thực hành kỹ thuật nhuộm ba màu của masson’s trên mô bệnh học bệnh nhân xơ gan và tìm hiểu một số yếu tố liên quan

Mô liên kết được tạothành bởi các thành phần chính như: gian bào còn gọi là dịch mô, các tế bàoliên kết nằm ở gian bào, các sợi liên kết vùi trong chất căn bản.. Trên cơ sở đó, chúng tôi

Vµ T×M HIÓU MéT Sè YÕU Tè LI£N QUAN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA

KHÓA 2009- 2013

Hà Nội- 2013

Vµ T×M HIÓU MéT Sè YÕU Tè LI£N QUAN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA

Em xin chân thành cảm ơn tới Ban Giám Hiệu, Phòng đào tạo Đại trường Đại Học Y Hà Nội đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để em được họctập, rèn luyện và tu dưỡng tại trường.

Học-Với tất cả lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn

thầy giáo, Ths Nguyễn Hữu Quốc - người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ

bảo tận tình và đóng góp nhiều ý kiến quý báu để em có thể hoàn thành tốtkhóa luận này

Em xin gửi lời cám ơn chân thành tới Ths Hoàng Trung Kiên, Ban

Tuyên giáo Thành ủy Hà Nội, thầy đã tận tình chỉ bảo và tạo điều kiện thuậnlợi để em hoàn thành khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô và cán bộ trong Bộ môn Giảiphẫu bệnh - trường Đại Học Y Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ em trong suốtquá trình học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, con xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới cha mẹ, những người thântrong gia đình đã tạo mọi điều kiện về tinh thần và vật chất cho con Cảm ơnnhững người bạn đã luôn ủng hộ và động viên tôi trong quá trình học tập vàthực hiện khóa luận

Nguyễn Mạnh Tuấn

quả nghiên cứu trình bày trong khóa luận là trung thực và chưa từng được công

bố trong bất kỳ công trình khoa học, khóa luận hay tài liệu tham khảo nào

Hà Nội, ngày…… tháng… năm 2013

Sinh viên

Nguyễn Mạnh Tuấn

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giải phẫu, mô học và tế bào học bình thường của gan 3

1.1.1 Giải phẫu gan 3

1.1.2 Mô học gan bình thường 3

1.2 Bệnh xơ gan 4

1.3 Vài nét về mô liên kết 5

1.4 Sợi collagen 6

1.4.1 Collagen type 1 6

1.4.2 Collagen type 2 6

1.4.3 Collagen type 3 6

1.4.4 Collagen type 4 6

1.4.5 Collagen type 5 và 6 7

1.5 Phương pháp nhuộm ba màu của Masson 7

1.5.1 Lịch sử phương pháp nhuộm ba màu của Masson 7

1.5.2 Cơ chế nhuộm 8

1.5.3 Hóa chất dùng trong phương pháp nhuộm ba màu Masson 8

1.6 Pha hóa chất 12

1.6.1 Dung dịch Hematoxylin Ferric 12

1.6.2 Dung dịch Fuchsin – Ponceau 12

1.6.3 Dung dịch acid Phosphomolybdic 1% 12

1.6.4 Dung dịch Blue aniline 12

1.6.5 Dung dịch acid acetic 1% 13

1.6.6 Dung dịch cố định Bouin 13

1.7 Tiến hành 13

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 17

2.3 Mẫu và phương pháp chọn mẫu 17

2.3.1 Tiêu chuẩn chọn mẫu 17

2.3.2 Cỡ mẫu 17

2.4 Phương pháp nghiên cứu 17

2.4.1 Thiết kế nghiên cứu 17

2.4.2 Phương pháp lấy mẫu 18

2.4.3 Phương tiện nghiên cứu 18

2.5 Đánh giá kết quả nghiên cứu 18

2.5.1 Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng tiêu bản 19

2.5.2 Tiêu chuẩn đánh giá tiêu bản đạt yêu cầu 19

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 20

3.1 Đánh giá kết quả thực hành kỹ thuật 20

3.2 Các yếu tố liên quan ảnh hưởng tới kết quả thực hành 23

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 32

4.1 Kết quả thực hành 32

4.2 Các yếu tố liên quan 35

KẾT LUẬN 38

KIẾN NGHỊ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Bảng 2.2: Bảng tiêu chuẩn đánh giá tiêu bản đạt yêu cầu 19

Bảng 3.1: Kết quả thực hành tháng thứ nhất 20

Bảng 3.2: Kết quả thực hành tháng thứ hai 20

Bảng 3.3: Kết quả thực hành tháng thứ ba 21

Bảng 3.4: Kết quả thực hành tháng thứ tư 21

Bảng 3.5: Bảng kết quả chất lượng tiêu bản có và không cố định bằng Bouin 23

Bảng 3.6: Bảng kết quả nhuộm sợi collagen bằng Blue aniline và Light green 23 Bảng 3.7: Bảng kết quả khi biệt hóa bằng Acid acetic 1% và không biệt hóa bằng Acid Acetic 1% 24

DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Đánh giá tổng quan chất lượng tiêu bản sau các tháng 22

Hình 1.1: Gan và các bộ phận lân cận trong ổ bụng 3

Hình 1.2: Một phần tiểu thùy gan cổ điển 4

Hình 1.3: Hình thái bề mặt gan xơ 5

Hình 1.4: C.L Pierre Masson 7

Hình 1.5: Công thức của Hematoxylin 8

Hình 1.6: Cấu trúc acid Fuchsin 9

Hình 1.7: Cấu trúc Ponceau de xylindine 9

Hình 1.8: Cấu trúc acid Phosphomolybdic 10

Hình 1.9: Cấu trúc Blue aniline 10

Hình 1.10: Cấu trúc Acid acetic 11

Hình 1.11: Cấu trúc Light green 11

ĐẶT VẤN ĐỀ

Mô liên kết là loại mô phổ biến nhất có mặt ở hầu hết các bộ phận của

cơ thể, xen giữa các mô và gắn bó chúng với nhau Mô liên kết được tạothành bởi các thành phần chính như: gian bào (còn gọi là dịch mô), các tế bàoliên kết nằm ở gian bào, các sợi liên kết vùi trong chất căn bản Trong đó đặcbiệt chú ý đến là sợi collagen, đây là sợi liên kết có ở hầu hết các mô liên kết

Xã hội càng phát triển, bệnh lý về mô liên kết gặp ngày càng nhiều Xơgan là một minh chứng, thường gặp nhiều ở độ tuổi 40 Đây là một bệnh mạntính kéo dài có tiên lượng xấu và tỷ lệ tử vong cao Đến nay, trên thế giớicũng như ở Việt Nam vẫn chưa có thuốc điều trị đặc hiệu (kể cả Tây y vàĐông y) Bệnh gây tổn thương lan tỏa ở các thùy gan với xơ hóa, đảo lộn cấutrúc bình thường của gan dẫn tới hình thành các u, cục tân tạo với các cấu trúckhông bình thường [9] Nhiễm vius B, C là nguy cơ chính gây xơ gan Kếtquả một số nghiên cứu ở Việt Nam cho thấy, tỷ lệ lưu hành virus viêm gan Btại cộng đồng chiếm khoảng 10- 25% dân số, trong đó tỷ lệ nhiễm virus viêmgan B ở người khoẻ (8- 25%); tỷ lệ nhiễm virus viêm gan C (0,4- 4,1%) [2].Một lý do khác gây xơ gan là do rượu, gặp nhiều ở các nước Châu Âu và cácnước có thói quen sử dụng rượu trong đó có Việt Nam

Ngày nay, tiến bộ trong lĩnh vực khoa học đã giúp chẩn đoán sớm vàđiều trị tốt cho bệnh nhân xơ gan nhưng tiên lượng của bệnh xơ gan vẫn rất dèdặt Việc đánh giá mức độ viêm gan và xơ hóa của nhu mô gan là thực sự cầnthiết, nhất là những trường hợp xơ gan nặng Có nhiều kỹ thuật hiện đại giúpchẩn đoán xơ gan như: siêu âm, CT scanner nhưng sinh thiết gan phục vụchẩn đoán giải phẫu bệnh mới là tiêu chẩn vàng để đánh giá tình trạng xơ gan.Phương pháp nhuộm hai màu thông thường bằng Hematoxylin và Eosin

không cho phép quan sát, đánh giá phân biệt bệnh lý của mô liên kết Năm

1951, phương pháp nhuộm ba màu của nhà giải phẫu bệnh P Masson được

mô tả như là một bước ngoặt đột phá giúp cho các nhà lâm sàng trong chẩnđoán bệnh học về mô liên kết Phương pháp giúp phân biệt rõ được các thànhphần dựa trên sự tương phản màu sắc của mô: nhân, các hồng cầu, sợi huyết,bào tương và đặc biệt là các sợi collagen

Các đề tài nghiên cứu trong nước ứng dụng kỹ thuật nhuộm ba màu đểchẩn đoán, phân biệt bệnh lý về mô liên kết còn ít Mặt khác, chưa có đề tàinào nghiên cứu một cách toàn diện và cung cấp các thông tin đầy đủ về kỹthuật nhuộm ba màu, cũng như ưu, khuyết điểm, các yếu tố ảnh hưởng đến kĩthuật nhuộm ba màu và cách khắc phục Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành

nghiên cứu đề tài: “Thực hành kỹ thuật nhuộm ba màu của Masson’s trên

mô bệnh học bệnh nhân xơ gan và tìm hiểu một số yếu tố liên quan”, với

mục tiêu:

1 Thực hành thành thạo kỹ thuật chuyển, đúc, cắt, nhuộm.

2 Một số yếu tố liên quan ảnh hưởng tới kết quả thực hành.

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giải phẫu, mô học và tế bào học bình thường của gan

1.1.1 Giải phẫu gan

Gan là cơ quan lớn thứ hai trong cơ thể (sau da) Gan đóng nhiều vaitrò quan trọng khác nhau trong việc bảo tồn sức khỏe của chúng ta Tùytheo kích thước và trọng lượng của mỗi cá nhân, gan có sức nặng từ 1.100đến 1.800 gram Gan vừa là tuyến ngoại tiết (tiết mật vào tá tràng), vừa làtuyến nội tiết (tổng hợp một số chất và những chất này được chuyển trựctiếp vào máu) [7]

Hình 1.1 Gan và các bộ phận lân cận trong ổ bụng

1.1.2 Mô học gan bình thường

Gan được chia làm nhiều thùy Các thùy gan được tạo thành bởi nhữngkhối nhỏ với cấu trúc điển hình được gọi là tiểu thùy gan Mỗi tiểu thùy làmột đơn vị cấu trúc và chức năng của gan [7]

Mỗi tiểu thùy gan là một khối đa diện có đường kính khoảng 1- 2mm.Các tiểu thùy chỉ phân cách với nhau rõ rệt ở khoảng cửa (chỗ mô liên kết dàylên ở góc giữa 3- 4 tiểu thùy).

Gan được tạo thành chủ yếu bởi các tế bào gan Những tế bào đó hợpthành những dây tế bào và nối với nhau tạo thành một đơn vị hình thái đượcgọi là Kiernan hay còn gọi là tiểu thùy gan

Hình 1.2: Một phần tiểu thùy gan cổ điển 1.2 Bệnh xơ gan

Xơ gan là bệnh mạn tính gây thương tổn nặng lan toả ở các thuỳ gan.Đặc điểm thương tổn là mô xơ phát triển mạnh, đồng thời cấu trúc các tiểu

thuỳ và mạch máu của gan bị đảo lộn một cách không hồi phục được [1]

Hình thái học của xơ gan là kết quả của 3 quá trình đồng thời hoặcnối tiếp:

- Tổn thương hoại tử của các tế bào nhu mô gan

- Sự tăng sinh của mô xơ

- Sự tạo thành những hòn, cục tái tạo và những tiểu thuỳ giả

Hình 1.3: Hình thái bề mặt gan xơ 1.3 Vài nét về mô liên kết

Trong số các loại mô cơ bản thì mô liên kết là loại mô phổ biến nhất

Mô liên kết có mặt ở hầu hết các bộ phận trong cơ thể, xen giữa các mô khác,giúp chúng gắn bó với nhau[7]

Mô liên kết có nguồn gốc từ lá thai giữa, tức là trung mô Trong cơ thể

có nhiều loại mô liên kết Mỗi loại mô liên kết được tạo thành bởi:

- Thành phần gian bào: gồm phần lỏng gọi là dịch mô, phần đặc hơn

có đặc tính của một hệ keo gọi là chất căn bản

- Các sợi liên kết vùi trong chất căn bản

- Các tế bào liên kết nằm rải rác trong thành phần gian bào

Mô liên kết là loại mô giàu thành phần gian bào (được coi như môitrường bên trong cơ thể) Căn cứ vào sự khác nhau chủ yếu của chất căn bảnngười ta phân mô liên kết thành ba loại lớn:

- Mô liên kết chính thức: có mật độ mềm và có mặt ở mọi nơi trong cơ thể

- Mô sụn: chất căn bản nhiễm cartilagen (chất sụn) có mật độ rắn vừa phải

- Mô xương: chất căn bản nhiễm ossein và muối canxi vì vậy mật độ rắn.

1.4 Sợi collagen

Sợi collagen là một trong ba loại sợi vùi trong chất căn bản liên kếtgồm: sợi collagen, sợi võng và sợi chun Sợi collagen có mặt ở hầu hết các

mô liên kết, nhưng khác nhau đáng kể về số lượng

Về nguồn gốc, sợi collagen được hình thành từ protein

Sợi collagen bắt màu đỏ của thuốc nhuộm Eosin, bắt màu xanh củaBlue aniline

Đơn vị cấu tạo hình thái của sợi collagen là xơ collagen, có đường kínhtrung bình khoảng 50nm quan sát rõ ở kính hiển vi điện tử

Về mặt sinh hóa, hiện nay đã xác định được trên 20 type collagen khácnhau Sự khác nhau này là do có các chuỗi α khác nhau, khi chúng kết hợpthành bộ ba xuất hiện những hình thái phân tử collagen khác nhau Một sốtype collagen quan trọng:

1.4.5 Collagen type 5 và 6

Collagen type 5 được sản xuất một lượng nhỏ bởi nhiều loại tế bào của

mô liên kết, bao gồm tế bào liên kết, tế bào nội mô và tế bào biểu mô.Collagen type 6 là cấu trúc giàu cầu nối disunfit Collagen type 6 được tìmthấy trong khu vực ranh giới kẽ của sợi collagen type 1 và 2, có chức năngliên kết các thành phần không phải collagen [6]

1.5 Phương pháp nhuộm ba màu của Masson

1.5.1 Lịch sử phương pháp nhuộm ba màu của Masson

Nhuộm ba màu là một trong những phương pháp nhuộm để phân biệtcác thành phần khác nhau của mô liên kết Thuật ngữ nhuộm ba màu là tênthường dùng của kỹ thuật nhuộm chọn lọc cho cơ, sợi collagen, sợi huyết

và hồng cầu

C.L Pierre Masson (1880-1959)

là một nhà giải phẫu bệnh người

Canada nổi tiếng của thế kỉ 20 Ông

được biết đến như nhà nghiên cứu về u

não và hệ thống thần kinh và những kỹ

thuật mô học như phương pháp nhuộm ba

màu đã trở thành chuẩn trong tất cả các

phòng xét nghiệm bệnh học [13], [14] Hình 1.4: C.L Pierre Masson

Phương pháp nhuộm mang tên ông được mô tả lần đầu năm 1951 vớinguyên tắc nhuộm: nhuộm phối hợp ba loại phẩm nhuộm, một phẩm nhuộmnhân bởi Hematoxylin (tốt nhất là Hematoxylin ferric); nhuộm bào tương vàcác thành phần khác bằng hỗn hợp phẩm nhuộm acid (Fuchsin acid vàPonceau S) và nhuộm sợi collagen bằng một phẩm nhuộm acid khác đặc hiệu

là Blue aniline

1.5.2 Cơ chế nhuộm

Các mô xốp được nhuộm màu của các phân tử cực nhỏ của thuốcnhuộm Đầu tiên mô được nhuộm màu bởi thuốc nhuộm acid Sau đó, khiđược nhuộm với các acid Phosphomolybdic, các thành phần ít thấm giữ lạimàu đỏ, trong khi đó màu đỏ bị kéo ra khỏi mô có bản chất collagen Đồngthời, gây ra một liên kết với collagen giúp gắn màu xanh của Blue aniline

1.5.3 Hóa chất dùng trong phương pháp nhuộm ba màu Masson

1.5.3.1 Hematoxylin

Hematoxylin: là một phẩm nhuộm tự nhiên, chiết xuất bằng ete từ lõi

cây Haematoxylon campechianum mọc trong vùng nhiệt đới Campeche ởMexico [8]

Hình 1.5: Công thức của Hematoxylin

Hematein bản thân ít ưa các tổ chức, vì vậy, phải dùng một chất gắnmàu Khi pha với các muối nhôm, sắt crom, đồng hoặc tungsten nó bắt màuvào nhân rất, nhất là các muối kim loại hóa trị III như nhôm, sắt dướidạng alum potassium, chlorua ferric hình thành một hợp chất tích điệndương mạnh nên cố định các acid nucleic của nhân [8] Chúng tôi tiến hành

nhuộm nhân trong dung dịch Hematoxylin ferric bởi khả năng bền màutrong acid hơn so với Hematoxylin alum [6].

1.5.3.4 Acid Phosphomolybdic

Acid Phosphomolybdic, còn được gọi là acid molybdophosphoric

dodeca hoặc PMA là một thành phần của phương pháp nhuộm ba màu củaMasson Nó là một hợp chất màu vàng- xanh, dễ tan trong nước và các dungmôi hữu cơ cực như ethanol

N H

Hình 1.9: Cấu trúc Blue aniline

1.5.3.6 Acid acetic

Công thức: C 2 H 4 O 2

Hình 1.10: Cấu trúc acid acetic

Acid acetic là một acid yếu, thuộc nhóm acid 8 monoprotic Nó tạo ragốc liên kết là acetat (CH3COO−) Dung dịch 1,0 M có pH là 2,4

1.5.3.7 Light green

Công thức: C37H34N2Na2O9S3.

Hình 1.11: Cấu trúc Light green

- Dung dịch Fuchsin acid 1%: 1 thể tích

- Dung dịch Ponceau de xylidine 1% trong dung dich acid acetic1%: 2 thể tích

Trộn đều 2 dung dịch trên

1.6.3 Dung dịch acid Phosphomolybdic 1%

Cách pha: Đun nóng 100ml nước cất, thêm vào đó 2,5g bột Blue

aniline Lấy ra khỏi lửa, thêm 2,5ml acid acetic Đậy bằng nút bông, làmlạnh rồi lọc

1.6.5 Dung dịch acid acetic 1%

- Nước cất 100ml

- Acid acetic 1ml

Hai yêu cầu cơ bản trớc tiên của lấy bệnh phẩm là: phải lấy trúng và lấy

đủ Những yêu cầu này dễ thực hiện đối với tử thiết hoặc bệnh phẩm phẫuthuật hơn là với những sinh thiết bằng dụng cụ, nhất là khi tổn thơng ở sâuhoặc trong các tạng [4], [8]

Bệnh phẩm sau khi được lấy sẽ được cố định ngay Một bệnh phẩmđược cố định tốt phải đảm bảo những nguyờn tắc sau:

1 Bệnh phẩm phải được cố định ngay sau khi lấy

2 Khụng được làm dập nỏt bệnh phẩm

3 Bệnh phẩm khụng cắt quỏ dày

4 Đủ lượng dung dịch cố định cần thiết

5 Thời gian cố định dung dịch thớch hợp

6 Khụng để bệnh phẩm dớnh vào thành lọ

Cỏc mẫu bệnh phẩm dựng trong kỹ thuật mụ học thường được cắt dày

từ 3 - 5 mm và được chuyển bằng mỏy

Sau khi được chuyển bằng máy sẽ là bước cắt tiêu bản

Trước khi cắt thì máy cắt cần được kiểm tra cả ốc vít và tra dầu bôitrơn Nhiệt độ trong phòng cắt không quá 25oC và tốt hơn là cắt trong phòng

có điều hòa Nếu không có điều kiện thì bloc phải được ngâm vào nước đá đểđảm bảo đủ độ cứng mới cắt mảnh được Độ nghiêng của lưỡi dao đặt và máycắt thích hợp là 45o Chất lượng của mảnh cắt còn phụ thuộc vào nhiệt độ dàntiêu bản (nóng không quá 50oC) [5], [8]

Như vậy một tiêu bản cắt được coi là đạt yêu cầu nếu:

- Mỏng đều

- Không xước, gấp hoặc rách

- Còn nguyên khuôn paraffin quanh bệnh phẩm

- Vị trí của mảnh cắt đặt ở 2/3 của lam từ dưới lên (1/3 của lam từ trênxuống để ghi mã số bệnh nhân, phía 2/3 dùng để dán nhãn sau khi nhuộm) lúcnày bệnh phẩm nằm ở chính giữa lam kính.

1.8 Tiến hành quy trình nhuộm

1.8.1 Quy trình nhuộm

 Lấy tiêu bản ra khỏi tủ ấm, tẩy paraffin lần lượt bằng Xylen I, II, III.Sau đó chuyển tiêu bản qua cồn có nồng độ khác nhau từ cồn 1000 đến cồn

950 và rửa nước nhẹ trong 5 phút

 Cố định lại trong Bouin 1h, nhiệt độ 50o C

 Nhuộm nhân trong Hematoxylin ferric 2 phút

 Rửa nước chảy 2- 5 phút

 Nhuộm bào tương bằng hỗn hợp Fuchsin acid và Ponceau S trong 5phút

 Rửa nước cất

 Biệt hóa trong acid Phosphomolybdic 1% trong 5 giây

 Không rửa tiêu bản, nhuộm collagen trong dung dịch Blue anilinetrong 1 phút 15 giây

 Biệt hóa trong acid acetic 1% trong 10 giây

 Loại nước bằng cách nhúng tiêu bản vào cồn tuyệt đối

 Làm trong tiêu bản bằng Xylen và gắn Baume [11]

1.8.2 Kết quả chung

Bào tương, sợi cơ, hồng cầu đỏ