on the Indian southwest coast Aquaculture Research 37, 351-358 26 Lightner, D.V., 1996 A Handbook of Shrimp Pathology and Diagnostic Procedures for Diseases of Cultured Penaeid Shrimp World Aquaculture Society Baton Rouge, Louisiana, USA 27 New M B & Valenti W C., 2000 Freshwater prawn culture, the farming of Macrobrachium rosenbergii Blackwell science 28 OIE (2003) Manual of diagnostic test for aquatic animals OIE-Organización Muldial de Sanidad Animal, Paris (France) 29 Pardue, M L., Gall J G., 1969 Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations Proc Natl Acad Sci USA 64, 600-604 66 30 Pillai D., Bonami J-R., Sri Widada J., 2006 Rapid detection of Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and extra small virus (XSV), the pathogenic agents of white tail disease of Macrobrachium rosenbergii (De Man), by loopmediated isothermal amplification Journal of Fish Diseases 29, 275–283 31 Qian D., Shi Z., Zhang S., Cao Z., Liu W., Li L., Xie Y., Cambournac and Bonami J.-R., 2003 Extra small virus-like particles (XSV) and nodavirus associated with whitish muscle disease in the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii Journal of Fish Disease 26, 521-527 32 Qian D., Wen Liu, Wu Jianxiang, Lian Yu, 2006 Preparation of monoclonal antibody against Macrobrachium rosenbergii Nodavirus and application of TAS-ELISA for virus diagnosis in post-larvae hatcheries in east China during 2000–2004 Aquaculture 261,1144–1150 33 Roche applied science, 2002 Nonradioactive In situ hybridization application manual Roche Diagnosticộng GmbH 34 Romestand B., Bonami J.R., 2003 A sandwich enzyme linked immunosorbent assay (S-ELISA) for detection of MrNV in the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii (de Man) Journal of Fish Disease 26, 71-75 35 Sahul Hameed, A.S., Xavier Charles M., Anilkumar M., 2000 Tolerance of Macrobrachium rosenbergii to white spot syndrome virus Aquaculture 183, 207-213 36 Sahul Hameed, A.S., Yoganandhan, K., Sri Widada, J., Bonami, J.R., 2004a Studies on the occurrence and RT-PCR detection of Macrobrachium rosenbergii nodavirus and extra small virus-like particles associated with white tail disease of Macrobrachium rosenbergii in India Aquaculture 238, 127–133 37 Sahul Hameed, A.S., Yoganandhan, K., Sri Widada, J., Bonami, J.R., 2004b Experimental transmission and tissue tropism of Macrobrachiumrosenbergii nodavirus (MrNV) and extra small virus like-particles in Macrobrachium rosenbergii Diseases of Aquatic Organisms 62, 191–196 67 38 Saravana Bhavan P., Geraldine P., 2000 Histopathology of the hepatopancreas and gills of the prawn Macrobrachium malcolmsonii exposed to endosulfan Aquatic Toxicology 50, 331–339 39 Schwarzacher T., Heslop-Harrison P., 2000 Practical in situ hybridization BIOS Scientific Publishers 40 Shekhar M.S., Azad I.S., Jithendran K.P 2006 RT-PCR and sequence analysis of Macrobrachium rosenbergii nodavirus: Indian isolate Aquaculture 252, 128132 41 Sommerset I., Nerland A H., 2004 Complete sequence of RNA1 and subgenomic RNA3 of Atlantic halibut nodavirus (AHNV) Diseases of Aquatic Organisms 58, 117–125 42 Sri Widada, J., Durand, S., Cambournac, Qian,D., Shi,Z.,Dejonghe,E.,Richard, V.,Bonami, J.R., 2003 Genome-based detection methods of Macrobrachium rosenbergii nodavirus, a pathogen of the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii: Dot-blot, in situ hybridization and RT-PCR Journal of Fish Disease 26, 583–590 43 Sri Widada, J., Bonami, J.R., 2004a Characteristicộng of the monocistronic genome of extra small virus, a virus-like particle associated with Macrobrachium rosenbergii nodavirus: possible candidate for a new species of satellite virus J Gen Virol 85, 643–646 44 Sri Widada J., Richard V., Cambournac I., Shi Z., Qian D & Bonami J.R., 2004b Dot-blot hybridization and RT-PCR detection of extra small virus (XSV) associated with white tail disease of prawn Macrobrachium rosenbergii Diseases of Aquatic Organisms 58, 83–87 45 Sudhakaran, R., Yoganandhan, K., Ishaq Ahmed, V.P., Sahul Hameed, A.S., 2006a Artemia as a possible vector for Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and extra small virus transmission (XSV) to Macro- brachium rosenbergii post-larvae Diseases of Aquatic Organisms 70, 161–166 68 46 Sudhakaran R., Syed Musthaq S., Haribabu P., Mukherjee S.C., Gopal C., Sahul Hameed A.S., 2006b Experimental transmission of Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and Extra small virus (XSV) in three species of marine shrimp ( Penaeus indicus, Penaeus japonicus and Penaeus monodon) Aquaculture 257, 136-141 47 Sudhakaran R., Ishaq Ahmed V P., Haribabu P., Mukherjee S C., Widada J S., Bonami J R., and Sahul Hameed., 2007a Experimental vertical transmission of Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and axtra small virus (XSV) from brooders to progeny in Macrobrachium rosenbergii and Artemia Journal of Fish Disease 30, 27-35 48 Sudhakaran R., Parameswaran V., Sahul Hameed A.S., 2007b In vitro replication of Macrobrachium rosenbergii nodavirus and extra small virus in C6/36 mosquito cell line Journal of Virological Methods 146, 112–118 49 Sudhakaran R., Haribabu P., Rajesh Kumar S., Sarathi M., Ishaq Ahmed V P., Sarath Babu V., Venkatesan C., Sahul Hameed A.S., 2008 Natural aquatic insect carriers of Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and extra small virus (XSV) Diseases of Aquatic Organisms 79:141-145 50 Tripathy S., Sahoo P.K., Kumari J., Mishra B.K., Sarangi N., Ayyappan S., 2006 Multiplex RT-PCR detection and sequence comparision of viruses MrNV and XSV associated with white tail disease in Macrobrachium rosenbergii Aquaculture 258, 134-139 51 Tung C W., Wang C S and Chen S N., 1999 Histological and electron microscopy study on Macrobrachium muscle virus (MMV) infection in the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii (de Man), cultured in Taiwan.Journal of Fish Disease 22, 1–5 52 Vijayan K K., Raj V S., Alavandi S V., Sekhar V T and Santiago T C., 2005 Incidence of white muscle disease, a viral like disease associated with mortalities in hatchery-reared postlarvae of the giant freshwater prawn 69 Macrobrachiu rosenbergii (De Man) from the southeast coast of India Aquaculture Research 36, 311-316 53 Wang C S., Chang J S., Shih H H and Chen S N., 2007 RT-PCR amplification and sequence analysis of extra small virus associated with white tail disease of Macrobrachium rosenbergii (de Man) cultured in Taiwan Journal of Fish Disease 30, 127-132 54 Wang C S., Chang J S., Wen C M., Shih H H., Chen S N., 2008 Macrobrachium rosenbergii nodavirus infection in M rosenbergii (de Man) with white tail disease cultured in Taiwan Journal of Fish Diseases 31, 415422 55 Wang P C., Lin Y D., Liaw L L., Chern R S., Chen S C., 2008 Lactococcus lactis subspecies lactis also causes white muscle disease in farmed gian freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii Diseases of Aquatic Organisms, 79, 9-17 56 Widada J S., Durand S., Cambournac L., Quian D., Shi Z., Dejoughe E., Richard V and Bonami J R., 2003 Genome-based detection methods of Macrobrachium rosenbergii nodavirus, a pathogen of the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii: Dot-blot, in situ hybridization and RTPCR Journal of Fish Diseases 26, 583-590 57 Widada J S and Bonami J.-R., 2004 Characteristicộng of the monocistronic genome of extra small virus, a virus-like particle associated with Macrobrachium rosenbergii nodavirus: possible candidate for a new species of satellite virus Journal of General virology 85, 643-646 58 Yoganandhan K., Widada J.S., Bonami J.R and Sahul Hameed A.S., 2005 Simultaneous detection of Macrobrachium rosenbergii nodavirus and extra small virus by a single tube, one-step multiplex RT-PCR assay Journal of Fish Disease 28, 65-69 70 59 Yoganandhan K., Learvibhas M., Sriwongpuk S., Limsuwan C., 2006 White tail disease of the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii in Thailand Diseases of Aquatic Organisms 69, 255-258 60 Zhang H., Wang J., Yuan J., Li L., Zhang J., Bonami J.R & Shi Z (2006) Quantitative relationship of two viruses (MrNV and XSV) in white tail disease of Macrobrachium rosenbergii de Man Diseases of Aquatic Organisms 71, 11– 17 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: Đặc điểm giai đoạn ấu trùng tôm xanh (dẫn theo Nguyễn Thanh Phương, 2003) Giai Ngày đoạn tuổi I Mắt chưa có cuống II Mắt có cuống III 3-4 Xuất chân (Uropod) IV 4-6 Có chủy, chân có hai nhánh, có lơng tơ V 5-8 Telson hẹp kéo dài VI 7-10 Mầm chân bụng xuất VII 11-17 Chân bụng có hai nhánh, chưa có lơng tơ VIII 14-19 Chân bụng có lơng tơ IX 15-22 Nhánh chân bụng có nhánh phụ X 17-24 Có 3-4 chủy XI 19-26 Răng xuất hết nửa chủy Postlarvae 23-27 Đặc điểm Răng xuất chủy, có tập tính tơm lớn PHỤ LỤC 2: Kết phân tích số liệu ấu trùng bị chết thí nghiệm cảm nhiễm phần mềm SPSS 16.0 Paired Samples Test Paired Differences 95% Confidence Interval of the Difference Mean Std Deviation Std Error Mean Lower Upper Sig (2t df tailed) Pair Be1 - Be2 -9.090909090909127E-2 1.044926357152068E0 2.227790478836794E-1 -5.542034832032192E-1 3.723853013850366E-1 -.408 21 687 Pair Be1 - Be3 -2.727272727272729E-1 8.767204620851327E-1 1.869174305601721E-1 -6.614433491411126E-1 1.159888036865667E-1 -1.459 21 159 21 000 357 -.701 21 491 Pair Be1 - dc Pair Be2 - Be3 2.439393939393939E0 2.342129369947353E0 4.993436594702902E-1 -.182 1.216 259 1.400951951882590E0 3.477835926905289E0 4.885 -.721 Pair Be2 - dc 2.530303030303030E0 2.224583882161662E0 4.742828772700111E-1 1.543977792415084E0 3.516628268190976E0 5.335 21 000 Pair Be3 - dc 2.712121212121212E0 2.708590008927124E0 5.774733302169120E-1 1.511199679641181E0 3.913042744601243E0 4.697 21 000 Pair TB3be - dc 2.560606060606061E0 2.356393300347528E0 5.023847396496541E-1 1.515839800650780E0 3.605372320561342E0 5.097 21 000 Pair Tilecn - Tiledc 2.802525252525253E1 2.157896867931830E1 4.600651580645944E0 1.845767380337340E1 3.759283124713165E1 6.092 21 000 PHỤ LỤC 3: DANH MỤC PHA HĨA CHẤT Proteinase K (100µg/ml): 1xPBS Proteinase k 10ml 1xPBS 1mg Proteinase 0.4% Formaldehyde 0.4% Formaldehyde 5.4 ml 37% Formaldehyde DD H2O 495 ml bảo quản 4oC Hybridization Buffer 4x SSC 100 ml 20x SSC 50% Formamide 25 ml 100% Formamide 1x Denhardt 2.5 ML 20X denhardt 5% Dextran Sulfate 10 ml 25x Dextran Sulfate 0.5 mg/ml DNA 2.5 ml 10 mg/ml salmon sperm DNA bảo quản 4oC 20x SSC (sodium chloride/ sodium citrate) Buffer 3M NaCL 175.32g NaCL 0.3M Na citrate 88.23g Na citrate.2H2O DD H2O 900ml pH = 7.0, hấp khử trùng bảo quản 4oC 20x Denhardt Solution 0.4% BSA 0.4 g Bovine Serum Albumin, Fraction V 0.4 % Ficoll 0.4% Ficoll 400 0.4% PVP 360 0.4g Polyvinylpyrolidone 360 DD H2O 100 ml Lọc qua màng 0.45µm bảo quản 4oC 25% Dextran Sulfate 25 % Dextran Sulfate 25 g Dentran Sulfate DD H2O 40 ml Khuyấy dextran sulfate vào nước,phân chia 10ml vào ống tube lớn giữ lạnh -20oC Salmon Sperm DNA (10mg/ml) 10 mg/ml Salmon Sperm DNA 500 mg Salmon Sperm DNA DD H2O 40 ml( ps to 50ml) Thêm từ từ DNA vào nước, tiến hành khuyấy đun nhẹ Làm gãy DNA cách hút bơm qua kim tiêm kích thước 18 gauge.Hấp khử trùng hút 2.5 ml vào tubes nhỏ, bảo quản -20oC 10x Buffer I M Tris – HCL 121.1g Tris Base 1.5 M NaCL 87.7 g NaCL DD H2O 900 ml(qs to 1l) pH=7.5, hấp khử trùng giữ 4oC Buffer II 0.5% Blocking agent 0.5g Blocking Reagent 1x Buffer I 100 ml 1x Buffer I Đun nhẹ khuyấy 30 phút, bảo quản 4oC tuần 10 Buffer III 100mM Tris – HCl 12,11g Tris Base 100mM NaCl 5.84g NaCl DD H2O 990 ml Chỉnh pH đến 9.5 HCl, bổ sung: 50mM MgCl2 Lọc qua màng 0.45µm bảo quản 4oC 10.16g MgCL2.6H2O 11 10x Buffer IV 100mM Tris- HCl 12.10g Tris Base 10mM EDTA 3.72G EDTA.2H2O(disodium salt) DD H2O 990ml (thêm đủ l) Dùng HCl chỉnh pH=8.0, hấp khử trùng bảo quản 4oC 12 10% Polyvinyl Alcohol 10% PVA 10g Polyvinyl Alcohol(30.000–70.000MW) DD H2O 90ml (qs to1L) Khuyấy đun nhẹ hỗn hợp PVA, phân chia 10ml tube lớn, bảo quản 4oC 13 Dung dịch phát triển (thêm NBT BCIP trước sử dụng) 1x buffer III 90ml Buffer III 1% PVA 10ml 10% Polyvinyl Alcohol 1mM Levamisole 24mg Levamisole Hòa tan hỗn hợp bảo quản 4oC Trước sử dụng bổ sung 4,5µl NBT (75 mg/ml dimethylformamide 70%); 3.5 µl BCIP (50mg/ml dimethylformanide 100%) ml Buffer III có Levamisole 14 10x PBS (1.3 M NaCL, 70mM Na2HPO4, 30mM NaH2PO4) 1.3M NaCl 76g NaCL 70mM Na2HPO4 12.46g Na2HPO4.2H2O 30mM NaH2PO4 4.68g NaH2PO4 DD H2O 900 ml Sử dụng NaOH HCL điều chỉnh pH = 7.4, thêm dd H2O đến 1L Hấp khử trùng bảo quản 4oC 15 Đệm acid maleic 100mM Maleic acid 11.61g Maleic acid 150mM NaCl 8.77g NaCl DD H2O thêm đủ L Hấp khử trùng bảo quản 4oC 16 17 Davidson, thành phần gồm: Cồn 95% : 330 ml Formalin : 220 ml Acid acetic glacial : 115 ml Nước cất 335 ml : Trizol Phenol pH = 19 ml Guanidine thiocyanate(0.8M) 5,9 g Amonium thiocyanate (0.4M) 3,8006 g Sodium acetate 3M pH = 5.2 1,67 ml 18 Glycerol 2,5 ml Thêm H2O – DEPC đủ 50 ml Thuốc nhuộm Hematoxylin – Mayer Dung dịch A : Hematoxylin cystals: gram Cồn 99.5%: 10ml Dung dịch B: 20g Amonium postasium (phèn nhôm) 200 ml nước cất đun nhẹ lửa cho tan + DDA đun sôi nhanh + 0.5g HgO Nhấc khỏi nguồn nhiệt làm nguội nhanh cách đặt vào khay nước đá tan Lọc qua giấy lọc bảo quản chai màu Khi dùng cho thêm vào ml acid acetic glacial 19 Thuốc nhuộm Eosin Hoà tan gram Eosin Y vào 100 ml nước cất, sau cho vào 300 ml cồn 70% + 0.5ml Acid acetic glacial PHỤ LỤC 4: SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM CẢM NHIỄM Lơ cảm nhiễm Ngày Tổng thứ Bể Bể Bể số cộng (1) (2) (3) dồn 3 19 29 3 41 2 49 2 58 12 86 13 10 117 11 142 10 166 11 16 23 21 226 12 30 26 35 317 13 21 15 24 377 14 13 14 10 414 15 436 16 453 17 10 476 18 11 504 19 10 12 534 20 6 551 21 3 561 22 567 Tỉ lệ chết (%) 0.9 2.1 3.2 4.6 5.4 6.4 9.6 13 15.8 18.4 25 35.2 41.9 46 48.4 50.3 52.9 56 59.3 61.2 62.3 63 Lô đối chứng Tổng Tỉ lệ Bể Bể Bể số cộng chết (4) (5) (6) (%) dồn 0.33 1 0.67 1 0.89 0 1 11 1.22 0 12 1.33 1 14 1.56 15 1.67 1 17 1.89 1 21 2.33 0 22 2.44 1 24 2.67 27 30 3.33 31 3.44 1 33 3.67 2 38 4.22 42 4.67 48 5.33 54 57 6.33 60 6.67 Ghi chú: (1), (2), (3), (4), (5), (6): Số lượng PL bị chết ghi nhận hàng ngày LÝ LỊCH TRÍCH NGANG Họ tên: Nguyễn Doãn Duẩn Ngày, tháng, năm sinh: 18/08/1981 Nơi sinh: Hà Tĩnh Địa liên lạc: 54 Vĩnh Hội, Phường 4, Quận 4, Thành phố Hồ Chí Minh Điện thoại: 08.3826.0662 Quá trình đào tạo: − Từ năm 1999 đến 2003 học Đại học trường Đại học Sư phạm Vinh − Từ năm 2006 đến 2008 học Cao học trường Đại học Bách khoa TP Hồ Chí Minh Q trình cơng tác: Từ năm 2003 đến 2006 dạy học trường PTTH Hàm Nghi, Hà Tĩnh ... TÀI: XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỤC THÂN TRÊN ẤU TRÙNG TƠM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii) VÀ VỊ TRÍ NHIỄM CỦA MẦM BỆNH II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: – Xác định tác nhân gây bệnh đục thân ấu trùng. .. thân gây Vì chúng tơi thực đề tài: “XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỤC THÂN TRÊN ẤU TRÙNG TƠM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii) VÀ VỊ TRÍ NHIỄM CỦA MẦM BỆNH” Mục tiêu nghiên cứu − Xác định tác nhân. .. nhân gây bệnh đục thân ấu trùng TCX virus gây − Xác định vị trí có diện mầm bệnh ấu trùng TCX bị bệnh đục thân Nội dung nghiên cứu − Phát mầm bệnh ấu trùng TCX bị bệnh đục thân kỹ thuật RTPCR − Xác