quy trình sản xuất amylase từ vi sinh vật

Ngoài những ứng dụng tiêu biểu được trình bày ở trên, enzyme amylase còn có ứng dụng trong sản xuất giấm, bột ngọt, bánh kẹo, nước trái cây… Ngày nay người ta đang nghiên cứu các nguồn a

Nguyễn Thị Kim Ngân Trương Thị Thúy An Phạm Trúc Ly

TP.HCM, Tháng 12/2012 LỜI MỞ ĐẦU

Enzyme amylase là một trong những enzyme được quan tâm nghiên cứu sớm

và nhiều nhất hiện nay Các ứng dụng của enzyme trong nhiều lĩnh vực khác nhau ngày càng được quan tâm nghiên cứu Ngoài những ứng dụng tiêu biểu được trình bày

ở trên, enzyme amylase còn có ứng dụng trong sản xuất giấm, bột ngọt, bánh kẹo, nước trái cây… Ngày nay người ta đang nghiên cứu các nguồn amylase có chất lượng cao và có thể sản xuất theo quy mô công nghiệp đồng thời khắc phục những hạn chế của các phương pháp sản xuất tạo enzyme amylase năng suất cao Ở Việt Nam bước đầu đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng enzyme amylase trong chế biến nông sản, thực

Hiện nay, α-amylase là một trong những enzyme được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp thực phẩm, chăn nuôi thú y, chẩn đoán bệnh…Trong công nghiệp thực phẩm, α-amylase đóng vai trò đặc biệt quan trọng

Thông qua sự thủy phân tinh bột, α-amylase tạo ra những sản phẩm có giá trị dinh dưỡng như dextrin, maltose, glucose…

Trước đây, người ta thu nhận α-amylase từ malt là chủ yếu Ngày nay, với nền công nghiệp phát triển mạnh kéo theo nhu cầu về α-amylase tăng cao nên việc áp dụng những kỹ thuật tiến bộ trong nuôi cấy vi sinh vật để thu dễ dàng hơn với lượng lớn α-amylase là rất cần thiết

ứng hóa học đó Chúng có khả năng xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học nhất định

và đảm bảo cho các phản ứng xảy ra theo một chiều hướng nhất định với tốc độ nhịp nhàng trong cơ thể sống

Enzyme có trong hầu hết các loại tế bào của cơ thể sống Chính do những tác nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên Enzyme còn được gọi là các chất xúc tác sinh học (biocatalysators) nhằm để phân biệt với các chất xúc tác hóa học

Chúng là chất xúc tác sinh học không chỉ có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng, phát triển của mọi sinh vật mà nó còn giữ vai trò rất quan trọng trong công nghệ chế biến thực phẩm, trong y học, trong kỹ thuật phân tích, trong công nghệ gen và bảo vệ mội trường

1.1.2 Enzyme Amylase

Amylase là một hệ Enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật Các Enzyme này thuộc nhóm Enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước

Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và dextrin hạn chế Các Enzyme Amylase có trong nước bọt (còn được gọi là ptyalin), trong dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm sợi, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn Trong nước bọt của người có ptyalin nhưng ở một số loài động vật có vú thì không có như ngựa, chó, mèo Ptyalin bắt đầu thủy phân tinh bột từ miệng và quá trình này hoàn tất ở ruột non nhờ Amylase của tuyến tụy (còn được gọi là amylopsin) Amylase của malt thủy phân tinh bột lúa mạch thành disaccharide làm cơ chất cho quá trình lên men bởi nấm men

Amylase là một trong những loại Enzyme được ứng dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y tế, và nhiều lĩnh vực kinh tế khác, đặc biệt là trong ngành công nghiệp thực phẩm

1.2 Nguồn gốc

1814: Kirchoff, Saint Petercburg chứng minh hạt lúa mạch nảy mầm có tác dụng chuyển hóa tinh bột thành đường ở nhiệt độ từ 4000C – 6000C

Năm 1833, Payen và Perso (Pháp) thêm cồn vào dịch chiết này, thu được kết tủa có khả năng phân giải tinh bột thành đường, và đặt tên là Diastase (xuất phát từ tiếng Hy Lạp, diastatics, có nghĩa là phân giải, đó là Amylase) Sau này theo đề nghị của Duclo, Enzyme phân giải tinh bột được gọi là Amylase.

Năm 1851: Leuchs đã phát hiện nước bọt cũng có khả năng phân giải tinh bột thành đường Sau đó, các Enzyme Amylase trong nước bọt, trong dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn bắt đầu được quan tâm nghiên cứu

Năm 1862, Danilevxki đã tách được Amylase của tuyến tụy bằng phương pháp hấp thụ chọn lọc

Năm 1949, Schwimmer đã xác định được số chu chuyển của α-Amylase là

Hiện nay các nước trên thế giới sản xuất hàng trăm tấn chế phẩm Enzyme, trong đó Nhật là nước có truyền thống lâu đời nhất, sau đó đến Anh, Pháp, Mỹ, Đan Mạch, Thụy Điển, đặc biệt hãng Novo của Đan Mạch là 1 trong những hãng sản xuất Enzyme nổi tiếng trên thế giới Bên cạnh đó trong những năm gần đây các nước Đông Âu và Trung Quốc cũng bắt đầu nghiên cứu và sản xuất Enzyme

Nếu như ở Tây Âu mạch nha từ lúa mạch là nguồn Enzyme chủ yếu cho việc chuyển hóa tinh bột thành đường, thì ở Viễn Đông Amylase thường được sản xuất từ nấm mốc trên môi trường nuôi cấy là các loại ngũ cốc có chứa tinh bột Như hãng Novo đã có nhiều chế phẩm Enzyme Amylase đang được sử dụng rộng rãi trong các

ngành công nghiệp như: Công nghiệp sản xuất rượu bia, công nghiệp sản xuất bột giặt, công nghiệp giấy…

1.3 Phân loại

Hiện nay, có sáu loại Enzyme Amylase được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase ( Enzyme nội bào ) và Exoamylase ( Enzyme ngoại bào )

- Endoamylase : gồm có α-Amylase (EC 3.2.1.1) và nhóm Enzyme khử nhánh

Nhóm Enzyme khử nhánh này được chia thành hai loại: khử trực tiếp là pullulanase ( hay α-dextrin 6-glucanohydrolase ) (EC 3.2.1.41); khử gián tiếp là transglucosylase (hay oligo-1,6-glucosidase) (EC 3.2.1.20) và amylo-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.10) Các Enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide

- Exoamylase Đây là những Enzyme thủy phân tinh bột tử đầu không khử của

chuỗi polysaccharide Nhóm này gồm có:

+ β-Amylase (EC 3.2.1.2)

+ Amyloglucosidase (glucoamylase hay γ-Amylase) (EC 3.2.1.3)

AmylaseExoamylaseβ-Amylaseγ-Amylase

EndoamylaseEnzym khử nhánh

α-Amylase

Khử trực tiếpα-dextrin 6-glucanohydrolase

(pullulanase)Khử gián tiếpoligo-1,6-glucosidase(transglucosylase)

Và amylo 1,6-glucosidase

Các loại Enzyme endoAmylase và exoAmylase

* Sự khác biệt giữa các loại Enzyme Amylase:

- Các loại Enzyme Amylase không chỉ khác nhau ở đặc tính mà còn khác nhau

ở pH hoạt động và tính ổn định với nhiệt

- Tốc độ phản ứng của Amylase phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, mức độ polyme hóa của cơ chất Các Enzyme Amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ có tính chất, cơ chế tác dụng và sản phẩm cuối cùng của quá trình thủy phân khác nhau

- Amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ có thành phần, tính chất, nhiệt độ hoạt động, pH tối ưu và các đặc điểm thủy phân khác nhau.

1.3.1 Enzyme α-Amylase (α-1,4-glucanohydrolase) (EC 3.2.1.1)

a) Cấu tạo

Enzyme α-Amylase là protein có phân tử lượng thấp, thường nằm trong khoảng 50.000 đến 60.000 Dal Có một số trường hợp đặc biệt như α-Amylase từ loài vi

khuẩn Bacillus macerans có phân tử lượng lên đến 130.000 Dal Đến nay người ta đã

biết rất rõ các chuỗi acid amin của 18 loại α-Amylase nhưng chỉ có 2 loại α-Amylase

là taka-Amylase từ Apergillus oryzae và α-Amylase của tụy lợn được nghiên cứu kỹ

về hình thể không gian cấu trúc bậc 3 Mới đây các nghiên cứu về tính đồng nhất của chuỗi mạch acid amin và về vùng kị nước cho thấy các chuỗi mạch acid amin của tất

cả các Enzyme α-Amylase đều có cấu trúc bậc 3 tương tự nhau

Cấu trúc không gian của α-Amylase

b) Cơ chế tác dụng của α-Amylase

α-Amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều điềm rất giống nhau α-Amylase

có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất (tinh bột hoặc glycogen) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả α-Amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên song với tốc độ rất chậm

Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-Amylase là quá trình hai giai đoạn:

+ Giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin ), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh)

+ Giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): Các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine Các chất này

bị thủy phân rất chậm bởi α-Amylase cho tới disaccharide và monosaccharide Dưới tác dụng của α-Amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6

- 7 gốc glucose (vì vậy, người ta cho rằng α-Amylase luôn phân cắt amylose thành từng đoạn 6 - 7 gốc glucopiranose 1)

+ Sau đó, các polyglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose, maltotriose

và maltose Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose Tác dụng của α-Amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên (72% maltose và 19% glucose) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%

Tóm lại, dưới tác dụng của α-Amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp Tuy nhiên, thông thường α-Amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không cho màu với Iodine và một ít maltose Khả năng dextrin hóa cao của α-Amylase là tính chất đặc trưng của nó Vì vậy, người ta thường gọi loại Amylase này là Amylase dextrin hóa hay Amylase dịch hóa

Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của α-Amylase:

+ Giai đoạn dextrin hóa:

Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp

+ Giai đoạn đường hóa:

Dextrin tetra và trimaltose di & monosaccharide

Amylase oligosacharide poliglucose

Maltose maltotriose maltotetrose

c) Đặc tính α -Amylase

α-Amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi loại α-Amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng α-Amylase là một protein giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử Enzyme:

+ α-Amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine

+ Trọng lượng phân tử của α-Amylase nấm mốc: 45.000-50.000 Da (Knir 1956; Fisher, Stein, 1960 )

+ Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng

+ Protein của các α-Amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline.Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH = 4,2 - 5,7 ( Bernfeld P, 1951 )

α-Amylase là một metaloEnzyme Mỗi phân tử α-Amylase đều có chứa 1-30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1 - 6 nguyên tử gam/mol Ca tham gia vào

sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của Enzyme, duy trì hoạt động của Enzyme (Modolova, 1965) Do đó, Ca còn có vai trò duy trì sự tồn tại của Enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các Enzyme phân giải protein Nếu phân tử α-Amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy

α-Amylase

phân cơ chất α-Amylase bền với nhiệt độ hơn các Enzyme khác Đặc tính này có lẽ liên quan đến hàm lượng Ca trong phân tử và nồng độ Mg2+ Tất cả các Amylase đều

bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+ Một số kim loại như : Li+,

Na+, Cr3+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Sn2+, Cr3+, không có ảnh hưởng mấy đến α-Amylase Một đặc điểm cần lưu ý là hầu hết α-Amylase khá bền với tác động của protease như pepsin, trypsin, papain

Cấu trúc phân tử tinh bột do Enzyme α-Amylase phân cắt tạo thành dextrin

tới hạn phân nhánh.

Sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinh bột dưới tác dụng của Amylase nấm sợi chủ yếu là maltose, thứ đến là maltotriose Nồng độ α-Amylase của vi sinh vật tương đối lớn có thể chuyển hóa 70 - 85% tinh bột thành đường lên men Còn các α-Amylase của nấm mốc thì mức độ đường hóa đến glucose và maltose có thể lên tới 84

- 87%

Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác khác nhau α-Amylase của

Asp.oryzae bền vững đối với acid tốt hơn là α-Amylase của malt và vi khuẩn Bac.subtilis Ở pH= 3,6 và 0oC, α-Amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15 - 30 phút; α-Amylase vi khuẩn bị bất hoạt đến 50%, trong khi đó hoạt lực của α-Amylase của nấm sợi hình như không giảm bao nhiêu (Fenilxova, Rmoshinoi 1989) Trong dung dịch α-Amylase nấm sợi bảo quản tốt ở pH = 5,0 - 5,5; α-Amylase dextrin hóa của nấm sợi đen có thể chịu được pH từ 2,5 - 2,8 Ở 0oC và pH = 2,5, nó chỉ bị bất hoạt hoàn toàn sau 1 giờ

Bảng 1.1: Một số tính chất của α-Amylase từ vi sinh vật

Ở ngũ cốc, β-Amylase tham gia vào sự phân giải của tinh bột trong quá trình nảy mầm của hạt Ở lúa, β-Amylase được tổng hợp trong suốt quá trình của hạt và hầu như không được tổng hợp ở hạt khô Ở lúa mạch, Enzyme có mặt ở trong hạt khô, nó được tích lũy trong suốt quá trình phát triển của hạt, khi ở dạng liên kết, Enzyme này

là một phân tử có trọng lượng phân tử là 64.000 Da và khi bị phân cắt bởi một protease sẽ được phóng thích dưới dạng tự do và có khối lượng phân tử là 59.000 Da

b) Cơ chế tác dụng của β-Amylase

β-Amylase là một Enzyme ngoại bào (exoenzyme) Tiến trình phân giải bắt đầu

từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng cơ chất β-Amylase phân cắt các liên kết α-1,4glucoside nhưng khi gặp liên kết α-1,4 glucoside đứng kế cận liên kết α-1,6glucoside thì nó sẽ ngừng tác dụng Phần polysaccharide còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiều liên kết α-1,6 glucoside và được gọi là β-dextrin

Cơ chế tác dụng của β-Amylase lên tinh bột

Tinh bột

- amylase β

→

maltose (54-58%) + β-dextrin (42-46%)

(glucogen)

Tinh bột bị thuỷ phân đồng thời bởi cả α và β-Amylase thì lượng tinh bột thuỷ phân tới 95%

c) Đặc tính của β-Amylase

β-Amylase là một albumin, tâm xúc tác có chứa nhóm –SH , nhóm X-COOH

và vòng imidazol của các gốc histidine và là Enzyme ngoại bào (exoEnzyme )

β-Amylase không bền khi có Ca2+, β-Amylase bị kìm hãm bởi Cu2+, Hg2+, urea, iodineoacetamide, iodine, ozon…

β-Amylase chịu nhiệt kém hơn α-Amylase nhưng bền hơn với acid β-Amylase

bị bất hoạt ở nhiệt độ 700C Nhiệt độ tối thích của β-Amylase là 550C, pH 5,1 – 5,5

Tham gia vào cơ chế tác dụng của β-Amylase thường có một nhóm caboxyl thể hiện tính chất ái nhân và một nhóm imidazol thể hiện tính chất ái electron Sự nghịch đảo hình thể của cacbon anome (C1) được thực hiện nhờ việc tạo thành hợp chất đồng hoá trị trung gian kiểu este axetal giữa cacbon anome và nhóm cacboxyl của tâm hoạt động Sau đó este này bị phân huỷ bởi tác động của 1 phân tử nước lên nhóm cacboxyl để giải phóng ra α-maltose và hoàn nguyên nhóm cacbxyl của Enzyme

γ-Amylase (glucoamylase hay α-1,4-glucan-glucohydrolase ) là những Enzyme

có thể thuỷ phân được cả hai kiểu liên kết của các mạch α-glucan để giải phóng ra ở

dạng β Glucoamylase hay γ-Amylase chủ yếu được tạo ra bởi các vi sinh vật Đặc biệt là kiểu nấm mốc Aspergillus, Penicillium và Rhizopus

Amyloglucosidase từ nấm mốc là các protein có khối lượng phân tử lượng dao động rất lớn từ 27.000 đến 112.000 Dal tuỳ thuộc vào nguồn gốc của Enzyme

Nói chung, các amyloglucosidase đều chứa các gốc methioni, tritophan, và một nửa gốc cystein Tuy nhiên mối quan hệ giữa chuỗi acid amin, cấu trúc bậc 3 và hoạt động của Enzyme vẫn chưa được làm sáng tỏ, tất cả các amyloglucosidase từ nấm mốc đều là glucoprotein chứa từ 5 - 20% gluxit trong đó chủ yếu là các monosaccharid, glucose mannose, galactose và glucosamin

Các amyloglucosidase chủ yếu được tạo nên từ hai iso-Enzyme I và II khác nhau ở khả năng thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn và bởi độ bền của chúng Amyloglucosidase I tự hấp thụ và thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn, ngược lại amyloglucosidase II không có cả hai tinh chất này

b) Cơ chế hoạt động

Amyloglucosidase có thể giải phóng ra β-D-glucose bằng cách thuỷ phân lặp lại nhiều lần các liên kết α-1,4 của mạch α-glucan từ đầu không khử, chúng cũng thuỷ phân được các liên kết α-1,6 và α-1,3 nhưng rất chậm (10 - 30 lần ) Tốc độ thuỷ phân cũng phụ thuộc vào bản chất của các liên kết kề cận với các liên kết glucozit được thuỷ phân , cũng như kích thuớc và cấu trúc của cơ chất bị thuỷ phân Nhất là với các α-glucan mạch dài (amylose và amylopectin) thì bị thuỷ phân nhanh hơn là với các maltodextrin và các oligosaccharit

c) Tính chất

Glucoamylase có khả năng thuỷ phân các liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucoside Khi thuỷ phân liên kết α-1,4-glucan trong chuỗi polysaccharide, glucoamylase tách lần lượt từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch để tạo ra glucose Enzyme này có nhiều tên gọi khác nhau: α-1,4; α-1,6-glucan- 4; 6-glucohydrolase;

glucoamylase; amyloglucosidase; taka-Amylase B; γ-Amylase… Là Enzyme ngoại bào.

Ngoài các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside, glucoamylase còn có khả năng thuỷ phân các liên kết α-1,2 và α-1,3 glucoside

Glucoamylase có khả năng thuỷ phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, amylopectin, dextrin, panose, iso maltose và maltose thành glucose, mà không cần có

sự tham gia cuả các loại Enzyme khác Glucoamylase thuỷ giải các polysaccharide có phân tử lớn nhanh hơn so với các chất có phân tử nhỏ Các polisaccharide có nhánh như amylopectin, glucogen, β-dextrin bị glucoamylase thủy phân khá nhanh

Đa số glucoamylase có hoạt lực cao nhất ở vùng có pH = 3,5 – 5,5 và nhiệt độ

500C Nó bền với acid hơn α-Amylase nhưng kém bền hơn trong rượu, acetone và không được bảo vệ bởi Ca2+

1.3.4 Oligo 1,6-glucosidase (dextrinase tới hạn) (EC 3.2.1.10)

Enzyme này có thể thuỷ phân liên kết α-1,6 – glucoside trong isomaltose, panose và các dextrin tới hạn thành đường có thể lên men được Enzyme này có ở vi sinh vật nhưng đồng thời cũng có trong các hạt nảy mầm (đại mạch, thóc nảy mầm) Ngoài oligo–1,6–glucosidase, hệ dextrinase của hạt ngũ cốc, hạt nảy mầm còn có amylopectin–1,6–glucosidase hay R–Enzyme và dextrin–1,6–glucoside hay amylo–1,6–glucoside hay dextrin-6-glucocanhydrolase Hai loại Enzyme này đều thuỷ phân dextrin triệt để hơn α-Amylase và β-Amylase do đó trong dung dịch thuỷ phân có nhiều maltose hơn

Nhiệt độ tối thích cho các hoạt động của các dextrinase là 400C và pH tối thích

là 5,1

1.3.5 Enzyme pullulanase (α-dextrin 6-glucosidase) (EC 3.2.1.41)

Enzyme này có thể thuỷ phân các liên kết α-1,6 của tinh bột, glucogen, pululan

và các dextrin tới hạn Điều đáng chú ý là sự định vị của các liên kết α-1,6 có ảnh hưởng lớn đến tác động của Enzyme Đặc biệt là sự có mặt của hai liên kết α-1,4 nằm liền kề bên liên kết α-1,6 là điều kiện cần thiết cho Enzyme phân cắt liên kết này

Pullulanase phân giải các liên kết α-1,6 glucoside bị bao quanh tứ phía bởi các liên kết α-1,4 Nó còn có khả năng thủy phân cả những dextrin phân tử thấp chỉ gồm

có hai gốc maltose nối nhau bằng liên kết 1,6 glucoside Tác dụng hiệp đồng của Amylase và pullulanase làm nó bị thủy phân hoàn toàn

α-1.3.6 α-glucosidase hay maltase (α-D,glucoside-glucohydrolase)(EC 3.2.1.20)

Nhiều loại nấm sợi sản sinh Enzyme này Giống như glucomylase, nó thủy phân maltose thành glucose nhưng không thủy phân tinh bột Maltase và glucozyltranferase là một Enzyme đồng nhất vừa có khả năng thủy phân liên kết α-1,4, trong các glucopiranoside vừa có khả năng chuyển các gốc glucoside sang đường

và rượu

2 NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT

Enzyme Amylase có trong các tế bào sinh vật , động thực vật , các loại nấm mốc Muốn thu nhận Enzyme cần chiết rút ra khỏi tế bào

Trong cơ thể sinh vật, Enzyme ở trong tế bào chất và các cấu tử tạo nên tế bào như nhân microsom … Enzyme không có khả năng đi qua màng tế bào, để đi vào dung dịch chiết Vì vậy việc đầu tiên là cần phải phá vỡ màng tế bào Việc phá vỡ cấu trúc tế bào có thể sử dụng một số cách sau :

+ Biện pháp cơ học như nghiền xay với bột thuỷ tinh , cát thạch anh hoặc máy xay đồng hoá…

+ Bằng dung môi hữu cơ như butanol, axeton, glycerin, etyl axetat …

+ Bằng sóng siêu âm, tia X, tia UV…

Sau khi nghiền nhỏ Enzyme được chiết rút bằng nuớc hay dung dịch đệm thích hợp, hoặc dung dịch muối trung tính …

Dung dịch thu được sau khi chiết ngoài Enzyme còn có các tạp chất khác như protein phi Enzyme, muối, gluxit …

Chúng ta cần loại bỏ để thu nhận Enzyme có độ tinh khiết cao Có rất nhiều phương pháp tinh sạch Enzyme sau đây là một số phương pháp cơ bản được sử dụng rộng rãi và có hiệu quả :

+ Để loại muối và tạp chất có trọng lượng phân tử nhỏ ta dùng phương pháp thẩm tích qua màng bán thấm Tinh chất của màng này sẽ cho chất có trọng lượng phân tử nhỏ đi qua Các chất có trọng lượng phân tử lớn bị giữ lại (Enzyme, protein )

+ Để loại protein lạ và tạp chất có trọng lượng phân tử cao ta dùng phối hợp nhiều phương pháp khác nhau như sắc kí hấp phụ, sắc kí trao đổi ion, điện di lọc gel…

2.1 Từ thực vật

Được lấy từ nhiều nguồn như:

Đại mạch (hodeum sativum):

+ Giống 2 hàng: sản xuất malt làm bia

+ Giống nhiều hàng (4,6 hàng): làm thức ăn cho gia súc

Lúa (oryza sativa L.): chủ yếu ở vùng Đông Nam Á

Ngô (zea mays): có nhiều loại ngô: ngô đá, ngô bột, ngô răng ngựa Hạt ngô có màu trắng, màu vàng hay màu hồng Ngô màu vàng do có sự hiện diện của carotenoid

và zeaxanthine ở trong nội nhũ Ngô màu hồng là do trong nội nhũ của ngô có anthocyanin

Sấy khô

Thu nhận, xử lý, làm sạch, phân loại

Mầm rễ khô Tách mầm rễ Sấy khô Nảy mầm Ngâm

Không khí

Malt khô sản xuất bia Malt khô bảo quản Bảo quản

Đại mạch

Các bước quy trình sản xuất malt khô

Quá trình thủy phân tinh bột của các Enzyme Amylase 2.2 Từ động vật

Enzyme Amylase có trong tụy tạng của động vật Tụy tạng là ống dạng chùm, dài, lớn, nằm ngang phía sau dạ dày, giữa lá lách và tá tràng Chiều dài của tụy tạng khoảng 30-35cm, và nặng khoảng 80-150g Bên trong có những vách ngăn nhỏ chia

tụy tạng thành nhiều thùy nhỏ Tụy tạng vừa có chức năng nội tiết vừa có chức năng ngoại tiết.

Thu nhận Amylase từ động vật phần lớn là từ dịch tụy tạng 98% tụy tạng được cấu tạo từ các tế bào ngoại tiết hoặc là tế bào tuyến Các tế bào này tiết Enzyme tiêu hoá vào trong tá tràng

2.3 Từ Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

2.3.1 Nguyên liệu tạo môi trường nuôi cấy.

Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy bề mặt thường là những nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên như cám mì, cám gạo, gạo, ngô mảnh, đậu nành và các loại hạt ngũ cốc khác.Trong các loại nguyên liệu trên, cám gạo, cám mì được sử dụng nhiều hơn cả Hai loại này có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho VSV phát triển Mặt khác khi tạo môi trường, chúng thường có tính chất vật lý rất thích hợp để vừa đảm bảo khối kết dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng không khí lưu chuyển trong khối nguyên liệu

Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy bề sâu (Sử dụng môi trường hoàn toàn lỏng): Nguyên liệu nuôi cấy phổ biến là dịch đường như glucose, fructose, sacarose, pepton,… nồng độ thích hợp khoảng 10 - 15%

vi sinh vật

Hình 1.1: Lên men trong môi trường lỏng ở quy mô phòng thí nghiệm (5L)

(www.khoahoc.com.vn) 2.3.3 Môi trường bán rắn

Phần lớn các nhà máy sản xuất enzyme, khi nuôi cấy VSV thu nhận enzyme, người ta thường sử dụng môi trường đặc Để tăng khả năng xâm nhập của không khí vào trong lòng môi trường, người ta thường sử dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc để làm môi trường Vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường và sinh tổng hợp ra enzyme nội bào và ngoại bào

Các enzyme ngoại bào sẽ thẩm thấu vào trong các hạt môi trường, còn các enzyme nội bào nằm trong sinh khối vi sinh vật Vi sinh vật không chỉ phát triển trên

bề mặt môi trường, nơi ngăn cách pha rắn (môi trường) và pha khí (không khí) mà còn phát triển trên bề mặt của các hạt môi trường nằm hẳn trong lòng môi trường Môi trường nuôi cấy vừa có độ xốp cao và vừa phải có độ ẩm thích hợp Nếu độ ẩm quá cao sẽ làm bết môi trường lại, không khí không thể xâm nhập vào trong lòng môi trường, nếu có độ ẩm thấp quá sẽ không thuận lợi cho VSV phát triển Thông thường người ta thường tạo độ ẩm khoảng 55-65% W là hợp lý Nếu sử dụng cám làm nguyên liệu chính để nuôi cấy vi sinh vật thu nhận enzyme, người ta phải cho thêm 20-25% trấu để làm xốp môi trường, tạo điều kiện thuận lợi không khí dễ xâm nhập vào lòng môi trường Phương pháp nuôi cấy bề mặt bán rắn (môi trường đặc) này rất thích hợp

cho len men ở nấm mốc Asp.oryzae.

A B

Bảng 1.3: Tính chất của amylase thu nhận từ các nguồn khác nhau

(Nguyễn Tiến Thắng, Gíao trình công nghệ enzyme 2008)

Nguồn thu nhận Giới hạn pH

3.1 Vi sinh vật trong sản xuất enzyme Amylase

Nhóm enzyme amylase, đa phần được tổng hợp bởi nấm mốc và vi khuẩn, một

số ít từ nấm men Các chủng nấm mốc như: Asp Oryzae, Asp ninger, Asp awamori, Asp Usamiii, Rhizopus neveus, Mucor sp, và một số loài vi sinh vật khác như:

Hình 1.2: Lên men trên môi trường rắn.

A: lên men kỵ khí trong nồi

bằng đất nung, B: lên men hiếu khí

Endomycopsis.Fibuliger, Endomyces sp, Saccharomyces diastaticus, tạo amylase, glucoamylase, glucozil transferase Từ vi khuẩn Bac Diastaticus, Bac Subtilis, Bac Mesentericus, Bac Amylosolvens thường để thu α-amylase chịu nhiệt độ cao.

Mỗi chủng vi sinh có thể tổng hợp nhiều loại enzyme nhưng khối lượng mỗi

loại enzyme tổng hợp được khác nhau Ví dụ: chủng Asp Oryzae (mốc vàng) tổng hợp nhiều amylase nhưng ít glucoamylase và glucozil-transferase Còn chủng Asp ninger , Asp.awamori (mốc đen) thì ngược lại.

Amylase của vi khuần có khả năng dịch hóa cao (tạo dextrin), khả năng đường hóa kém hơn amylase nấm mốc, nhưng có ưu điểm là chịu nhiệt cao (900C) Ở Nhật, hàng năm sản xuất 7.000 tấn amylase từ vi khuẩn

3.2 Đặc điểm sinh lý, dinh dưỡng và cơ chế tổng hợp sản phẩm trao đổi chất

3.2.1 Nấm mốc Aspergillus Oryzae

a) Đặc điểm nấm mốc Aspergillus Oryzae (Asp Oryzae) là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales,

lớp Ascomycetes (nang khuẩn) Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang 5 -7 µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang, chia sợi thành nhiều bao tế bào (nấm đa bào) Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi đứng thằng gọi là cuống đính bào tử, ở đó có cơ quan sinh sản vô tính

Cuống đính bào tử của Asp.oryzae thường dài 1-2 mm nên có thể nhìn thấy

bằng mắt thường Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là những tế bào hình chai Đầu các

tế bào hình chai phân chia thành những bào tử đính vào nhau, nên gọi là đính bào tử

Đính bào tử của Asp.oryzae có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau…

Đặc điểm của giống Asp.oryzae là giàu các enzyme thủy phân nội bào và ngoại

bào (amylase, protease, pectinasa,…), ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạo… đã hết nhưng không được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lõi ngô, ở bã sắn… Chúng mọc và phát triển có khi thành lớp mốc, có

màu sắc đen ,vàng… Màu do các bào tử già có màu sắc Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới

Hình 1.3: Aspergillus Oryzae (mốc vàng hoa cau)

b)Ứng dụng

của Asp Oryzae

Dịch quả sau khi nghiền và tách bỏ vỏ thường chứa các thành phần tế bào thịt quả và các thành phần của polysaccharide làm cho dịch quả có độ nhớt cao Để tăng hiệu suất trích ly dịch quả, giảm bớt độ nhớt, tăng mức cảm quan nước quả và giảm bớt một số công đoạn, việc bổ sung Endoglucanase rất quan trọng Enzyme này là điểm mấu chốt cải thiện hiệu suất dịch hóa Sự kết hợp của glucanase và pectinase sẽ phá hủy hoàn toàn màng tế bào

Trong công nghệ sản xuất bia, các chế phẩm enzyme amylase, protease và

glucanase đã được sử dụng để ngăn chặn sự tạo thành các diacetyl do đó giảm lượng

diacetyl được tạo thành, rút ngắn thời gian cần thiết để ủ bia Trong dịch lên men có chứa một lượng β-glucan, chất này ảnh hưởng tới khả năng lọc và gây đục cho bia

3.2.2 Baciluus Subtilis

a) Đặc điểm vi khuẩn

B Subtilis là trực khuẩn, Gram (+), có khả năng sinh catalase, hiếu khí hay kỵ

khí tùy ý Thường được tìm thấy trong đất Có khả năng di động, sinh nội bào tử Tế bào sinh dưỡng có dạng hình que, kích thước chiều rộng từ 0,7 – 0,8 μm, chiều dài từ 2,0 – 3,0 μm Không kết thành chuỗi, bắt phẩm nhuộm đồng đều, không tạo bao nang

Hình 1.4: Bacillus subtilis Hình 1.5: Vi khuẩn Bacillus subtilis

trong phân chia tế bào.

Bào tử B Subilis có dạng ellip đến hình cầu, kích thước chiều rộng 0,6 – 0,9

μm, chiều dài 1,0 – 1,5 μm, nằm giữa hay trong khoảng trung tâm đến gần cuối tế bào, phần lớn được tạo thành ở 48 giờ Mỗi cá thể chỉ tạo một bào tử, bào tử có khả năng chịu nhiệt, tia bức xạ, chất sát khuẩn, chất hút ẩm

Khi nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa, khuẩn lạc tròn, không đều hay phân tán Đường kính khuẩn lạc từ 3 – 5 mm, màu vàng xám, rìa có hình răng cưa Sau 1– 4 ngày bề mặt khuẩn lạc nhăn nheo, màu hơi nâu

Hình 1.6 Khuẩn lạc B subtilis trên thạch đĩa

Trong môi trường lỏng sinh khối tạo màng mỏng có lớp bao phủ Do bào tử

chiu nhiệt cao nên B subtilis có thể gây hư hỏng một số thực phẩm hộp tạo mùi vị khó

Bảng 1.4 Một số phản ứng sinh hoá của B subtilis

Khử Nitrate +

Người ta đã chứng minh B subtilis có tập tính “ăn lẫn nhau” (cannibalism)

(phương pháp đơn giản để thoát khỏi những trường hợp điều kiện sống giới hạn)

B subtilis có khả năng sinh tổng hợp hơn 20 loại kháng sinh khác nhau như:

subtilin, subtilosin A, sublancin, chlorotetain, mycobacillin, rhizocticins, bacillanene,

difficidin…(theo tài liệu tổng hợp của Nguyễn Quỳnh Nam, 2006).

Phân bố trong đất và các chất hữu cơ bị phân hủy và là một đối tượng dùng trong nghiên cứu khả năng lây bệnh trong phòng thí nghiệm

B subtilis không được xem là mầm bệnh gây bệnh cho người Chúng thường

có trong thực phẩm nhưng hiếm khi gây ngộ độc thực phẩm

b) Phân loại

Bảng 1.5 Bảng phân loại của Bacillus subtilis

Phân loại khoa học

Giới : Bacteria Họ : Bacillaceae

Tên kép

Bacillus subtilis

(Ehrenberg 1835 Cohn 1872)

c) Bộ gen Năm 1997, người ta đã hoàn tất việc nghiên cứu về trình tự gen của B.subtilis

và lần đầu tiên công bố trình tự gen của vi khuẩn

Bộ gen chứa 4,2 mega-base, xấp xỉ 4100 gen Trong số đó, chỉ có 192 gen không thể thiếu được, 79 gen được dự đoán là thiết yếu Phần lớn gen thiết yếu đều có liên quan với quá trình trao đổi chất của tế bào

d) Ứng dụng của Bacillus subtilis Trong công nghiệp sản xuất amino acid, thức ăn gia súc, Bacillus subtilis là

một trong những chủng vi sinh vật tổng hợp lysine có hàm lượng khá lớn (15-20%) từ tinh bột

Trong y dược, Bacillus subtilis được đóng thành ống thuốc Subtilis 10 ml trị bệnh tiêu chảy cho trẻ em do vi khuẩn Coliform gây ra, bệnh đường ruột do lị trực

tràng, đắp các vết thương lở loét ngoài da

Sản xuất các kháng sinh thực vật, ứng dụng trong phòng trừ vi sinh vật gây

bệnh như nấm Rhizoctonia solani, Fusarium sp, Pylicularia oryzae, Người ta thấy rằng sự phát triển của Bacillus subtilis trong cây làm tăng khả năng tổng hợp các

peptide kháng nấm của vi khuẩn nốt rễ (Rhizobacterium) Khả năng này được ứng

dụng trong kiểm soát sinh học

Ứng dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học (probiotic) bổ sung trong thức ăn nhằm cải thiện tiêu hóa, sức tăng trưởng; giảm sự tái phát bệnh tiêu chảy trên gia súc;

bổ sung vào ao nuôi nhằm duy trì chất lượng nước ao, hạn chế bệnh cho thủy sản nuôi

Hệ enzyme của B subtilis được sử dụng nhiều trong sản xuất chất tẩy rửa

Chúng có thể biến đổi các dạng chất thải độc hại thành những dạng hợp chất vô hại của nitrogen, carbon dioxide, và nước

Một chủng Bacillus subtilis được biết trước đây là Bacillus natto được dùng

trong sản xuất thực phẩm thương mại của Nhật tương tự như thực phẩm cheonggukjang của Hàn Quốc

B subtilis tái tổ hợp được sử dụng trong sản xuất polyhydroxyalkanoates

(PHA) và chúng có thể sử dụng malt phế thải như là nguồn cacbon, nhờ vậy chi phí sản xuất PHA giảm

Phần 2

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT

1 SƠ ĐỒ QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME THEO PHUONG PHÁP NUÔI CẤY VI SINH VẬT

Quy trình sản xuất mốc giống

Chuẩn bị môi trường thạch nghiêng

Cấy truyềnỐng mốc giốngNuôi cấy 30-320C trong 5-6 ngàyGiống trong ống thạch nghiêng

Nước vô trùngTrộn đều bào tửMốc giống trong bình tam giácNuôi cấy 30-320C trong 5-6 ngàyChuẩn bị môi trường trong bình tam giác

Trộn giống 0,5-10%

Nuôi mốc 60hSấy khôBao góiMốc giống cho sản xuất

Làm tơiNgô mảnh, hấp thanh trùng

1.1 Theo Phương Pháp Nuôi Cấy Bề Mặt

Nguyên liệu

Xử lý nguyên liệuHấp thanh trùngLàm nguộiTrộn giống vi sinh vật

Nuôi cấyThu nhận chế phẩm enzyme thôChế phẩm enzyme thô đem tinh chế

Nghiền mịnTrích lyLọcKết tủaChế phẩm enzyme tinh khiếtCồn hoặc sulfat amon

Bã Dùng trong chăn nuôiChế phẩm enzyme thô đem sử dụng

Giống cho sản xuấtNhân giốngGiống vi sinh vật

Quy trình công nghệ thu nhận enzyme amylase từ Asp Oryzae

Thuyết minh quy trình

Hấp thanh trùng: dưới áp suất hơi 1-1,5 atm trong thời gian 45-60 phút

Trộn giống vi sinh vật: Sau khi làm nguội, tiến hành cấy giống hoặc rắc bào tử vào môi trường đã thanh trùng, ủ thành đống vài giờ Khi cấy vào môi trường dinh dưỡng, bào tử sẽ phát triển thành tế bào nấm mốc và tạo ra các loại enzyme mà ta mong muốn

Kỹ thuật nuôi cấy: Sau khi đã trộn giống, môi trường được trải đều ra các khay với chiều dài 2-3cm, rồi được đưa vào phòng nuôi cấy ở 28-32oC, không cần điều chỉnh pH Thời gian nuôi nấm sợi thu nhận enzyme vào khoảng 36-60 giờ Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng phương pháp bề mặt này trải qua các giai đoạn sau:

• Giai đoạn 1 : giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy

o Nhiệt độ tăng rất chậm

o Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa

o Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi.

o Khối môi trường còn rời rạc

o Enzyme mới bắt đầu đươc hình thành

• Giai đoạn 2: giai đoạn này kéo dài 14-18 giờ

o Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm có màu trắng xám

o Môi trường được kết lại khá chặt

o Độ ẩm môi trường giảm dần

o Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-45oC

o Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hoá mạnh của nấm sợi

o Enzyme amylase được tổng hợp mạnh

o Lượng O2 trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần

• Giai đoạn 3 : giai đoạn này kéo dài 10-20 giờ

o Quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại

o Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí môi trường xuống 20-25 thể tích không khí /thể tích phòng nuôi cấy/ 1giờ

tinh ra khỏi hỗn hợp bã rồi mới cho gia súc ăn) Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzym thô vì trong đó có chứa nước, các chất hòa tan khác từ khối môi trường nuôi cấy Dùng cồn và sunfat amon để kết tủa enzyme.Trong khi tiến hành kết tủa, người ta phải làm lạnh cả dung dịch enzym thô và cả những tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính enzyme.

Khi cho chất kết tủa vào dung dich enzyme thô, người ta tiến hành khuấy nhẹ, sau đó để yên trong điều kiện nhiệt độ 4-70C Theo thời gian, các enzyme sẽ được tạo kết tủa và lắng xuống đáy, người ta tiến hành gạn và lọc thu nhận kết tủa

Chế phẩm enzyme thô (bao gồm thành phần môi trường sinh khối vi sinh vật, enzyme và nước) Sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản

Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp

Trong trường hợp bị nhiễm các vi sinh vật lạ, ta rất dễ dàng xử lý Môi trường đặc là môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm ta chỉ cần loại

bỏ khu vực đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy Những khu vực khác sẽ hoàn toàn được an toàn

Nhược điểm : Phương pháp này tốn khá lớn diện tích cho nuôi cấy Trong

phương pháp này vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường (môi trường lỏng hoặc môi trường bán rắn) nên rất cần nhiều diện tích

Mô hình nuôi mốc trên khay

1.2 Theo Phương Pháp Nuôi Cấy Bề Sâu:

Quy trình công nghệ

Vi Sinh Vật

Dịch nuôi cấy (mật rỉ) Hấp thanh trùng Trộn giống vi sinh vật

Nuôi cấy Amylase thô