Virus gây hoại tử cơ quan lập biểu mô và cơ quan tạo máu có tên IHHNV (Infectiou Hyperdermal and Hematopietic Necrosis Virus) hay còn gọi là virus Penaeus stylirostris densovirus (PstDNV) gây chết hàng loạt trên tôm xanh (Penaeus stylirostris) nuôi ở Mỹ vào năm 1981. Virus này là tác nhân gây bệnh còi cọc và dị dạng (RDS) trên tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei.
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN NGHIÊN CỨU SỰ LÂY NHIỄM CỦA IHHNV TRÊN TÔM SÚ TRONG ĐIỀU KIỆN PHỊNG THÍ NGHIỆM Cao Thành Trung1, Phạm Cơng Ngun1, Nguyễn Văn Hảo2 TÓM TẮT Virus gây hoại tử quan lập biểu mơ quan tạo máu có tên IHHNV (Infectiou Hyperdermal and Hematopietic Necrosis Virus) hay gọi virus Penaeus stylirostris densovirus (PstDNV) gây chết hàng loạt tôm xanh (Penaeus stylirostris) nuôi Mỹ vào năm 1981 Virus tác nhân gây bệnh còi cọc dị dạng (RDS) tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei Thí nghiệm lây nhiễm theo phương thức truyền dọc từ mẹ sang truyền ngang quần đàn tôm sú thiết lập dựa mẹ giao vĩ mang mầm bệnh IHHNV không mang IHHNV Sự lây truyền từ mẹ sang đánh giá thông qua trứng giai đoạn ấu trùng cùa mẹ nhiễm IHHNV kỹ thuật PCR Lây nhiễm truyền ngang thực nghiệm, gồm lây nhiễm lồi (sống chung ăn tơm sú nhiễm IHHNV) lây nhiễm khác lồi tơm sú (3-5g) khỏe sống chung ăn tôm thẻ chân trắng nhiễm IHHNV Lây nhiễm truyền ngang bố trí với ba nghiệm thức (1) cho ăn tôm bệnh (2) cho ăn sống chung tôm bệnh (3) sống chung với tơm bệnh Lây truyền từ mẹ thí nghiệm thu trứng ấu trùng mẹ nhiễm IHHNV Kiểm tra lây nhiễm IHHNV phương pháp PCR Kết phân tích trứng giai đoạn ấu trùng tôm mẹ bị nhiễm IHHNV cho thấy trứng, Nauplli 1-3, Mysis 1-3, Zoea 1-3 Postlarvae 1-6 mang IHHNV Kết lây nhiễm truyền ngang với nghiệm thức với tỷ nhiễm sau 14, tuần lây nhiễm lần lược nhóm tơm sống chung tơm bệnh 60,0% 86,7%; nhóm tơm cho ăn tơm bệnh 46,7 60,0%; nhóm cho ăn tơm sống tơm bệnh 66,7% 76,7% Ở thí nghiệm lây nhiễm khác lồi có tỷ lệ nhiễm sau 14 tuần tương đương nhóm sống chung 43,3% 66,7%; nhóm tơm cho ăn tơm thẻ nhiễm IHHNV 13,3% 40,0%; nhóm kết hợp cho sống chung ăn tôm thẻ nhiễm 26,7% 80,0% Kết thí nghiệm dùng để nghiên cứu lây nhiễm virus tơm sú nhằm tìm giải pháp để ngăn ngừa phòng trị bệnh virus cách hiệu tôm nuôi Từ khóa: IHHNV, Penaeus monodon, lây nhiễm I ĐẶT VẤN ĐỀ Những năm gần đây, nghề nuôi tôm giới bị ảnh hưởng nhiều virus gây bệnh Trong năm thập kỷ 90, có loại virus gây bệnh tôm ghi nhận, đến số tăng 20 loại (Walker Winton, 2010) Trên tôm nuôi Việt Nam năm gần đây, virus gây bệnh đốm trắng WSSV (White spot symdrome virus), virus gây bệnh còi MBV (Monodon baculovirus) xuất nhiều virus khác gây bệnh nghiêm trọng bệnh đầu vàng (YHV/GAV), virus gây bệnh đục (MrNV & XSV) (Đặng Thị Hoàng Oanh Nguyễn Thanh Phương, 2012) Thêm vào đó, số virus tôm thẻ tôm sú nuôi xuất virus Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Mơi trường Phịng ngừa Dịch bệnh Thủy sản Khu vực Nam bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản Email: thanhtrung77@yahoo.com Viện Nghiên cứu Ni trồng Thủy sản TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 99 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN gây bệnh đục (Infectious myonecrosis virusIMNV, virus gây bệnh hoại tử quan lập biểu mô quan tạo máu IHHNV (Hùng ctv., 2009; Ngô Xuân Tuyến, 2010) Virus gây hoại tử quan lập biểu mô quan tạo máu (IHHNV) tác nhân gây bệnh có độc lực cao tơm xanh Thái Bình Dương (Penaeus stylirostris), tỷ lệ tơm chết lên 90 % sau tuần lây nhiễm tôm 30-50 ngày tuổi Tuy nhiên, tôm thẻ chân trắng tôm sú nuôi (Penaeus vannamei Penaeus monodon) mang nhiễm virus khơng gây chết Chúng gây hội chứng chậm lớn dị dạng tôm nuôi (RDS - ruNt deformity syndrome) (Bell Lightner., 1984; Primavera Quinito., 2000) Sự lây nhiễm IHHNV tôm sú Penaeus monodon trước không quan tâm, vậy, số nghiên cứu IHHNV diện lồi tơm gây hội chứng RDS mẫu tôm sú nuôi bị nhiễm IHHNV Philippine Kết nghiên cứu Philippine cho thấy tôm sú nuôi nhiễm IHHNV làm cho tơm chậm lớn, kích thước nhỏ biến dạng lớp kitin Bên cạnh đó, biến dạng xuất tơm kích thước lớn (hoặc ni lâu ngày) cho thấy hội chứng RDS biểu phụ thuộc vào độ tuổi kích thước tơm sú ni (Primavera Quinito., 2000) Tuy nhiên, IHHNV phát phân bố rộng rãi tôm sú nuôi khu vực Đông Đông Nam Á, dường không gây thiệt hại tỷ lệ sống sản lượng (Flegel., 1997; Chayaburakul ctv., 2005; Tang ctv., 2003) Hiện nay, cịn có nhiều ý kiến trái ngược tác động virus lên tăng trưởng tôm sú, nghiên cứu cho thấy, tôm sú ni Philipine có tượng dị dạng cịi cọc, phát triển có kích thước khơng nhiễm IHHNV (Primavera & Quinitio., 2000), tôm sú nuôi Ấn Độ có tượng tơm chậm lớn nhiễm IHHNV Theo Rai ctv (2009) virus 100 MBV, HPV LSNV gây hội chứng chậm lớn, IHHNV có mối liên hệ đến chậm phát triển tơm sú Tuy nhiên, có số ý kiến cho việc nhiễm IHHNV khơng có tác động lớn phát triển tôm nuôi Theo Withyachumnarnkul ctv (2006) nghiên cứu ảnh hưởng virus đến tăng trưởng tôm, số lượng trứng đẻ tỷ lệ nở trứng cho thấy khơng có ảnh hưởng lớn đến phát triển tôm sú đến sinh sản tôm mẹ nhiễm nhẹ IHNNV Một nghiên cứu khác Brazil tôm thẻ chân trắng cho thấy, diện IHHNV với tỷ lệ cao phân tích thống kê thấy khơng có mối tương quan nhiễm IHHNV dấu hiệu RDS hay trọng lượng thể tôm thời gian nuôi ao (Braz ctv., 2009) Thêm vào đó, lan truyền IHHNV diễn tự nhiên truyền dọc truyền ngang Thí nghiệm truyền dọc xác lập thông qua giám sát diện IHHNV phôi hệ ấu trùng tôm thẻ chân trắng cho thụ tinh trứng từ hai tôm thẻ chân trắng (một bị nhiễm IHHNV không nhiễm IHHNV) với tôm đực khơng mang IHHNV Kết phân tích PCR cho thấy tơm nhiễm IHHNV phơi hệ chúng nhiễm IHHNV, trường hợp tôm mẹ khơng mang IHHNV phơi hệ khơng mang virus IHHN (Motte ctv., 2003) Một nghiên cứu khác lây truyền dọc cho thấy, IHHNV nhiễm mô buồng trứng trứng thụ tinh tơm Fenneropenaeus chinesis giai đoạn chúng mang virus (Zhang Sun., 1997) Lây truyền dọc xác định, virus phát mô buồng trứng nang buồng trứng (Lotz, 1997) Một số cá thể quần đàn P stylirostris P vannamei sống sót qua đợt dịch bệnh mang IHHNV suốt thời gian sống, chúng truyền IHHNV sang TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN hệ quần đàn khác thông qua đường truyền ngang, lẫn truyền dọc (Bell Lightner, 1984; Lotz, 1997) Đây điều thú vị, câu hỏi đặt IHHNV lan truyền quần đàn tôm sú IHHNV có ảnh hưởng đến quần đàn tơm sú Việt Nam có hay khơng Vì vậy, nghiên cứu này, chúng tơi bố trí thí nghiệm lây nhiễm IHHNV tôm sú nuôi Việt Nam theo hai đường lan truyền ngang truyền dọc II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mẫu vật sinh học Mẫu tôm sú nhiễm IHHNV thu Đồng Bằng Sông Cửu Long kiểm tra Multiplex PCR với cặp mồi vnIHF/R 309F/R (OIE, 2009) Mẫu tôm sú giáp xác: tôm sú tôm thẻ (3-5 g) thu trại nuôi thực nghiệm Bạc Liêu – Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản nuôi Trại thực nghiệm Gò Vấp thuộc Viện 2.2 Phương pháp phân tích Multiplex PCR Qui trình Multiplex phát IHHNV type lây nhiễm dựa cặp mồi thiết kế vnIHF/R 309F/R Thành phần phản ứng PCR gồm 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1.5 mM MgCl2, 200 µM deoxynucleoside triphosphate, 25 µM mồi vnIHF/R, 10 µM mồi 309F/R, 1-2 µl (50 ng) mẫu DNA, enzyme DNA polymerase 0.125 U (Promega, Mỹ) Tổng thể tích phản ứng 25 µl thực máy PCR Thermal Cycler (Biorad, MỸ) Điều kiện phản ứng: Biến tính ban đầu 95°C phút, sau 35 chu kỳ khuếch đại với biến tính 95°C 45 giây, bắt cặp mồi 58°C 45 giây, kéo dài mạch 72°C phút Kết thúc trình khuếch đại phản ứng ủ 72°C phút Sản phẩm khuếch đại điện di gel agarose 2% 2.3 Ly trích DNA tổng số Được tiến hành theo quy trình Gudkovs, (2008) có điều chỉnh Sử dụng mô tôm, chân bơi, ấu trùng, nghiền 300 µl dịch đệm ly trích DNA (50 mM Tris, pH8; mM EDTA, pH8; 500 mM NaCl; 1% SDS), ủ bồn nước đá phút, sau đun 100°C 10 phút, lấy mẫu cho vào nước đá phút, ly tâm 13.000 vòng/phút 10 phút Hút dịch bên chứa DNA cho vào eppendorf 1,5ml Sau tủa dịch thể tích cồn tuyệt đối, ly tâm 13.000 vòng/phút phút để thu tủa DNA Loại bỏ dịch nổi, tủa DNA làm khô 560C 10 phút, hòa tan cặn tủa DNA 200 µl nước khử ion giữ −20°C 2.4 Ly trích nhân sinh virus Tơm bị nhiễm IHHNV dự trữ tủ -70oC lấy cho vào đá vảy để rã đơng, sau loại bỏ lớp giáp gan Cân khoảng – 10 gam mô tôm cho vào cối (đã để lạnh), nghiền 15 – 30 ml TN (0,02M Tris HCl, 0,4 NaCl, pH 7,4) điều kiện lạnh Sau ly tâm 12.000 vòng/phút phút Hút dịch lọc qua màng lọc 0,45 µm Cho vào eppendorf 1,8 ml vô trùng bảo quản -27 oC để sử dụng lây nhiễm Dhar ctv (2001) có bổ sung chỉnh sửa Hai mươi mircoliter dịch tiêm vào cá thể tôm khỏe (3-5g) Sau ngày tiêm, tôm nuôi lây nhiễm tiêm nhắc thêm lần Tôm sau tiêm nhắc đến ngày thứ 14 cắt chân bơi kiểm tra diện virus Tôm dùng để làm nguồn sống chung cho ăn 2.5 Lây nhiễm theo trục dọc Sử dụng phương pháp PCR để sàng lọc khoảng 100 cá thể tôm sú mẹ giao vĩ trước để xác định tôm mẹ nhiễm virus IHHNV tôm sú mẹ không nhiễm IHHNV Sáu tôm mẹ nhiễm IHHNV tôm mẹ không nhiễm IHHNV (đối chứng âm) giao vĩ trước kiểm tra IHHNV PCR Tiến hành nuôi cá thể tơm mẹ bể 4000 lít chứa nước biển (35 ppt) riêng biệt, nhiệt độ (28 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 101 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN – 300C), có sục khí cho thức ăn (mực tươi, ốc mượn hồn) Cho đẻ, trứng giai đoạn ấu trùng nauplli – 3, zoea – 3, mysis – 3, postlarvae 1- thu cho vào lọ có cồn 700 có ghi số riêng biệt Sau ly trích DNA tổng số để phân tích PCR 2.6 Lây nhiễm theo trục ngang 2.6.1 Lây nhiễm lồi Thí nghiệm thực nghiệm thức: + Nhóm - sống chung: 10 cá thể tôm sú không nhiễm IHHNV kiểm tra PCR sống chung với cá thể tơm sú nhiễm IHHNV gây nhiễm trước phương pháp tiêm Nhóm đối chứng 1, bao gồm 10 cá thể tôm sú khỏe mạnh sống chung với cá thể tôm sú khỏe mạnh khác Tôm cho ăn thức viên công nghiệp lần/ngày + Nhóm - thức cho ăn mẫu tơm bệnh: 10 cá thể tôm sú không nhiễm IHHNV cho ăn mô tôm sú nhiễm virus với tỉ lệ 10% trọng lượng tôm ngày Tôm cho ăn lần ngày thời gian ngày liên tục Sau ngày cho ăn cuối cùng, tơm cho ăn lại thức ăn viên bình thường Đối với nhóm đối chứng tơm cho ăn mô tôm sú không nhiễm virus ngày liên tục sau cho ăn lại thức ăn viên + Nhóm - lây nhiễm cách thức sống chung đồng thời cho ăn mô tôm bệnh: 10 cá thể tôm sú không nhiễm IHHNV sống chung với cá thể tôm sú nhiễm IHHNV kiểm tra PCR trước đó, đồng thời cho ăn mô tôm sú nhiễm IHHNV với tỉ lệ 10% trọng lượng tôm ngày Tôm cho ăn ngày ngày ngày liên tục Sau thời gian cho ăn này, tôm cho ăn lại thức ăn viên Đối với nhóm đối chứng, 10 cá thể tôm sú khỏe mạnh sống chung với cá thể tôm sú khỏe mạnh khác đồng thời cho ăn mơ tơm sú khơng nhiễm IHHNV, sau cho ăn lại thức ăn viên 102 Mỗi nhóm nghiệm thức lặp lại lần, thời gian thí nghiệm kéo dài tuần Sau tuần tuần tiến hành thu mẫu chân bơi tôm sú kiểm tra PCR, từ xác định mức độ nhiễm IHHNV (tỉ lệ % tôm nhiễm) 2.6.2 Lây nhiễm khác lồi Thí nghiệm bố trí giống lây nhiễm khác lồi, tơm sống chung cho ăn tôm bệnh tôm thẻ chân trắng nhiễm IHHNV III KẾT QUẢ 3.1 Kết lây nhiễm truyền dọc Trong nghiên cứu trước tôm thẻ chân trắng tôm he Trung Quốc, tôm bố mẹ mang virus IHHV phơi, trứng giai đoạn ấu trùng chúng điều mang virus Ở nghiên cứu này, để đánh giá có lây truyền IHHNV từ mẹ sang con tôm sú hay không Kết nghiên cứu cho thấy mẹ mang virus trứng con chúng mang virus Trong 100 mẹ, qua sàng lọc kỹ thuật PCR, chọn mẹ nhiễm IHHNV sinh sản Trong nghiệm thức mẹ mang trứng giao vĩ xác định nhiễm IHHNV nuôi chung sau cắt mắt đẻ Trứng sau đẻ thu mà chuyển qua bể ương, trứng mẹ ương bể riêng biệt Mỗi giai đoạn biệt hóa từ trứng ấu trùng PL6 thu cho vào lọ có kí hiệu riêng biệt kiểm tra diện IHHHNV Đối với mẹ khơng nhiễm IHHNV bố trí đồng thời, cách xa nhóm bệnh cho sinh sản nhóm tơm mẹ mang mầm bệnh Kết phân tích PCR cho thấy nhóm lây nhiễm, tất trường hợp tôm mẹ nhiễm IHHNV truyền IHHNV cho trứng giai đoạn sau chúng Ở nhóm đối chứng tôm mẹ không nhiễm IHHNV cho kết trứng giai đoạn sau khơng bị nhiễm IHHNV TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN Hình Kiểm tra PCR phát mẫu tôm mẹ nhiễm IHHNV giai đoạn ấu trùng nhiễm virus Sự lan truyền IHHNV từ mẹ sang chúng thông qua cá thể tôm sú mẹ không nhiễm IHHNV bị nhiễm IHHNV nghiên cứu Trong đó, cá thể tơm mẹ (kí hiệu S2 S9) khơng nhiễm IHHNV làm thành nhóm đối chứng cá thể tơm mẹ (kí hiệu S3, S4, S5, S6, S8 S12) nhiễm IHHNV xếp vào nhóm lây nhiễm Sau tơm mẹ đẻ, trứng giai đoạn ấu trùng chúng thu phân tích phương pháp PCR Kết thể bảng Bảng Kết phân tích PCR mẫu trứng giai đoạn ấu trùng thu từ cá thể tôm mẹ nhiễm khơng nhiễm IHHNV Giai đoạn Đối chứng Nhóm lây nhiễm Mẹ S2 Mẹ S9 Mẹ S3 Mẹ S4 Mẹ S5 Mẹ S6 Mẹ S8 Mẹ S12 Trứng Nauplii Nauplii Nauplii3 Zoea Zoea Zoea (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) Mysis (-) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+) Mysis Mysis PL PL PL PL PL PL (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) Kí hiệu: (+): dương tính với IHHNV; (-): âm tính với IHHNV TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 103 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Kết phân tích PCR cho thấy nhóm lây nhiễm, tất trường hợp tôm mẹ nhiễm IHHNV truyền IHHNV cho trứng giai đoạn sau chúng Ở nhóm đối chứng tơm mẹ khơng nhiễm IHHNV cho kết trứng giai đoạn sau khơng bị nhiễm IHHNV 3.2 Thí nghiệm lây truyền ngang Mục tiêu thực lây nhiễm nhằm xác định lây truyền cá thể tôm quần đàn quần đàn với Đồng thời đánh giá triệu chứng lâm sàng bệnh hoại tử gan tụy virus gây tôm sú Thêm vào xác định thời gian bệnh xuất bệnh lý nhiễm IHHNV Thực nghiệm phương pháp kiểm chứng trình phát triển phương pháp PCR chẩn đốn IHHNV 3.3 Lây nhiễm lồi Để đánh giá diện virus thông qua lây truyền ngang quần đàn nào, tiến hành nghiệm thức: cho ăn, sống chung kết hợp sống chung cho ăn mẫu tôm nhiễm virus Sau tuần lây nhiễm chân bơi cá thể thu nhận kiểm tra diện IHHNV mẫu tôm Kết thể bảng Tỷ lệ nhiễm nhóm tơm sau phân tích PCR tuần sau lây nhiễm nhóm cho sống chung tơm bệnh 60,0 86,67%; nhóm cho ăn tơm bệnh 46,67 60%; nhóm kết hợp cho ăn sống chung tôm bệnh 66,67 76,67% Tiến hành so sánh thống kê nhóm thí nghiệm với tuần thứ sau lây nhiễm, chúng tơi khơng thấy khác biệt có ý nghĩa nhóm nghiệm thức (p>0,05) biểu đồ hình Ở tuần thứ sau lây nhiễm, tỉ lệ nhiễm IHHNV tăng lên tất nhóm thí nghiệm Điều cho thấy khả nhân lên số lượng virus cá thể tôm nhiễm bệnh khả truyền lại virus cho cá thể tôm khỏe mạnh cịn gia tăng Tuy nhiên, chúng tơi khơng ghi nhận khác biệt (p>0,05) nhóm thí nghiệm sau thời gian Bảng Kết xác định mức độ nhiễm nhóm thí nghiệm sau gây nhiễm Nghiệm thức Tổng số tơm phân tích Đối chứng Đối chứng 2 tuần tuần Số lượng tơm dương tính Tỉ lệ nhiễm (%) Số lượng tơm dương tính Tỉ lệ nhiễm (%) 30 0 0 30 0 0 Đối chứng 30 0 0 Nhóm 30 18 60,0 26 86,67 Nhóm 30 14 46,67 18 60,0 Nhóm 30 20 66,67 23 76,67 Hình Biểu đồ so sánh tỉ lệ nhiễm IHHNV (%) nhóm thí nghiệm sau thời gian tuần tuần Dữ liệu thể tỉ lệ nhiễm (%) với độ lệch chuẩn (M ± SD) 104 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 3.4 Lây nhiễm khác loài Để khẳng định lây nhiễm truyền ngang lồi tơm quần đàn hệ sinh thái sống tôm sú, tiến hành bố trí thí nghiệm lây nhiễm lây nhiễm truyền ngang lồi Tuy nhiên, mẫu tơm ăn sống chung tôm thẻ chân trắng mang IHHNV Kết sau phân tích nghiệm thức sau lây nhiễm tuần Kết nhóm tơm sú sống chung với tơm thẻ nhiễm 43,33 66,67%; Nhóm tơm cho ăn tơm thẻ nhiễm IHHNV 13,33 40,0%; Nhóm kết hợp cho sống chung ăn tôm thẻ nhiễm 26,67 80,0% Tiến hành phân tích so sánh thống kê nhóm lây nhiễm khác nhau, chúng tơi nhận thấy khơng có khác biệt (p>0,05) nhóm lây nhiễm Tuy nhiên sau tuần lây nhiễm, so sánh thống kê nhóm, kết cho thấy có khác biệt có ý nghĩa (p=0,02 < 0,05) nhóm thí nghiệm sống chung đồng thời cho ăn so với nhóm cho ăn mơ tơm bệnh không ghi nhận thấy khác biệt nhóm cịn lại (p>0,05) Kết cho thấy tỷ lệ nhiễm tăng lên nhiễm cao nhóm sống kết hợp cho ăn với tôm thẻ bệnh Bảng Kết xác định mức độ nhiễm nhóm thí nghiệm sau gây nhiễm tuần tuần Nghiệm thức Tổng số tơm phân tích Số lượng tơm dương tính IHHNV Tỉ lệ nhiễm (%) Số lượng tơm dương tính IHHNV Tỉ lệ nhiễm (%) Đối chứng 30 0 0 Đối chứng 30 0 0 Đối chứng 30 0 0 Nhóm 30 13 43,33 20 66,67 Nhóm 30 13,33 12 40,0 Nhóm 30 26,67 24 80,0 Hình Biểu đồ so sánh tỉ lệ nhiễm IHHNV (%) nhóm thí nghiệm thời gian tuần tuần Dữ liệu thể mức độ nhiễm với độ lệch chuẩn (M ± SD) TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 105 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN 3.5 Biểu bệnh tích sau lây nhiễm Tôm sau lây nhiễm, ghi nhận có số mang virus có biểu màu sắc khác thường so với bể đối chứng Hình Quan sát, biểu hình thái tơm sau lây nhiễm tuần (A) Tôm bể lây nhiễm; (B) Tôm bể lây nhiễm (mũi tên) bể đối chứng IV THẢO LUẬN Sự lây truyền IHHNV từ bố mẹ sang hệ tôm thẻ chân trắng P chinesis nghiên cứu chứng minh, IHHNV lan truyền từ mẹ sang (Motte ctv., 2003; Zhag ctv., 1997) Tuy nhiên Việt Nam, tôm sú nuôi chưa thấy có tác động lớn IHHNV Các nghiên cứu chủ yếu tập trung bệnh đốm trắng, bệnh còi Đồng thời, chưa có nghiên cứu việc truyền lan IHHNV tôm sú nuôi Việt Nam, để làm rõ lây truyền virus tơm sú ni ĐBSCL từ nhằm đưa giải pháp hạn chế lan truyền chúng tôm nuôi nước ta Ở nghiên cứu này, nhóm tơm mẹ giao vĩ bị nhiễm IHHNV cho đẻ, trứng chúng giai đoạn ấu trùng kiểm tra PCR Kết cho thấy có lây truyền từ IHHNV tôm sú mẹ mang IHHNV sang con thông qua trứng giai đoạn phát triển ấu trùng potlavae bảng chứng minh Ở nhóm mẹ âm tính IHHNV phân tích PCR, trứng con chúng âm Kết cho thấy, nguồn nước bể ương trình 106 cho sinh sản ương ni khơng có lây truyền ngang IHHNV Lây truyền theo chiều dọc góp phần đáng kể vào lây lan nhanh chóng IHHNV hệ thống ni trồng thuỷ sản đóng vai trị quan trọng gây bùng phát dịch IHHNV đàn tôm hoang dã tự nhiên Lây truyền từ mẹ sang giúp virus phát tán hệ thống ương, sau lây nhiễm sang ấu trùng chúng bắt đầu ăn lan truyền từ trứng sang ấu trùng (Lotz, 1997) Ở kết bảng 1, xác định tôm sú mẹ nhiễm hệ chúng bị nhiễm Kết giống kết nghiên cứu trước tơm sú, tơm thẻ chân trắng tôm Fenneropeneaus chinesis chứng minh IHHNV lây truyền theo chiều dọc truyền từ bố mẹ cho cháu chúng thông qua diện virus buồng trứng, đến trứng hệ (Withuyachumnarnkul ctv., 2006; Motte ctv., 2003; Zhang Sun., 1997) Lây truyền ngang IHHNV biết đường tôm ăn thịt xác vật chủ bị nhiễm bệnh, tiếp xúc trực tiếp tôm bệnh không bệnh tiếp xúc gián tiếp thơng TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN qua nước Khi xảy dịch bệnh, tượng tôm ăn lẫn xem đường lây nhiễm nhanh hiệu tự nhiên (Lightner ctv.,1983; Bell Lightner, 1984) IHHNV nhiễm tơm sú tơm thẻ khơng gây chết gây chết tôm xanh Trong nghiên cứu này, sau lây nhiễm IHHNV, tôm không bị chết virus, mà biểu thay sắc tố, không rõ ràng Đây sở để nghiên cứu hiểu rõ vể chất virus lây truyền tự nhiên nhằm nghiên cứu quần đàn tơm có mang virus mà khơng biểu bệnh, lồi tơm kháng IHHNV giai đoạn sớm tôm mang mầm bệnh virus lây truyền qua lồi tơm nhạy cảm theo giai đoạn sống cách thông qua thí nghiệm lây truyền cho ăn tơm bệnh sống chung Phân tích tỷ lệ nhiễm IHHNV sau tuần tuần lây nhiễm cho thấy tỷ lệ nhiễm nghiệm thức điều tăng lên rõ rệt Ở nghiệm thức sống chung sống chung kết hợp ăn bệnh phẩm ngày tỷ nhiễm lệ đạt cao 70%, gia tăng tỷ lệ nhiễm chứng tỏ virus nhân lên có lây lan rõ rệt Tương tự nghiệm thức cho tôm ăn mẫu bệnh phẩm ngày liên tiếp, tuần kiểm tra diện virus tôm lây nhiễm IHHNV thấp (46,67%) tuần tỷ lệ nhiễm lên đến 60,0 % Trong phần thảo luận tránh lặp lại chi tiết kết Kết cho thấy, có lây lan virus quần đàn tôm sú Trong kết nghiên cứu IHNNV nhân sinh virus cách tiêm, nhân sinh virus chậm tơm lây nhiễm, cịn tùy thuộc vào điều kiện nhiệt độ thời gian (Montgomery-Brock ctv., 2007; GalvánAlvarez ctv., 2012) Ở nhiệt độ thường 28-300C, thời gian nhân sinh virus tôm thẻ chân trắng cao khoảng 17-21 ngày Vì vậy, thí nghiệm lây nhiễm này, tỷ lệ phát IHHNV trong tuần cao tuần tất nghiệm thức điều phù hợp với nghiên cứu trước Điều cho thấy lây nhiễm đường ăn sống chung với tơm mang virus, virus cần phải có thời gian để thích nghi tương tác với tế bào chủ Chúng phải có thời gian vượt qua hệ thống miễn dịch tôm, đồng thời tăng cường nhân lên gen virus tế bào chủ Vì vậy, giai đoạn tuần đầu tỷ lệ nhiễm virus tùy thuộc vào mức độ virus đưa vào ổn định chúng xâm nhiễm vào tế bào chủ Một số nghiên cứu cho tôm sú nhiễm IHHNV ngồi tự nhiên bị cịi cọc, chậm lớn, dị hình màu sắc tơm sú thay đổi thành màu xanh lơ nước biển (Rai ctv., 2009) Ở nghiên cứu này, nhận thấy tôm sau tuần lây nhiễm số tơm có thay đổi màu sắc, khơng có biến đổi hình thái phân đàn hay dị dạng tôm sú tự nhiên nhiễm IHHNV Kết giống nghiên cứu Withyachumnarnkul ctv (2006) Hiện nay, khơng Việt Nam mà cịn nhiều quốc gia giới có xu hướng nhập giống ngoại lai để nuôi nhằm tăng cao sản lượng tránh rủi ro loại bệnh mà giống địa phương gặp phải Trong năm trở lại đây, ngồi đàn tơm sú có, tơm thẻ chân trắng đưa vào nuôi địa phương gia tăng cách nhanh chóng đại trà Những nghiên cứu gần cho thấy, lây truyền bệnh ngoại lai LOVV (Lymphoid organ vacuolization virus) từ tôm thẻ sang tôm sú, diện virus nguyên nhân gây bệnh chậm lớn tôm sú Hoặc bệnh đục MrNV XSV từ tôm xanh nhiễm qua tôm sú Penaeus (Fenneropenaeus) indicus kết tôm bị chết nhiều đục (Flegel., 2012) Cho đến nay, chưa có nghiên cứu nói vật chủ trung gian truyền lây IHHNV tôm sú biết đến Vì để hiểu rõ lan truyền virus từ tơm thẻ chân trắng sang tơm sú, từ để có cách phịng trị kịp thời, tiến hành thiết kế thí nghiệm dựa quần đàn tơm sú tơm TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 107 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN thẻ chân trắng kiểm tra diện IHHNV kỹ thuật PCR Kết thí nghiệm chứng minh có lây truyền dọc từ mẹ sang con, tôm sú mẹ nhiễm IHHNV trứng con chúng nhiễm IHHNV Cũng chứng minh lây truyền ngang loài khác loài quần đàn, tôm sú sống chung với tôm thẻ ăn tơm thẻ nhiễm IHHNV tơm sú nhiễm virus sau tuần lây nhiễm Tôm sú nhiễm virus sau tuần lây nhiễm 50% sống chung ăn tôm nhiễm virus Từ kết làm sở bước đầu cho nghiên cứu có biện pháp phịng trị lây truyền IHHNV tôm nuôi TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Gudkovs, N., 2008 Tài liệu thực hành phịng thí nghiệm, thuộc dự án “Nâng cao lực phòng xét nghiệm virus tôm Việt Nam” ACIAR, Úc phối hợp với Bộ NN & PTNT ĐH Cần Thơ, Việt Nam thực Đặng Thị Hoàng Oanh Nguyễn Thanh Phương, 2012 Các bệnh nguy hiểm tôm ni Đồng sơng Cửu Long Tạp chí Khoa học, Đại học Cần Thơ, tập 22c, trang 106-118 Phạm Văn Hùng, Nguyễn Tẫn Bình, Nguyễn Đăng Ninh, Phạm Hùng Vân, Phạm Thành Hổ, 2009 Sự phổ biến virus gây bệnh hoại tử vỏ quan tạo máu tơm sú ni Việt Nam Tạp chí Y Học TP Hồ Chí Minh, tập 13 (2), trang 234-238 Ngô Xuân Tuyến, 2010 Điều tra phát bệnh hoại tử tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei virus IMNV gây Việt Nam Báo cáo đề tài nghiên cứu cấp sở, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2, 54 trang Tài liệu tiếng Anh Bell, T.A., and Lightner, D.V., 1984 IHHN virus: Infectivity and pathogenicity studies in Penaeus stylirostris and Penaeus vannamei Aquaculture 38, 185-194 108 Braz, R.F.S., Silva, C.P.R.O., Reis, L.G.,, Martins, P.C.C., Sales, M.P., Meissner, R.V., 2009 Prevalence of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) in Penaeus vannamei cultured in Northeastern Brazil Aquaculture 288, 143–6 Chayaburakul, K., Lightner, D.V., Sriurairattana, S., Nelson, K.T., and B Withyachumnarnkul, 2005 Different responses to infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) in Penaeus monodon and Penaeus vannamei Dis Aquat Org., 67:191-200 Dhar, A.K., Roux, M.M., Klimpel, K.R., 2001 Detection and quantification of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus and white spot virus in shrimp using real-time quantitative PCR and SYBR green chemistry J Clin Microbiol Aug 39 (8), 2835–2845 Flegel, T.W., 1997 Special Topic Review: Major viral diseases of the black tiger prawn (Penaeus monodon) in Thailand World Journal of Microbiology and Biotechnology 13, 433-442 Flegel, T.W., 2012 Minireview: Historic emergence, impact and current status of shrimp pathogens in Asia, J Invertebr Pathol 110, 166-73 Galván-Alvarez, D, Mendoza-Cano, F, Hernández-López, J., Sánchez-Paz, A., 2012 Experimental evidence of metabolic disturbance in the white shrimp Penaeus vannamei induced by the Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus (IHHNV) Journal of Invertebrate Pathology 111, 60–67 Lightner, D.V., Redman, R.M., Bell, T.A., Brock, J.A., 1983 Detection of IHHN virus in Penaeus stylirostris and Penaeus vannamei imported into Hawaii J World Maricult Soc 14, 212-225 Lotz, J.M., 1997 Special topic review: viruses, biosecurity and specific pathogen-free stocks in shrimp aquaculture World J Microbiol Biotechnol 13, 405–13 Montgomery-Brock, D., Tacon, A.G.J., Poulos, B., & Lightner, D.V., 2007 Reduced replication of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN virus (IHHNV) in Litopenaeus vannamei held in warm water Aquaculture 265, 41–48 Penaeus monodon from India Aquaculture 295, 168–174 Motte, E., Yugcha, E., Luzardo, O.J., Castro, F., Leclercq, G., Rodrisguezj, J., Miranda, P., Borja, O., Serrano, J., Terreros, M., Montalvo, K., Narvasez, A., Tenorio, N., Cedno, V., Mialhe, E., and Boulo, V., 2003 Prevention of IHHNV vertical transmission in the white shrimp Litopenaeus vannamei Aquaculture 219, 57–70 Tang, K.F.J., Poulos, B.T., Wang, J., Redman, R.M., Shih, H.H., & Lightner, D.V., 2003 Geographic variations among infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) isolates and characteristics of their infection Dis Aquat Org 53, 91–99 Primavera, J.H., Quinitio, E.T., 2000 Runt-deformity syndrome in cultures of the giant tiger prawn Penaeus monodon J Crust Biol 20, 796–802 Rhode, S.L., 1985 Trans-activation of parvovirus P38 promoter by the 76K nucelocapsid protein J Virol 55, 886–889 Rai, P., Safeena, M,P., Karunasagar, I., Karunasagar, I., 2009 Simultaneous presence of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) and Type A virus-related sequence in Walker, P.J., and Winton, J.R., 2010 Review: Emerging viral diseases of fish and shrimp Vet Res 41, 51 Withyachumnarnkul, B., Chayaburakul, K., Supak, L.A., Plodpai, P., Sritunyalucksana, K., Nash, G., 2006 Low impact of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) on growth and reproductive performance of Penaeus monodon, Dis Aquat Org 69, 129–136 Zhang, J.X., Sun, X.Q., 1997 A preliminary study on the virus in the eggs of Penaeus chinensis Oceanogr Huanghai and Bohai Seas 15 (1), 48–51 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 109 ... 100 cá thể tôm sú mẹ giao vĩ trước để xác định tôm mẹ nhiễm virus IHHNV tôm sú mẹ không nhiễm IHHNV Sáu tôm mẹ nhiễm IHHNV tôm mẹ không nhiễm IHHNV (đối chứng âm) giao vĩ trước kiểm tra IHHNV PCR... 2.6 Lây nhiễm theo trục ngang 2.6.1 Lây nhiễm lồi Thí nghiệm thực nghiệm thức: + Nhóm - sống chung: 10 cá thể tôm sú không nhiễm IHHNV kiểm tra PCR sống chung với cá thể tôm sú nhiễm IHHNV gây nhiễm. .. con, tôm sú mẹ nhiễm IHHNV trứng con chúng nhiễm IHHNV Cũng chứng minh lây truyền ngang loài khác loài quần đàn, tôm sú sống chung với tôm thẻ ăn tơm thẻ nhiễm IHHNV tơm sú nhiễm virus sau tuần lây