Đánh giá đa dạng di truyền loài Thông đỏ bắc (Taxus chinensis (Pilg.) Rehd.) đang bị đe dọa trong hệ sinh thái rừng nhiệt đới Việt Nam

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Đề tài không những cho phép các nhà khoa học hiểu biết rõ hơn về sự tuyệt chủng trên cơ sở đánh giá mức độ suy giảm đa dạng di truyền quần thể và loài của

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-o0o -

VŨ ĐÌNH DUY

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN LOÀI THÔNG ĐỎ BẮC

(TAXUS CHINENSIS (PILG.) REHD.) ĐANG BỊ ĐE DỌA

TRONG HỆ SINH THÁI RỪNG NHIỆT ĐỚI VIỆT NAM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 0114

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS NGUYỄN MINH TÂM

Hà Nội, 2012

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa được sử dụng công bố trong bất kỳ tài liệu nào

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2012

Tác giả luận văn

Vũ Đình Duy

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến Ban Giám đốc Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Lãnh đạo phòng Phân loại thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen, các bạn bè đồng nghiệp đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong cả quá trình học tập, thực hiện nghiên cứu và hoàn thiện luận văn

Để hoàn thành bản luận văn này, tôi chân thành cảm ơn Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học; phòng Hệ thống học phân

tử và Di truyền bảo tồn, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh; Ban lãnh đạo các khu Bảo tồn và vườn Quốc gia và chính quyền địa phương đã tạo điều kiện cho chúng tôi thực hiện đề tài

Luận văn được thực hiện bởi Dự án BVMT.VAST: “Bảo tồn và sử dụng bền vững một số loài thông quý hiếm có giá trị kinh tế cao đang bị đe dọa tuyệt chủng và khu hệ nấm nội ký sinh có ích trong các loài nghiên cứu” và sự hỗ trợ bởi học bổng Nagao – Trung tâm nghiên cứu Tài nguyên Môi trường (CRES), Việt Nam

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình đã luôn động viên, khích lệ

và là chỗ dựa vững chắc cho tôi hoàn thành khóa luận này

NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

ADN Axit deoxyribonucleit (Deoxyribonucleic acid)

AFLP Đa hình độ dài các đoạn DNA nhân chọn lọc (Amplified

Fragment Length Polymorphism)

bp Cặp bazơ (base pair)

CR Loài cực kỳ nguy cấp

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

Genbank Ngân hàng gen quốc tế

ISSR Trình tự lặp đơn giản ngẫu nhiên (interal simple sequence repeat)

ME Phương pháp tiến hóa tối thiểu (Minimum Evolution Method)

MEGA Phần mền phân tích di truyền tiến hóa phân tử

MP Phương pháp tiết kiệm tối đa (Maximum Parasimony Method)

NCBI Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc gia (National

Center for Biotechnology Information)

NJ Phương pháp kết nối liền kề (Neighbor Joining Method)

PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction)

RADP Đa hình các đoạn DNA nhân ngẫu nhiên (Random Amplified

Polymorphic DNA)

rbcL Ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit gen

RFLP Đa hình độ dài các đoạn DNA hạn chế (Restriction Fragment

Length Polymorphism)

rpoC1 RNA polymerase C gen

SSR Trình tự lặp đơn giản (Simple Sequence Repeats)

UPGMA Phân tích Unweighted Pair Group Method

UV Ánh sáng tử ngoại

VU Loài sẽ nguy cấp

Quần thể

BDS Bát Đại Sơn, Quản Bạ, Hà Giang

BL Xuân Trường, Bảo Lạc, Cao Bằng

HK Hang Kia, Mai Châu, Hòa Bình

HLS Hoàng Liên, Sa Pa, Lào Cai

TPT Thài Phìn Tùng, Đồng Văn, Hà Giang

YC Mường Lựm, Yên Châu, Sơn La

DANH MỤC CÁC BẢNG

2.1 Địa điểm và số mẫu thu thập cho phân tích cpSSR 22

2.2 Danh sách các loài Thông dùng xác định phân tích vị

trí phân loại

23

2.3 Trình tự các nucleotide của 6 cặp mồi cpSSR 24

2.4 Các cặp mồi sử dụng để xác định vị trí phân loại giữa

các taxon

24

3.1 Cấu trúc tuổi quần thể của loài Thông đỏ bắc 38 3.2 Đa dạng di truyền quần thể của loài Thông đỏ bắc 42

3.3 Hệ số tương đồng di truyền (trên) và khoảng cách di

truyền (dưới) theo Nei (1987) ở mức độ quần thể và

44

loài của loài Thông đỏ bắc

3.4 Phân tích AMOVA (khác nhau ở mức độ phân tử) của

loài Thông đỏ bắc

46

3.5 Thành phần bazơ (%) của 3 vùng gen rpoC1, rbcL,

matK của 20 loài Thông

52

DANH MỤC CÁC HÌNH

1.1 Hình ảnh về loài cây Thông đỏ bắc (Taxus chinensis) 19 2.1 Bản đồ chỉ ra địa điểm nghiên cứu loài Thông đỏ bắc 24 3.1 Hình ảnh ADN tổng số đại diện của loài Thông đỏ bắc 39 3.2 Phổ điện di sản phẩm PCR của 6 cặp mồi cpSSR trên gel

polyacrylamide 5%

39

3.3 Cấu trúc không gian alen của các quần thể nghiên cứu 41

3.4 Phân tích NJ trên cơ sở khoảng cách di truyền giữa các quần

thể của loài Thông đỏ bắc

44

3.5 Phân tích UPGMA trên cơ sở khoảng cách di truyền từ 148

cá thể từ 6 quần thể của loài Thông đỏ bắc

45

3.6 Vị trí phân loại của 14 loài Thông nghiên cứu theo phương

pháp NJ trên cơ sở vùng gen matK

54

3.7 Vị trí phân loại của 17 loài Thông nghiên cứu theo phương

pháp NJ trên cơ sở vùng gen rbcL

55

3.8 Vị trí phân loại của 14 loài Thông nghiên cứu theo phương

pháp NJ trên cơ sở vùng gen rpoC1

55

3.9 Vị trí phân loại của 14 loài Thông nghiên cứu theo phương

pháp NJ trên cơ sở kết hợp 3 vùng gen rpoC1, matK và rbcL

56

2 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3

1.1 Khái niệm về quần thể thực vật 4 1.2 Tính đa đa dạng di truyền của quần thể thực vật 4 1.3 Ảnh hưởng của phân cắt nơi sống đến đa dạng di truyền thực vật 5 1.4 Đa dạng di truyền trong quần thể nhỏ và cô lập 5

1.5 Một số kỹ thuật sinh học phân tử thường được dùng trong nghiên

1.6 Tình hình nghiên cứu ngoài nước và trong ngoài nước về đa dạng di

truyền và tiến hóa phân tử 11

1.6.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 11 1.6.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 16 1.7 Một số đặc điểm của loài Thông đỏ bắc 18

2.2 Địa điểm, thời gian và phương pháp nghiên cứu 23 2.2.1 Địa điểm nghiên cứu 23 2.2.2 Thời gian nghiên cứu 24 2.2.3 Phương pháp khảo sát thực địa 24 2.2.4 Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm 24 2.2.4.1 Tách chiết ADN tổng số 24

2.2.4.3 Phân tích số liệu 26

3.1 Hiện trạng quần thể, loài Thông đỏ bắc 27

3.1.1 Phân bố của loài Thông đỏ bắc 27

3.2 Đa dạng di truyền quần thể và loài 37 3.2.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số và điện di sản phẩm PCR 37 3.2.2 Đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể của loài Thông đỏ

MỞ ĐẦU

Loài Thông đỏ bắc (Taxus chinensis (Pilg.) Rehd.) thuộc chi Thông đỏ

(Taxus), họ Thông đỏ (Taxaceae) là loài quý hiếm có giá trị đặc biệt về mặt y

học được sử dụng để sản xuất taxol (hợp chất chữa bệnh ung thư) [64], xây dựng nhà cửa, đóng đồ dùng gia đình, thủ công mỹ nghệ và làm cảnh Các loài này

phân bố ở vùng núi đá vôi và núi đất phía Bắc Việt Nam

Theo các tiêu chí mới của IUCN 2010 [36] loài này cần được xếp vào bậc sắp bị tuyệt chủng VU A2ac, B2ab (i-v), đã được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam với bậc sắp bị tuyệt chủng VU A1a, c, B1+2b, c [2] và Loài này thuộc nhóm IIA: Thực vật rừng hạn chế khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại của nghị định số 32/2006/NĐ-CP ngày 30/3/2006 về quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp, quý, hiếm [3] Mặc dù, một số quần thể của chúng là đối tượng đã được bảo vệ trong một số khu bảo tồn, nhưng chúng vẫn đang ở trong tình trạng

bị đe doạ Các tác giả đã chỉ ra rằng Thông đỏ bắc hiện chỉ còn khoảng 250 cá thể, phân bố tản mạn, với kích thước quần thể rất nhỏ Thông đỏ bắc hiện có mặt tại một số địa điểm như Quản Bạ, Đồng Văn (Hà Giang), Sapa (Lào Cai), Bảo Lạc (Cao Bằng), Yên Châu (Sơn La), Hang Kia - Pà Cò (Hoà Bình) Đã có một

số biện pháp bảo vệ loài này với các hình thức khác nhau, như bảo vệ nguyên vị tại một số khu bảo tồn và chuyển vị (giâm hom) [7] Tuy nhiên, các nhà quản lý

và các nhà khoa học còn thiếu các thông tin quan trọng về đa dạng di truyền ở cả

2 mức độ quần thể và loài, đặc biệt các yếu tố ảnh hưởng xấu đến sự tồn tại của chúng liên quan đến tác động của con người Điều này rất khó để nâng cao hiệu quả của công tác bảo tồn và sử dụng bền vững loài Thông nghiên cứu Để góp phần đưa ra các giải pháp bảo tồn và phục hồi loài thì việc đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể loài Thông có ý nghĩa quan trọng Mức độ đa dạng di truyền không những chỉ ra khả năng tồn tại của loài ở hiện tại và tương lại, mà còn chỉ ra tiềm năng tiến hoá của loài Ngày nay, kỹ thuật công nghệ sinh học được sử dụng rộng rãi, nhanh và có hiệu quả trong việc đánh giá mức độ đa

dạng di truyền quần thể và loài, đặc biệt các loài Thông đang có nguy cơ bị đe

dọa [43], [4], [11], [51], [59]

Xuất phát từ thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Đánh giá đa dạng di

truyền loài Thông đỏ bắc (Taxus chinensis (Pilg.) Rehd.) đang bị đe dọa

trong hệ sinh thái rƣ̀ng nhiệt đới Việt Nam”

MỤC TIÊU VÀ Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

1 Mục tiêu nghiên cứu

- Mục tiêu chung:

Đóng góp cho công tác bảo tồn và phục hồi hữu hiệu các loài quý hiếm đang bị đe doạ ở Việt Nam Giúp các nhà quản lý hiểu biết sâu hơn về mức độ tiến hoá, quan hệ di truyền giữa các loài Thông Các yếu tố tác động của con người làm xói mòn cấu trúc di truyền quần thể và loài Mục tiêu này cũng sẽ giúp cộng đồng các nhà khoa học hiểu biết tốt hơn về quá trình tuyệt chủng cũng như mức độ tiến hoá loài không chỉ cho các loài Thông và có thể áp dụng cho các loài cây khác có lịch sử sống tương tự

- Mục tiêu cụ thể:

Xác định mức độ xói mòn tính đa dạng di truyền quần thể và loài của loài

Thông đỏ bắc (Taxus chinensis): VU A1a, c, B1+2b, c [2]

Xác định được các nguyên nhân làm mất tính đa dạng di truyền quần thể và loài và đưa ra các giải pháp phục hồi loài Thông nghiên cứu

2 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Đề tài không những cho phép các nhà khoa học hiểu biết rõ hơn về sự tuyệt chủng trên cơ sở đánh giá mức độ suy giảm đa dạng di truyền quần thể và loài của loài Thông nghiên cứu mà còn áp dụng cho các loài Thông khác đang bị

đe doạ và vị trí phân loại trên cơ sở phân tích trình tự 3 vùng gen cho một số loài Thông ở Việt Nam

Đề tài cung cấp cơ sở khoa học cho các nhà quản lý cập nhật thông tin về giá trị bảo tồn và nâng cao sự hiểu biết của người dân sống gần rừng về sự tuyệt chủng loài cần bảo vệ

Kết quả của đề tài đóng góp cho công tác bảo tồn và quản lý hữu hiệu nguồn gen của các loài thực vật quý hiếm đang có nguy cơ tuyệt chủng, nâng

cao hiểu biết rõ hơn về phương thức sinh sản và mức độ đa dạng di truyền trong

và giữa các quần thể Thông và thu thập thông tin về ảnh hưởng của người dân địa phương đến tính đa dạng di truyền

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái niệm về quần thể thực vật

Quần thể được định nghĩa như là tập hợp một nhóm cá thể của một loài trong một nơi sống cụ thể và như vậy, chúng độc lập với các quần thể khác nhau

về quan hệ sinh sản Về mặt di truyền, quần thể liên quan ở mức độ cá thể và chúng được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác, và cũng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như kích thước quần thể, sức sinh sản, khả năng sống sót, phương phức sinh sản, trao đổi và đột biến di truyền Kích thước quần thể là kết quả của sự tương tác phức tạp liên quan đến các điều kiện môi trường sống và các đặc tính quần thể của loài Kích thước quần thể đóng vai trò quan trọng liên quan đến phương thức sinh sản, di truyền và tiến hoá Nguồn gốc tiến hoá thường liên quan đến cá thể lai (thế hệ tiếp theo) trong quần thể và loài Thụ phấn chéo có thể sản sinh những cá thể lai đa dạng Cấu trúc di truyền của những cá thể này

có nhiều cơ hội đóng góp vào tính đa dạng trong quần thể và duy trì khả năng thích nghi cao trong hoàn cảnh môi trường sống

Tác động của con người đến môi trường sống thường dẫn đến sự phá vỡ cấu trúc quần thể và thiết lập những quần thể nhỏ, cô lập và cuối cùng làm suy giảm khả năng thích nghi của quần thể với môi trường sống của chúng Ở đây, thế hệ được sản sinh bằng thụ phấn cận noãn sẽ dẫn đến sự khác nhau về di truyền giữa các quần thể là lớn, mất tính đa dạng di truyền và tăng tần số gen đồng hợp tử trong các quần thể nhỏ

1.2 Tính đa dạng di truyền của các quần thể thực vật

Đa dạng sinh học thường đề cập đến mức độ khác nhau của các dạng sống bao gồm các cá thể động vật, thực vật, vi sinh vật và được biểu hiện từ mức độ phân tử đến hệ sinh thái Đa dạng sinh học là kết quả của quá trình tiến hoá tự nhiên trải qua hàng triệu năm, bao gồm cả 3 mức độ hệ sinh thái, loài và di truyền

Lý thuyết tiến hoá trên cơ sở chọn lọc tự nhiên của Darwin đã dự đoán rằng đa dạng di truyền là thành phần chính của đa dạng sinh học Đa dạng di truyền cho phép cá thể và loài xử lý những biến đổi bất lợi của môi trường sống và có khả năng tự phục hồi trong môi trường sống của chúng Như vậy, đa dạng di truyền được đề cập đến như là mức độ đa hình của mỗi cá thể trong suốt thời gian sống của nó, hoặc được phản ánh bởi số alen của quần thể tại một nơi và thời gian cụ thể hoặc số alen của một loài trong phạm vi phân bố địa lý và lịch sử tồn tại của nó

1.3 Ảnh hưởng của phân cắt nơi sống đến đa dạng di truyền thực vật

Nơi sống của mỗi loài được thiết lập trong quá trình hình thành loài Phân cắt xảy ra khi nơi sống bị chia nhỏ và bị cô lập với nhau bằng ma trận các cảnh quan khác không giống ban đầu và không phù hợp cho sự tồn tại của loài Như vậy, phân cắt tạo nên sự phá vỡ nơi sống Tác nhân gây ra phân cắt bao gồm mở rộng đất nông nghiệp, khai thác không hợp lý tài nguyên sinh vật, xây dựng khu dân cư và khai thác khoáng sản Phân cắt đe doạ đến tính thống nhất sinh thái đã được hình thành trong lịch sử phát triển loài và là một trong những nguyên nhân gây ra sự tuyệt chủng Suy giảm diện tích nơi sống ảnh hưởng đến kích thước quần thể và phân bố lại các mảnh nơi sống còn lại sẽ ảnh hưởng đến sự phát tán của loài Hậu quả của quá trình phân cắt thường làm suy giảm chức năng hệ sinh thái và cuối cùng mất nơi sống Các quần thể nhỏ và bị cô lập trong các mảnh nơi sống còn lại dễ bị tổn thương và ít có khả năng thích nghi khi điều kiện môi trường sống của chúng bị thay đổi [39] Tất nhiên, hậu quả sẽ dẫn đến mất tính

đa dạng di truyền ở cả 2 mức độ quần thể và loài và cuối cùng nhiều loài bị đe

dọa tuyệt chủng

1.4 Đa dạng di truyền trong quần thể nhỏ và cô lập

Kích thước quần thể thực vật là kết quả của mối quan hệ phức tạp các nhân tố khác nhau bao gồm lịch sử hình thành quần thể, điều kiện môi trường sống và đặc điểm sinh thái của loài Kích thước quần thể phản ánh quá trình thụ phấn, cấu trúc di truyền và mức độ tiến hoá của loài Phần lớn các loài đang bị

đe doạ tuyệt chủng đều nhỏ về số cá thể trong mỗi quần thể và số quần thể và tồn tại trong những mảnh rừng nhỏ và cô lập Một trong những hậu quả của quần thể nhỏ và cô lập là xuất hiện mối quan hệ cận noãn giữa các cá thể trong quần thể Ảnh hưởng này có thể làm mất tính đa dạng di truyền nếu tần số và cường độ quan hệ cận noãn cao và cuối cùng giảm khả năng thích nghi của quần thể trong điều kiện môi trường biến đổi và tăng khả năng nhạy cảm đối với dịch

và 0.149, tương ứng [34] Loài phân bố rộng duy trì hệ số đa dạng di truyền cao gấp đôi so với loài đặc hữu Sự khác nhau này liên quan đến mức độ thấp của tỉ

lệ phần trăm lô cút đa hình và số alen xuất hiện ở loài đặc hữu Các loài có đặc điểm sinh thái như chu kỳ sống dài (lâu năm), sinh sản hữu tính và phát tán hạt nhờ động vật duy trì tính đa dạng di truyền cao hơn các loài với đặc điểm sinh thái khác Đối với quần thể, giá trị trung bình của hệ số đa dạng di truyền và lô cút đa hình là 0,113 và 34%, tương ứng Mức độ di truyền cao được duy trì đối với quần thể của loài thụ phấn nhờ động vật (côn trùng) Tuy nhiên, có sự khác nhau đáng kể về giá trị đa dạng di truyền giữa các quần thể đối với loài khác nhau Mức độ di truyền khác nhau khá lớn giữa các quần thể trong loài tự thụ phấn Nhiều công trình điều tra vào các năm tiếp theo về tính đa dạng di truyền

đã khẳng định kết quả đánh giá trên [49]

1.5 Một số kỹ thuật sinh học phân tử thường được dùng trong nghiên cứu

đa dạng di truyền ở thực vật

1.5.1 Kỹ thuật isozyme

Kỹ thuật Isozyme là kỹ thuật nghiên cứu sự đa hình enzyme Phương pháp này được Hunter và Market đưa ra từ năm 1957, được Harris hoàn thiện vào năm 1966 và bắt đầu được sử dụng phổ biến từ thập niên 70 đến nay Di truyền quần thể cần thiết phải nghiên cứu nguyên nhân và hậu quả của sự biến đổi di truyền trong/giữa các quần thể Kỹ thuật isozyme được sử dụng như dấu phân tử cho mục tiêu này Mặc dù hiện nay đã có nhiều kỹ thuật ADN phát triển nhưng kỹ thuật isozyme vẫn được sử dụng vì cách thức thực hiện tương đối nhanh, chi phí thấp, thích hợp cho các nghiên cứu xác định mức độ biến đổi di truyền ở cấp độ thấp Ngoài ra việc kết hợp kỹ thuật isozyme với các kỹ thuật nghiên cứu đa hình ADN cho phép phân tích, so sánh những đặc tính bền vững (hoặc thay đổi) theo điều kiện khác nhau của môi trường [12]

nhân được các đoạn khác biệt nhau [5], [12]

*Ưu điểm của kỹ thuật RAPD

Về mặt kỹ thuật, kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trước trình tự bộ gen của đối tượng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản,

chất lượng ADN khuôn không cần độ tinh sạch quá cao, thời gian thực hiện nhanh, khả năng nhân bản cao

Về mặt kinh tế, chi phí thực hiện cho kỹ thuật này thấp Trong nghiên cứu, kỹ thuật RAPD thường được sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao [13]

* Những hạn chế của kỹ thuật RAPD

Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao, không ổn định (thể hiện ở mức độ lặp lại giống nhau thấp) Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhưng khả năng xuất hiện đa hình thấp và độ tin cậy không cao [12], [13]

1.5.3 Kỹ thuật RFLP

RFLP (Restriction fragment length Polymorphism – đa hình chiều dài các đoạn ADN cắt bởi các enzyme giới hạn) Kỹ thuật này dựa trên đặc điểm của các enzyme giới hạn khác nhau, tạo nên các đoạn cắt ADN khác nhau phân biệt được bằng điện di đồ, các đoạn cắt còn được gọi là các “dấu vân tay” đặc trưng cho từng phân tử ADN Bản đồ di truyền kết quả RFLP có tính chính xác cao, thường được sử dụng trong nghiên cứu sự khác biệt trong cấu trúc bộ gene của các cá thể, các loài sinh vật, nhằm so sánh sự khác biệt giữa các mẫu nghiên cứu, xác định nguồn gốc hoặc mức độ tiến hóa giữa của các loài sinh vật [5], [12]

Kỹ thuật này được dùng phổ biến từ đầu thập niên 80 đến nay Kỹ thuật RFLP được sử dụng để kiểm tra sự phân ly di truyền của một số tính trạng theo qui luật Mendel, hoặc ứng dụng trong chọn giống động vật, chọn giống thực vật hoặc so sánh sự khác nhau giữa các cá thể, các loài sinh vật Kỹ thuật RFLP được thực hiện trên nguyên lý cắt enzyme giới hạn DNA của mẫu nghiên cứu sau khi được tách chiết và tinh sạch sẽ được cắt với cùng 1 số loại enzyme giới hạn Mỗi enzyme giới hạn sẽ nhận biết và cắt đặc hiệu DNA ở những vị trí xác định, do đó các bộ gen có cấu trúc khác nhau sẽ cho ra số lượng và kích thước các đoạn cắt ADN khác nhau, những bộ gen giống nhau thì sẽ cho ra số lượng,

kích thước các đoạn cắt giống nhau, kích thước vá số lượng các đoạn cắt này sẽ quan sát được trên điện di đồ

1.5.4 Kỹ thuật AFLP

Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), được hiểu

là sự đa dạng của các đoạn ADN được nhân lên có định hướng sau khi bị cắt bởi

2 RE, sử dụng những phân đoạn ADN làm khuôn cho phản ứng khuếch đại (PCR) Kỹ thuật này được Vos và cộng sự phát triển vào năm 1995 và ngay lập tức trở thành 1 công cụ hữu ích để nhận biết nhiều lô cút trong sự đa hình ADN

mà không cần biết trước thông tin về trình tự ADN của chúng Phương pháp này

có thể đưa ra nhanh chóng một ước lượng độ đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể với nhau

1.5.5 Kỹ thuật SSR

Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat), còn được gọi là microsaterlite

(vi vệ tinh) là kỹ thuật nghiên cứu dựa trên trình tự lặp các đoạn đơn giản, đây là những trình tự ngắn (từ 2 đến 6 cặp bazơ) có thứ tự lặp lại liên tiếp dao động từ

2 đến 40 đơn vị Các trình tự lặp đơn giản rất phổ biến ở hệ gen động vật và thực vật, mật độ các trình tự dao động rất lớn Chúng được phân bố trong hệ gen và

có tính đặc trưng cho từng loài [12]

Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý phản ứng chuỗi PCR với mục tiêu đầu tiên là nhận dạng các trình tự lặp lại đơn giản Sau khi các trình tự lặp lại đơn giản này được nhận dạng, bước tiếp theo là xác định trình tự của ADN và thiết

kế mồi Các trình tự gần kề và các trình tự lặp lại sẽ tạo nên SSR Mồi SSR sau

đó được sử dụng tương tự như các mồi RAPD Kỹ thuật SSR có tiềm năng rất lớn do có khả năng phát hiện tính đa hình rất cao, có thể phân biệt được sự sai khác mà không xác định được bằng các marker khác như RAPD và RFLP Phản ứng không quá tốn kém, tiết kiệm được thời gian và hoá chất Mồi sử dụng trong SSR dài hơn mồi RAPD và dựa trên trình tự đặc trưng và vì thế đáng tin cậy khi phát hiện cùng một lô cút và thích hợp cho việc nghiên cứu bản đồ gen Marker SSR là các lô cút đặc trưng, nên cung cấp nhiều thông tin rất có ích cho việc

phát hiện sự thay đổi các trình tự hiếm SSR là loại marker đồng trội nên đã nhanh chóng thay thế RFLP và RAPD và trở thành công cụ hữu hiệu trong các ứng dụng chọn giống thực vật và nghiên cứu di truyền

Nhược điểm của phương pháp này là quá trình thiết kế mồi đắt, mỗi loại mồi chỉ đặc trưng cho mỗi lô cút đa hình Để xây dựng các cặp mồi đặc hiệu cần tách dòng và đọc trình tự một số lượng lớn các đoạn ADN của genom có chứa SSR Hiện nay, số lượng mồi thiết kế cho các loại cây trồng còn hạn chế, làm giảm hiệu quả của SSR trong việc lập bản đồ gen Một vấn đề khác cũng thường gặp phải trong sử dụng SSR là việc xác định quan hệ giữa các allen với các marker phân tử là rất khó SSR có thể được phân bố ngẫu nhiên trong genom nhưng cũng có khi tập trung lại ở tâm động hay eo thứ cấp của nhiễm sắc thể Điều này hạn chế việc sử dụng các mẫu dò nhiều lô cút trong phân tích liên kết

di truyền và nghiên cứu quần thể [12]

1.5.6 Kỹ thuật ISSR

Kỹ thuật ISSR (interal simple sequence repeat) là kỹ thuật phân tích dựa trên việc nhân bản đoạn ADN nằm giữa 2 vùng lặp đơn giản Với ISSR, mồi là những đoạn lặp đơn giản Nguyên lý của phương pháp này là khuếch đại những đoạn trình tự nằm giữa 2 đầu lặp đơn giản Bộ gen của sinh vật bậc cao có nhiều đoạn ADN lặp lại, các đoạn lặp thường có kích thước ngắn (vài nucleotide), số lần lặp lại là đặc trưng cho mỗi loài, mỗi giống Ví dụ, ở lúa có khoảng gần 1000 lần lặp lại trật tự AC/TG, khoảng trên 300 lần lặp lại trật tự GATA/CTAT Nhiều loài cây một lá mầm như ngô, lúa… lặp lại đoạn CGG/GCC

Phân tích ISSR sử dụng mồi bổ trợ với các vùng microsatellite nên còn gọi là MP-PCR có thể kế thừa mở rộng từ các phân tích microsatellites khác để tăng khả năng lặp lại và giảm tính đa hình so với RAPD Các chỉ thị RAPD, ISSR được dùng nhiều trong lập bản đồ, phân tích di truyền, chọn giống ở thực vật [59]

1.6 Nghiên cứu ngoài nước và trong nước về đa dạng di truyền và tiến hóa phân tử

1.6.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Để đánh giá ảnh hưởng của sự phân cắt nơi sống, điều tra tính đa dạng di truyền và sinh thái ở cả 2 mức độ quần thể và loài quý hiếm trong tự nhiên có vai trò quan trọng góp phần đưa ra chiến lược và các giải pháp bảo tồn một cách hữu hiệu Nhiều nghiên cứu đã đề cập đến mức độ suy giảm tính đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể thực vật liên quan đến quá trình phân cắt nơi sống [39] Các tác giả đã chỉ ra rằng suy giảm tính đa dạng di truyền xảy ra liên quan đến số lượng cá thể thấp trong quần thể tại thời gian nơi sống bị phân cắt

Hệ số thụ phấn cao giữa các cá thể có quan hệ cận noãn cũng là yếu tố làm suy giảm tính đa dạng di truyền Phân cắt nơi sống có thể hạn chế mức độ trao đổi di truyền giữa các quần thể bị cô lập và làm tăng mức độ di truyền khác nhau giữa

biết rõ hơn về sự suy giảm hệ sinh sản và phân bố địa lý của loài Mức độ khác nhau về di truyền trong hoặc giữa các quần thể được chi phối chủ yếu bởi quan

hệ sinh sản: mức độ đa dạng di truyền trong quần thể cao thường xuất hiện khi thụ phấn chéo Kích thước quần thể nhỏ và cô lập ảnh hưởng xấu đến tính đa dạng di truyền và dẫn đến sự tuyệt chủng của một số loài cũng được khám phá

trên cơ sở phân tích isozym

Hai thông số được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu di truyền quần thể

là tỉ lệ phần trăm lô cút đa hình (P) và hệ số gen di hợp tử (H) Nhiều công trình nghiên cứu đã sử dụng hệ số (H) để đánh giá tầm quan trọng của gen dị hợp tử trong quần thể tự nhiên Chẳng hạn, có sự liên quan giữa giá trị H với tốc độ

phát triển của loài thông Pinus torreyana [42], P attenuata [57] Mức độ đa

hình được nhấn mạnh bởi giá trị P đã được sử dụng bởi Andres và Moragues (2003) [16], Lee và cộng sự, (2004) [44] Kỹ thuật isozym đã nhấn mạnh quan điểm Darwin về tiến hoá, cụ thể quá trình tiến hoá xảy ra trong môi trường phức tạp, có thể thay đổi theo hằng số trong suốt thời gian sống, hoặc có thể thay đổi giữa thời gian dài khá ổn định và chu kỳ thay đổi khá nhanh Hamrick và cộng

sự (1979) [32] đã đánh giá mức độ đa dạng di truyền trên cơ sở lịch sử sống của các nhóm loài trên cơ sở tổng kết các kết quả phân tích isozym của nhiều tác giả Chẳng hạn, nhóm duy trì mức độ đa dạng di truyền cao gồm có các loài cây hạt trần, cây lâu năm, cây thụ phấn nhờ gió, cây thụ phấn chéo, cây phân bố rộng và cây có số nhiễm sác thể cao Trái lại, nhóm loài có tính đa dạng di truyền thấp gồm có loài cây bản địa (đặc hữu), cây một năm, cây 2 lá mầm, tự thụ phấn và cây có số nhiễm sắc thể thấp

Đối với các loài thực vật quý hiếm đang bị đe doạ, dẫn liệu phân tích isozym cho phép các nhà khoa học hiểu biết rõ hơn về quá trình sinh thái và tiến hoá của các loài này và góp phần hoạch định chiến lược bảo tồn hữu hiệu Bởi

vì, kết quả này cho phép tìm hiểu mức độ đa hình và đa dạng di truyền tại lô cút liên quan đến biến đổi của môi trường sống của loài và yếu tố nào xác định sự

phân bố di truyền trong quần thể Phân tích isozym có thể biết hậu quả của quá trình sinh thái và tiến hoá liên quan đến thay đổi kích thước quần thể, mối quan

hệ giữa các ổ sinh thái và mức độ đa dạng di truyền ở mức độ quần thể và loài hoặc sự thay đổi kích thước quần thể có thể được xác định bởi biến đổi của môi trường hoặc sự cạnh tranh giữa các loài, và dãy phân bố địa lý thường là kết quả không gian hạn chế của lịch sử phát tán hay giới hạn về sinh lý phát triển và sinh sản Những vấn đề này có thể được giải quyết thông qua các kết quả nghiên cứu

về isozym Phần lớn các loài thực vật quý hiếm thường bị đe doạ liên quan đến kích thước quần thể nhỏ Barrettt và Kohn (1991) [19] đã tập trung vào hậu quả

di truyền trong quần thể nhỏ Tác giả đã chỉ ra rằng mất tính đa dạng di truyền xảy ra khi kích thước quần thể nhỏ liên quan đến sự suy giảm về số alen, đặc biệt các alen hiếm và dẫn đến giảm hệ số gen dị hợp tử trong quần thể Tác giả cũng phân tích nguyên nhân mất tính đa dạng di truyền là hậu quả của quá trình thụ phấn cận noãn trong quần thể nhỏ và cô lập Kết quả này sẽ làm giảm khả năng thích nghi của quần thể với môi trường sống của chúng Rất nhiều công trình nghiên cứu về đa dạng di truyền trên cơ sở phân tích isozym đóng góp rất lớn vào hoạch định chính sách cho công tác bảo tồn loài, đặc biệt các loài quý hiếm đang có nguy cơ tuyệt chủng cao [15] Aigner (2004) [15] nghiên cứu ảnh hưởng sinh thái và di truyền đến quá trình thiết lập kích thước quần thể nhỏ của

loài Dithyrea maritime (Brassicaceae) ở Nam California liên quan đến sự thụ

phấn và sản sinh hạt trên cơ sở sử dụng kỹ thuật isozym Tác giả đã xác định mức độ đa dạng di truyền và số lượng hạt sản sinh trong quần thể thấp có thể liên quan đến sự viếng thăm của loài côn trùng tham gia thụ phấn và mật độ cá thể thấp trong quần thể Một công trình khác đề cập đến ảnh hưởng của sự phân

cắt đến cấu trúc di truyền quần thể của loài thực vật đặc hữu Brongniartia

vazquezii đang bị đe doạ trong rừng khô nhiệt đới ở miền Trung Mexico [18]

Sáu lô cút đa hình đã được sử dụng để đánh giá các thông số đa dạng di truyền Chẳng hạn, hệ số cận noãn đã khám phá ra sự thiếu hụt gen di hợp tử ở cả tập

hợp các cá thể trưởng thành và cá thể non tái sinh trong tất cả các quần thể Tác giả kết luận rằng phân cắt nơi sống đã phá vỡ cấu trúc quần thể trước đó

Để nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể và loài thực vật, ngoài kỹ thuật isozym, còn có kỹ thuật DNA với các phương pháp RAPD, SSR, AFLP, RFLP, đặc biệt phương pháp SSR cũng đã được áp dụng trong những năm gần đây

Nghiên cứu cấu trúc di truyền và mức độ trao đổi di truyền loài Eugenia

dysenterica ở Brazil bằng chỉ thị SSR trên cơ sở phân tích 116 cá thể thuộc 10

quần thể [50] Với 10 cặp mồi SSR, các tác giả đã xác định mức độ đa dạng di truyền cao với 10,4 alen trung bình cho một lô cút, hệ số gen dị hợp tử kỳ vọng 0,442 và mức độ trao đổi di truyền thấp giữa các quần thể của loài 0,680 Kết quả về mức độ trao đổi di truyền và hậu quả của nó có thể đe doạ cấu trúc di truyền trong quần thể Nghiên cứu ảnh hưởng của phương thức thụ phấn cận

noãn, tính đa dạng di truyền và kích thước quần thể của loài Lupinus perennis

(Fabaceae) đang bị đe doạ bằng chỉ thị SSR [69] Tác giả đã điều tra 10 quần thể trên cơ sở phân tích 7 lô cút SSR và chỉ ra rằng mặc dù giá trị gen dị hợp tử là tương đương nhau ở cả 2 quần thể nhỏ và lớn, nhưng quần thể nhỏ có số alen thấp hơn và kết luận rằng thụ phấn gần là hậu quả của quan hệ cận noãn và xói mòn di truyền Một nghiên cứu khác được tiến hành bởi Dangi và cộng sự

(2004) [24] về đánh giá tính đa dạng di truyền của 2 loài Trigonella

foenungrecum và T caerulea dùng chỉ thị ISSR và RAPD Kết quả nghiên cứu

đã chỉ ra rằng T caerulea duy trì mức độ đa dạng di truyền cao hơn so với T

foenungraecum Phân tích ma trận về hệ số tương đồng di truyền trên cơ sở dẫn

liệu về ISSR và RAPD cho cả 2 loài và chỉ ra mối quan hệ tuyến tính cao cho

mỗi loài Ví dụ, hệ số tuyến tính r =0,78 tại p =0,001 cho loài T foenungraecum

và r =0,98 với p =0,001 cho loài T caerulea Kết quả nghiên cứu này đã củng cố giả thiết về trung tâm đa dạng và nguồn gốc của chi Trigonella ở miền Đông và

Trung Địa Trung Hải Các kết quả nghiên cứu dùng kỹ DNA đã khẳng định

tương tự như một số công trình nghiên cứu trước dùng chỉ thị isozym Nghiên

cứu đa dạng di truyền của một số loài thông cũng được đề cập bởi một số tác giả

như [37], [66], [43], [41] Các kết quả nghiên cứu đã phản ánh mức độ suy giảm tính đa dạng di truyền liên quan đến sự hạn chế về dãy phân bố địa lý, kích thước quần thể nhỏ và bị cô lập ở mức độ quần thể và loài của một số loài thông

như loài Abies sibirica [41], A flinckii, A guatemalensis, A hickeli, A religiosa [17], Picea breweriana [41] Glyptostrobus pensilis [45] Tuy nhiên tính đa dạng cao đã được khám phá ở một số loài thông như Pinus [21], Cedrus atlantica

[62], Pinus strobus [55] và Pinus brutia [40]

Để nghiên cứu mối quan hệ họ hàng giữa các taxon trong thực vật, rất nhiều tác giả sử dụng vùng gen nhân hoặc lục lạp Kỹ thuật sinh học phân tử đã được sử dụng như là công cụ để khám phá mối quan hệ tiến hoá giữa các taxon với nhau trong cùng một chi, họ và bộ ADN được xem là phù hợp cho công việc nghiên cứu này bởi vì mức độ khác nhau về thành phần nucleotide duy trì tính bảo thủ ở các mức độ taxon Nghiên cứu mối quan hệ di truyền của các loài thông trên cơ sở giải mã vùng 18S-rDNA đã được tiến hành bởi Stefanovic và cộng sự vào năm 1998 [56] Kết quả đã khẳng định họ Thông đỏ (Taxaceae) thuộc bộ Thông (Coniferales) Trước đó Flori (1951) [29], họ này được xếp tách thành bộ riêng bộ Thông đỏ (Taxales) và có hướng tiến hoá song song với bộ Thông (Coniferales) Trong bộ Thông, họ Thông Pinaceae có thành phần loài đa dạng nhất và nhóm khởi đầu trong bộ Thông Tác giả cũng chỉ ra họ Thông đỏ (Taxaceae) có quan hệ mật thiết với họ Đỉnh tùng (Cephalotaxaceae) Nghiên cứu vùng ITS-rDNA (Internal Transcribed Spacer) của 47 loài thuộc chi Thông

Pinus (Pinaceae), Liston và cộng sự (1999) [46] đã chỉ ra mối quan hệ di truyền

giữa các loài Thông tại mỗi chi phụ Pinus và Strobus Chẳng hạn, nhóm Pinus

halepensis, P pinea, P cannariensis và P pinaster duy trì giá trị bootstrap rất

thấp (17%) Nghiên cứu vùng gen ITS-rDNA của 34 loài thuộc chi Salsola và

các chi khác có quan hệ gần gũi (Halothamnus, Climacoptera, Girgensohnia,

Halocharis và Haloxylon), cùng với 2 loài thuộc tông Camphorosmeae

(Camphorosma lessingii, Kochia prostrate) và Atripliceae (Atriplex spongiosa),

tác giả Pyankov và cộng sự (2001) [54] đã kết luận nguồn gốc và tiến hoá của 2

nhánh chính thuộc tông Salsoleae liên quan đến quá trình quang hợp để biến đổi Các-bon thông qua các axít tetracacbonxilic cho việc hình thành các chất NAD-

ME và NADP-ME, tương ứng Hai nhóm này khác nhau về tổng hợp chất C4 trong lá cây và đặc tính cấu trúc và quang hợp trong lá mầm Có rất nhiều nghiên cứu về nguồn gốc tiến hoá của thực vật trên cơ sở phân tích một số vùng rDNA [22] Một số nghiên cứu về cây phát sinh phả hệ trên cơ sở vùng gen 18S

và 28S đã chỉ ra mối quan hệ di truyên của 7 họ thuộc bộ Thông Coniferales [56] Hai họ Thông đỏ Taxaceae và Hoàng đàn Cupressaceae hình thành một nhánh tiến hoá đơn Cheng và cộng sự (2000) [23] đã sử dụng gen lục lạp và ITS

để xác định mức độ tiến hoá của 6 chi, Taxus, Pseudotaxus, Austrotaxus,

Amentotaxus, Torreya và Cephalotaxus thuộc 2 họ Thông đỏ Taxaceae và Đỉnh

tùng Cephalotaxaceae Từ Cephalotaxus hình thành lên hai nhánh tiến hoá gồm

Torreya/Amentotaxus và Taxus/Pseudotaxus/Austrotaxus Phân tích gen lục lạp

và ITS, và kết hợp với đặc điểm hình thái các tác giả Little và cộng sự (2004)

[47] và Xiang và Li 2005) [68] đã chỉ ra chi Callitropsis hình thành một nhánh

tiến hoá riêng Little (2006) [48] kết hợp các đặc điểm giải phẫu, sinh hoá, hình thái vi cấu trúc, đặc điểm của cơ quan sinh sản và đặc điểm hình thái thực vật cùng với dẫn liệu sinh học phân tử, vùng gen matK, NEEDLY intro2, ITS, rbcL

và trnl đã xây dựng mối quan hệ tiến hoá trong họ phụ Cupressoidae Các chi

Callitropsis, Cupressus và Juniperus hình thành một nhánh tiến hoá đơn Loài

thuộc thế giới cũ của chi Cupressus là chị em của Juniperus Chi Callitropsis và

16 loài thuộc thế giới mới của Cupressus được xác định là nhóm chị em của các loài thuộc thế giới mới của nhánh tiến hoá với 2 chi Cupressus và Juniperus

1.6.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam, phần lớn các công trình nghiên cứu chủ yếu về phân loại và khu hệ thực vật Nguyễn Tiến Bân (2003) [1] đã tổng kết các kết quả nghiên cứu

về thực vật và xuất bản tập sách “Danh sách các loài thực vật Việt Nam” Trên

cơ sở đánh giá hiện trạng loài, các nhà khoa học đã đưa ra danh sách các loài

thực vật đang bị đe doạ [6], đặc biệt Sách Đỏ Việt Nam, 2007 [2], được xuất bản bởi Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam và đưa ra một số biện pháp bảo tồn nguyên vị và chuyển vị Rất ít công trình nghiên cứu về đa dạng di truyền quần thể và loài thực vật, đặc biệt các loài đang bị đe doạ tuyệt chủng Một số công trình mới chỉ đề cập đến đa dạng di truyền ở mức độ cá thể, tuy nhiên cũng chỉ dừng lại ở mức đánh giá đa hình trong chọn giống cây trồng: như Trần Quốc Trọng, Nguyễn Đức Thành và Nguyễn Việt Cường (2005) [14] nghiên cứu quan

hệ di truyền của một số xuất xứ Tràm (Melaleuca cajuputi) từ các vùng khác

nhau bằng chỉ thị RAPD và DNA lục lạp Duy và cộng sự (2010) [4] nghiên cứu

đa dạng di truyền về loài Thủy tùng bằng chỉ thị SSR Kết quả nghiên cứu đã chỉ

ra cần đẩy mạnh biện pháp bảo tồn chuyển vị

Để nghiên cứu mối quan hệ họ hàng giữa các taxon trong thực vật, Tam

và Trang (2012) [60] đã sử dụng vùng gen 18S để xác định mối quan hệ tiến hoá của 6 chi thuộc họ Hoàng đàn Cupressaceae ở Việt Nam Dẫn liệu chỉ ra 2

nhánh tiến hoá có quan hệ mật thiết với nhau, Xanthocyparis

vietnamesis/Cupressus tonkinensis và Fokienia hodginsii/Cupressus rupestris/C formasana Xanthocyparis noothatensis có quan hệ gần gũi với loài thuộc chi

Cupressus Fokienia hodginsii cùng nhánh tiến hoá với chi Calocedrus

1.7 Một số đặc điểm của loài Thông đỏ bắc

* Phân loại khoa học

Giới (regnum): Plantae

Ngành (phylum): Pinophyta

Lớp (class): Pinopsida

Bộ (order): Pinales

Họ (familia): Taxaceae

Chi (genus): Taxus

Loài (species): chinensis

a b

Hình 1.1 Hình ảnh cây Thông đỏ bắc (a - cây con tái sinh ở Bát Đại Sơn,

b - Cây trưởng thành ở Sa Pa)

* Mô tả:

Thông đỏ bắc (Taxus chinensis) là cây gỗ thường xanh, cao tới 20m Nhánh

con mảnh, màu lục, lá ngắn, hình dải, dài 1,5 - 2cm, rộng 2,5 - 3mm, thót nhọn sắc

ở đầu, cong nhiều hay ít ở gốc Lá mọc so le, hầu như không cuống, xếp thành 2 hàng Hoa khác gốc Nón đực ở nách lá, hình cầu, kèm theo ở gốc những lá bắc lợp; nón cái gồm những nhánh ngắn, có vẩy dạng gai lợp, xếp thành 4 dãy đứng Hạt hình trứng dài, nằm trong 1 đĩa dạng đấu, màu đỏ, nạc, có thịt

* Nơi sống:

Loài phân bố ở Trung Quốc và Bắc Việt Nam, thường gặp ở độ cao 1300 – 2000m, trong rừng rậm nhiệt đới thường xanh mưa màu ẩm, trên sườn và các đỉnh núi đá vôi, có gặp ở Quản Bạ, Đồng Văn (Hà Giang), Sapa (Lào Cai), Bảo Lạc (Cao Bằng), Yên Châu (Sơn La), Hang Kia-Pà Cò (Hoà Bình) Rất thích hợp với vùng núi đá vôi Có thể trồng bằng cách giâm cành

* Thành phần hoá học:

Lá, chồi, hạt đều chứa chất độc chính là alcaloid taxine, 1 hỗn hợp gồm 2 alcaloid tinh là taxine A và taxine B, trong đó taxine B là chất chủ yếu Lá chứa các alcaloid taxine, taxinine, vết của ephedrine Còn có 1 glucoid taxicatin Vỏ thân chứa tanin, hạt giàu dầu béo

* Công dụng:

Lá được sử dụng làm thuốc trị hen suyễn, viêm phế quản, nấc; còn dùng chữa tiêu hoá không bình thường, động kinh và như là chất kích dục Cây được dùng làm thuốc duốc cá Ở Trung Quốc, cành, vỏ, lá còn được dùng trị thực tích, bệnh giun đũa

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu:

Để đánh giá mức độ đa dạng di truyền cả hai mức độ quần thể và loài, 148

mẫu lá từ 6 quần thể loài Thông đỏ bắc (Taxus chinensis) đã được thu thập

(bảng 2.1) Xác định vị trí phân loại của 18 loài Thông thuộc bộ Thông (Coniferales) ở Việt Nam trên cơ sở xác định trình tự nucleotide của 3 vùng gen rpoC1, rbcL và matK, chúng tôi đã tiến hành thu thập một mẫu lá hoặc vỏ cây tươi cho mỗi loài nghiên cứu với các thông tin về địa điểm thu thập (bảng 2.2)

Các hóa chất dùng trong nghiên cứu bao gồm:

Hóa chất tách chiết và kiểm tra DNA tổng số: NaCl, CTAB, EDTA,

Tris-HCl, β-Mercaptoethanol, Isopropanol, Sodium acetate 3M, ethanol 100%, 70%,

Enzym Rnase, Agarose 1%, đệm TAE 1X, Ethidium bromide

Hóa chất nhân bản và điện di sản phẩm PCR: Đệm PCR, MgCl2, dNTP, Taq polymerase, Acrylamide, Bis – Acrylamide, Temed, Amonium fersunfate,

TAE 10X, TAE 1X

Hóa chất xác định trình tự nucleotide: Tinh sạch sản phẩm PCR dùng kít:

Quick Gel Extraction Kit QIAGEN, Dye Teminator Cycle Sequencing Kit

Các thiết bị sử dụng:

Máy PCR Syste m 9700 (Applied Biosystem, Mỹ); máy ly tâm của hãng Hitachi (Nhật bản); bộ điện di Nytechnich (Anh); máy chụp ảnh gel (Cleaver, Đức); máy ổn nhiệt (Memmert, Đức) Giải mã trình tự trên máy ABI PRISM®

3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems)

Các cặp mồi dùng trong nghiên cứu:

Để đánh giá mức độ đa dạng di truyền giữa quần thể: 21 cặp mồi

microsatellite (cpSSR) được sử dụng thì có sáu cặp mồi cpSSR có kết quả rõ rệt, được sử dụng để đánh giá mức độ khác nhau về di truyền giữa các quần thể (bảng 2.3)

Để xác định vị trí phân loại giữa các taxon : Cặp mồi nhân bản vùng gen

lục lạp bao gồm: Cặp mồi rpoC1 được sử dụng theo thiết kế của Chương trình

DNA barcodes giai đoạn 1 Cặp mồi rbcL được thiết kế dựa trên trình tự vùng

gen rbcL của loài Taxus brevifolia lấy Ngân hàng gen Quốc tế (mã số:

AF249666) Cặp mồi matK được thiết kế dựa trên trình tự vùng gen matK của

loài Taxus wallichiana var chinensis (HM590991) Trình tự nucleotide, kích

thước lý thuyết và nhiệt độ bắt mồi (bảng 2.4)

Bảng 2.1 Địa điểm và số mẫu thu thập cho phân tích cpSSR

23o15’

Bắc

105o17’ Đông

Bát Đại Sơn 32 Bát Đại Sơn, Quản

Bạ, Hà Giang 1250 m

23o08’

Bắc

104o56’ Đông

Hoàng Liên 33 Hoàng Liên, Sa Pa,

Lào Cai 1950 m

22o12’

Bắc

103o05’ Đông

Bảo Lạc 6 Xuân Trường, Bảo

Lạc, Cao Bằng 1895 m

22o52’

Bắc

105o50’ Đông

Hang Kia 14 Hang Kia – Pà Cò,

Mai Châu, Hoà Bình 1047 m

20º44’

Bắc

104º55’ Đông

Mường Lựm 28 Mường Lựm, Yên

Châu, Sơn La 1550 m

21o01’

Bắc

104o30’ Đông

Bảng 2.2 Danh sách các loài Thông dùng xác định vị trí phân loại

Hoàng đàn hữu liên rủ

Hoàng đàn hữu liên tía

Sa mu dầu Cunninghamia

lanceolata var konishii

Bát Mọt, Thường Xuân, Thanh

Dacrydium elatum Vườn thực vật, Phân Viện Lâm

Thông nàng

Dacrycarpus imbricatus Hang Kia, Mai Châu, Hòa Bình x x x

Kim giao nam

Nageria wallichiana Vườn Thực vật, Viện Sinh học

Thông la hán

Podocarpus chinensis Vườn thực vật, Viện Sinh học nhiệt

Thông tre lá dài

Thông tre lá ngắn

P brevifolius (P pilgeri) Bát Đại Sơn, Quản Bạ, Hà Giang x x x

Bảng 2.3 Trình tự các nucleotide của 6 cặp mồi cpSSR

tài liệu

[65]

[65]

[65]

[65]

[65]

[65]

Bảng 2.4 Các cặp mồi sử dụng để xác định vị trí phân loại giữa các taxon

(bp)

(Tm)

0

C

2.2 Địa điểm, thời gian và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu

Hình 2.1 Bản đồ chỉ ra địa điểm nghiên cứu loài Thông đỏ bắc

Đề tài sẽ tập trung nghiên cứu tại 5 tỉnh trong cả nước, những nơi còn duy trì sự tồn tại của loài Thông đỏ bắc như: Quản Bạ, Đồng Văn (Hà Giang), Sapa (Lào Cai), Bảo Lạc (Cao Bằng), Yên Châu (Sơn La), Hang Kia-Pà Cò (Hoà Bình) (hình 2.1)

2.2.2 Thời gian nghiên cứu

Đề tài thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 01 năm 2009 đến nay

2.2.3 Phương pháp khảo sát thực địa

Kích thước quần thể của loài Thông đỏ bắc là rất nhỏ, do đó các thông số hình thái cá thể trong mỗi quần thể nghiên cứu được quan sát và xác định trực tiếp tại hiện trường, bao gồm chiều cao và đường kính ngang ngực Khoảng cách giữa các cá thể nghiên cứu trong quần thể nghiên cứu cũng được xác định trực

tiếp

Nơi sống của mỗi quần thể cũng được mô tả bao gồm kiểu thảm thực vật, cấu trúc phân tầng của thảm thực vật Loài thực vật đặc trưng cho mỗi kiểu thảm thực vật Các đặc trưng về đặc điểm khí hậu và địa hình và loại đất cũng được ghi nhận Đặc điểm nơi sống và số mẫu thu thập cho phân tích đa dạng di truyền quần thể và loài được trình bày ở bảng 2.1 Để xác định chính xác tên khoa học

ở mỗi nơi nghiên cứu, mẫu tiêu bản được thu thập và được lưu giữ tại Phòng Sinh học, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam

Ngoài ra, tại thực địa người dân địa phương cũng được phỏng vấn về nghề nghiệp, thu nhập và nhận thức bảo tồn loài quý hiếm đang bị đe dọa tại những khu vực nghiên cứu

Vị trí nghiên cứu được xác định trên cơ sở bản đồ địa hình tỉ lệ 1:50.000

và định vị khu vực nghiên cứu bằng máy định vị GPS

2.2.4 Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

2.2.4.1 Tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số được tách chiết từ lá hoặc vỏ cây tươi bằng phương pháp CTAB [25] có cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm Mẫu được nghiền bằng cối sứ có sử dụng nitơ lỏng Xác định nồng độ DNA bằng máy quang phổ kế hoặc điện di trên gel agarose 0,8% Sau khi loại RNA bằng enzyme RNAase, nồng độ DNA được pha loãng đến 10ng/µl

2.2.4.2 Nhân bản DNA

Để xác định đa dạng di truyền quần thể và loài, thể tích mỗi phản ứng

PCR là 25 µl, trong đó chứa các thành phần gồm dung dịch đệm 1x PCR; 2,5mMgCl2, 2mM dNTPs; 0,5 pmol cho mỗi mồi xuôi hoặc ngược; 50ng DNA

tổng số và 0,5U Taq polymerase Quá trình nhân bản được tiến hành trên máy

Gene amp PCR system 9700 theo chu trình nhiệt sau: (1) Biến tính ban đầu:

940C trong 3 phút; (2) Biến tính: 940C trong 1 phút; (3) Bắt cặp: 550

C trong 1 phút; (4) Kéo dài: 720C trong 1 phút; (5) Lặp lại (2) đến (4): 40 chu kỳ; (6) Phản ứng kết thúc hoàn toàn: 720C trong 10 phút; (7) Giữ sản phẩm ở 40C Điện di sản phẩm trên gel Polyacrylamide 5% trong 40 ml dung dịch đệm 1xTAE, nhuộm Ethidium bromide và chụp ảnh trên máy soi gel của hãng CLEARVER

Để xác định vị trí phân loại giữa các taxon, phản ứng PCR (polymerase

chain reaction) được tiến hành với thể tích 25µl, trong đó chứa các thành phần với thành phần đệm PCR, 2,5mM MgCl2, 2mM cho mỗi dNTP, 0,5 pmol cho một mồi xuôi hoặc ngược, 0,5U Taq DNA polymerase và 50ng DNA tổng số Nhân bản DNA được tiến hành trên máy Gen Amp PCR systems 9700 theo chu trình sau: (1) 94oC: 3 phút (2) 94oC: 1 phút, 55oC (rpoC1 và rbcL) và 56oC (matK): 1 phút, (4) 72oC: 1 phút, lặp lại 40 chu kỳ từ (2) đến (4) và (5) 72o

C: 10 phút Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% trong 40ml dung dịch đệm 1xTAE Sản phẩm được tinh sạch bằng PCR Purification Kít (Hãng QIAGEN) Trước khi đọc trình tự nucleotide trên máy, sản phẩm PCR được tinh sạch dùng kít sephadex G50 (Sigma) Đọc trình tự nucleotide vùng gen rpoC1, rbcL và matK được xác định với kít BigDye terminator v3.1 và đọc trình tự trên máy

Avant 3100 Automated DNA sequencer Mồi xuôi rpoC1-F, rbcL-F và matK-F được sử dụng để giải mã cho các vùng gen rpoC1, rbcL và matK

2.2.4.3 Phân tích số liệu

Đánh giá các thông số đa dạng di truyền quần thể và loài của loài Thông

đỏ bắc: tần số alen và haplotyp sử dụng phần mềm Arlequin 3.1 [28], các alen cho một lô cút: số alen trung bình (A), số alen hữu hiệu (Ae), số alen hiếm (Ap)

và các thông số đa dạng di truyền quần thể: phần trăm lô cút đa hình (P), chỉ số

đa dạng di truyền Shannon (I), hệ số gen dị hợp tử quan sát (Ho), Hệ số gen dị hợp tử kỳ vọng (He) và hệ số tương đồng và hệ số khoảng cách di truyền giữa các quần thể dùng phần mềm GenAIEx [53] Kiểm định giả thiết sự cho các lô cút đa hình và giữa các quần thể được thực hiện ở mức ý nghĩa p=0,05 được phân tích dùng phần mềm Arlequin 3.1 Các hệ số thống kê F và dòng gen giữa các quần thể cũng được thực hiện Phân tích AMOVA (variance components in the analysis of molecular variance) được thực hiện trên Arlequin 3.1 Dẫn liệu cũng được phân tích bằng phần mềm Winboot [71] để xây dựng mối quan hệ di truyền giữa các cá thể trong mỗi loài nghiên cứu

So sánh sự khác nhau về vị trí các nucleotide giữa các cặp loài trên cơ sở trình tự nucleotide của gene rpoc1, rbcL và matK dùng ClustalW [63] và GenDoc2.5 [52] Phần mềm MEGA4 [61] và Paup* [58] được sử dụng để phân tích dữ liệu

Chương 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Hiện trạng quần thể, loài Thông đỏ bắc

3.1.1 Phân bố của loài Thông đỏ bắc

Nguyễn Tiến Hiệp và cộng sự (2004) [6] đã xác định vùng phân bố của

Thông đỏ bắc (Taxus chinensis) ở Hà Giang, Cao Bằng, Lào Cai, Sơn La và Hoà

Bình Dẫn liệu khảo sát của chúng tôi vào năm 2009 đến nay đã xác định vị trí phân bố của loài Thông nghiên cứu:

Loài Thông đỏ bắc được tìm thấy ở tầng tán và dưới tán trong rừng á

nhiệt đới trên đường dông và sườn núi đá vôi với độ cao trên 1000 m Đất được hình thành do quá trình phong hoá của đá mẹ như đá sét, sa thạch Chế độ khí hậu gió mùa vùng núi, với 2 mùa rõ rệt, mùa đông khô và lạnh, mùa hè nóng,

ẩm Nhiệt độ trung bình năm dao động từ 15oC ở Hoàng Liên và Bát Đại Sơn đến 23oC ở Hang Kia - Pà Cò Lượng mưa hàng năm từ 1247 mm ở Bảo Lạc đến

2763 mm ở Hoàng Liên Phần lớn, Thông đỏ bắc được tìm thấy trong những mảnh rừng thứ sinh phục hồi, nơi bị tác động mạnh do khai thác gỗ như ở Hang Kia (Mai Châu, Hòa Bình), Bát Đại Sơn (Quản Bạ, Hà Giang), trong mảnh rừng nhỏ còn sót lại ở Xuân Trường (Bảo Lạc, Cao Bằng), Mường Lựm (Yên Châu, Sơn La), rừng thứ sinh núi đá vôi đang được phục hồi ở Thài Phìn Tủng (Đồng Văn, Hà Giang), hoặc một số cây Thông đỏ bắc còn sót lại sau khi rừng bị phá hủy hoàn toàn để mở rộng đất nông nghiệp ở khu vực Ô Quý Hồ (Vườn Quốc gia Hoàng Liên, Sa Pa, Lào Cai) và khu vực xã Xuân Trường (Bảo Lạc, Cao Bằng) Thông đỏ bắc cũng được trồng trong chậu và vườn nhà ở Thị trấn Sa Pa

để bán cho khách du lịch