giáo trình Di truyền học

Giáo trình Di truyền học cần thiết dùng cho quá trình học tập ở các lớp Sư phạm Sinh, trường Đại học Sư Phạm Đại học Đà Nẵng. Gồm 155 trang, với tám chương. CHƯƠNG I. VẬT CHẤT DI TRUYỀNCHƯƠNG II: GEN VÀ QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP PROTEINCHƯƠNG III: ĐIỀU HOÀ BIỂU HIỆN CỦA GENCHƯƠNG IV: KHÁI NIỆM VÀ PHÂN LOẠI BIẾN DỊ, ĐỘT BIẾNCHƯƠNG V. CƠ SỞ CỦA DI TRUYỀN HỌC MENDELCHƯƠNG 6: DI TRUYỀN NHIỄM SẮC THỂChương 7: DI TRUYỀN NGOÀI NHÂNChương 8: DI TRUYỀN HỌC QUẦN THỂ

MỞ ĐẦU

Mục tiêu:

- Nêu được khái niệm Di truyền học

- Phân biệt được tính di truyền và tính biến dị

- Khái quát được lịch sử phát triển của ngành Di truyền học

- Biết được các nhánh chính trong nghiên cứu di truyền

- Hiểu và phân tích được vai trò của các nghiên cứu và ứng dụng của di truyềnhọc đến các lĩnh vực khác nhau trong đời sống, khoa học

I DI TRUYỀN HỌC LÀ GÌ ?

Theo quan niệm của Bateson (1906), di truyền học (genetics) là khoa học nghiên cứu các đặc tính di truyền và biến dị vốn có của mọi sinh vật cùng với các nguyên tắc và phương pháp điều khiển chúng Ở đây, tính di truyền (heredity) được biểu hiện ở sự giống nhau giữa

con cái với cha mẹ; và tính biến dị (variability) biểu hiện ở sự sai khác giữa cha mẹ và concái cũng như giữa các con cái với nhau

Khái niệm cơ bản của di truyền học là gen (gen) với nội dung không ngừng được mởrộng cùng với sự phát triển của di truyền học

II LƯỢC SỬ PHÁT TRIỂN CỦA DI TRUYỀN HỌC

* Giai đoạn trước Mendel

Từ thời xa xưa loài người đã quan tâm đến các hiện tượng di truyền và biến dị Cáchnay 6.000 năm, người Babilon đã tạc trên vách đá những thế hệ nối tiếp của một dòng ngựa

và biết cho thụ phấn chéo một số cây trồng Những phương pháp chọn lọc các giống câytrồng và vật nuôi, thuần hoá và lai giống đã được tất cả các dân tộc cổ xưa áp dụng Nhưngthời bấy giờ, loài người vẫn chưa đủ hiểu biết về các qui luật di truyền đầy bí ẩn nên có rấtnhiều quan niệm ngây thơ và sai lầm Ví dụ như: người Hy Lạp cổ xưa cho rằng Hươu cao cổsinh ra là do lai giữa Lạc đà và Beo, Đà điểu là do lai giữa Lạc đà và chim ?!

Về vấn đề nam nữ khác nhau về hình thái cũng mang đến nhiều sự giải thích rất thú vị.Thầy thuốc Empedoche (490-430 TCN) cho rằng: Nếu mầm sống của cha mẹ đều nóng thìcon trai được sinh ra sẽ giống cha, còn ngược lại thì sinh con gái giống mẹ; nếu của cha nóng,của mẹ lạnh thì sinh con trai có khuôn mặt giống mẹ; nếu của mẹ nóng, cha lạnh thì sinh congái giống cha”

Cuối thế kỷ XVI, kính hiển vi sơ khai được phát minh bởi A.van Leuvenhook 1723) cho phép quan sát được tinh trùng trong tinh dịch và những sinh vật nhỏ bé khác Vàokhoảng giữa thế kỷ XVII-XVIII ra đời hai trường phái:

(1632-+ Noãn luận (Ovison), đại diện là Y Aromatari (Ý), cho rằng: cơ thể con người có đủcác bộ phận đã nằm sẵn trong tế bào trứng, tinh trùng chỉ kích thích sự phát triển của chúng

+ Vi thể luận (Amimoalism) - đại diện là H Hacsuckevo, A Lovenhuc, cho rằng cơthể nhỏ xíu đó đã nằm sẵn trong tinh trùng, tế bào trứng và cơ thể mẹ chỉ cung cấp chất dinhdưỡng cho nó lớn lên

Năm 1838, nhà thực vật học Ðức là Matthias Jakop Schleiden (1804 - 1881) đã chorằng tất cả thực vật đều có cấu tạo tế bào và tế bào là đơn vị cấu trúc chủ yếu của sự sống, làyếu tố nhỏ nhất cấu tạo nên một cơ thể hoàn chỉnh Ðến năm sau, nhà sinh lý học ÐứcTheodor Schwann (1810 - 1881) đã mở rộng và bổ sung nhận định đó Ông đi đến kết luận làđối với động vật và thực vật chỉ vốn có một quy luật duy nhất là cấu tạo từ các tế bào, từng tếbào có màng bao bọc cách biệt với thế giới bên ngoài, và những mô khác nhau do Bisa mô tảđược cấu tạo từ những tế bào chuyên hóa đặc biệt Và học thuyết tế bào chính thức được rađời

Vào thế kỷ 19, các phương pháp lai giống đã được sử dụng ở động vật và thực vật

Tuy nhiên, quan niệm phổ biến thời bấy giờ là sự di truyền hoà hợp, tức tính trạng của cha

mẹ trộn lẫn nhau tạo nên tính trạng trung gian ở con cái, như lai cây hoa đỏ và hoa trắng cho

ra cây hoa hồng J B Lamarck chú ý nhiều đến sự di truyền tập nhiễm tức các biến đổi do

luyện tập và tập nhiễm trong đời sống cũng được di truyền

Thuyết di truyền gián tiếp tồn tại gần 23 thế kỷ, và R.C.Darwin cũng chịu ảnh hưởng

của quan niệm này, phát triển thuyết pangen, cho rằng mỗi phần của cơ thể sinh sản ra những

Hình 1: (a) J B Lamarck và (b) R.C.Darwin

2

phần tử nhỏ là gemmule (mầm) theo máu từ các phần cơ thể tập trung về cơ quan sinh dục,

mỗi cá thể sinh ra do sự hoà hợp tính di truyền của cả cha lẫn mẹ, hơn thế nữa, bao gồm cảtính tập nhiễm

Nhìn chung, quan niệm phổ biến thời bấy giờ là sự di truyền các tính trạng tập nhiễm(inheritance of acquired characters) do Lamarck đề xuất và sự di truyền hoà hợp (blendinginheritance)

* Sự ra đời và phát triển của “thuyết di truyền gián đoạn”

Sự ra đời và phát triển của di truyền học gắn liền với công trình nghiên cứu của GregorMendel năm 1865

Với những ý tưởng nghiên cứu độc đáo trên đối tượng cây đậu Hà Lan, năm 1865,G.Mendel đã phát hiện ra các qui luật di truyền cơ sở đầu tiên và qua đó suy ra sự tồn tại tấtyếu của các đơn vị di truyền đặc thù – nhân tố di truyền (genetic factor) – qui định các tínhtrạng được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác mà ngày nay gọi là gen Tuy nhiên, giớikhoa học đương thời không hiểu hết được những vấn đề Mendel đã đưa ra, do đó không thểđánh giá được tầm vóc vĩ đại của phát minh này

Đến năm 1900, ba nhà thực vật học là Carl Correns của Đức, Hugo de Vries của HàLan và Erich von Tschermak của Áo độc lập nhau khám phá lại các qui luật di truyền củaMendel Và di truyền học chính thức ra đời từ đây, và người sáng lập chính là G Mendel

Trong những năm đầu của thế kỷ XX, nhờ ứng dụng di truyền Mendel, các nhà chọngiống đã phát hiện thêm các hiện tượng trội không hoàn toàn, đồng trội, gen gây chết, đaalen, tương tác gen…Ở giai đoạn này, ngoài thuyết đột biến của Hugo De Vries năm 1901,còn có hai sự kiện liên quan đến sự ra đời của thuyết di truyền NST và di truyền học Quần

Hình 2 T.H.Morgan và G Mendel

thể, đó là sự khởi xướng “thuyết nhiễm sắc thể” bởi Walterr Sutton và Thodor Bovary năm

1902 và việc thiết lập quy luật Hardy – Weingerg năm 1908

Trong thời kỳ này, một số thuật ngữ thông dụng đã được đề xuất như: di truyền học (genetics) bởi Bateson năm 1906, gen (gene), kiểu gen (genotype) và kiểu hình (phenotype) bởi W.

Johannsen năm 1909

* Sự ra đời và phát triển của thuyết di truyền nhiễm sắc thể

Năm 1910, Thomas Hunt Morgan cùng với 3 cộng sự là Alfred H Sturtevant, CalvinBridges và Herman J Muller đã xây dựng thành công thuyết di truyền nhiễm sắc thể dựa trên

đối tượng nghiên cứu là ruồi giấm Drosophila melanogaster Học thuyết này xác nhận rằng

gen là đơn vị cơ sở của tính di truyền nằm trên NST (trong nhân); trên đó các gen sắp xếptheo đường thẳng tạo thành nhóm liên kết Những đóng góp đáng kể của những người cộng

sự của Morgan đó là: Xây dựng bản đồ di truyền (Sturtevant 1913), chỉ ra cơ chế xác định cáckiểu hình giới tính của ruồi giấm (Bridges 1916) và phát triển phương pháp gây đột biến bằngtia X (Muller 1927) Với đóng góp to lớn đó Morgan đã được trao giải Nobel năm 1933 vàMuller năm 1946

Năm 1931, Barbara McClintock và Harriet Creighton thu được bằng chứng vật lý trực

tiếp về tái tổ hợp ở Ngô Sau đó, hiện tượng này được C Stern quan sát ở Drosophila Như

vậy tái tổ hợp có thể được phát hiện cả về mặt vật lý lẫn di truyền ở động vật cũng như ở thựcvật Đến 1944, McClintock phát hiện các yếu tố di truyền vận động, và bà đã được trao giảiNobel năm 1983 về khám phá này

* Sự ra đời và phát triển cuả di truyền học phân tử

Sự ra đời của di truyền học phân tử (Molecular genetics) gắn liền với khám phá về ADN

từ giữa thế kỷ XX trên đối tượng nghiên cứu chủ yếu là các vi sinh vật Tuy nhiên, trước đóFriedrich Miescher (1869) khám phá ra một hỗn hợp trong nhân tế bào gọi là nuclein màthành phần chính của nó sau này được biết là ADN

Hình 4 Mc Clintock

4

Về mối quan hệ giữa gen và protein, từ 1902 Archibald Garrod qua nghiên cứu bệnhAlcaptonuria ở người đã gọi ý rằng đây là một tính trạng lặn Mendel, có thể liên quan tới sựsai hỏng một enzyme Bằng các thí nghiệm gây đột biến các gen liên quan đến con đường

sinh hoá trên nấm mốc Neurospora, năm 1941 George Beadle và E.L.Tatum xác nhận mỗi

gen kiểm soát sự tổng hợp một enzyme đặc thù Chính giả thuyết một gen - một enzyme nổitiếng này đã mở đường cho sự ra đời của di truyền hoá sinh, và hai ông đã được trao giảiNobel cùng với Joshua Lederberrg năm 1958 Về sau, giả thuyết này được chính xác hoá làmột gen xác định một polypeptide - cấu trúc sơ cấp của các protein, trong đó có các enzyme

Vậy bản chất của gen là gì ? Năm 1944, Oswald Avery và các cộng sự là MacLeod vàMcCarty bằng thí nghiệm biến nạp in vitro đã chứng minh rằng ADN là vật chất mang thôngtin di truyền Năm 1949, Erwin Chargaff công bố các kết quả đầu tiên về thành phần hoá họccủa ADN một số loài

Việc nghiên cứu cấu trúc phân tử ADN được bắt đầu từ 1951 với các dẫn liệu nhiễu xạtia X của Rosalind Franklin và Maurice Wilkins Các số liệu hoá học và vật lý này là cơ sở

mà từ đó James Watson và Francis Crick đã xây dựng thành công mô hình cấu trúc phân tửADN năm 1953, còn gọi là chuỗi xoán kép (double helix) Phát minh vĩ đại này mở ra kỷnguyên mới cho sự phát triển của di truyền học và sinh học nói chung Với phát minh đó,Watson và Crick cùng với Wilkins được trao giải Nobel năm 1962

Sau sự ra đời cấu trúc chuỗi xoắn kép là hàng loạt các khám phá mới Năm 1958Matthew Meselson và Franklin Stahl chứng minh sự tái bản bảo toàn của ADN ; năm 1961Seymour Benzer hoàn tất công trình nghiên cứu cấu trúc tinh vi của gen, Francois Jacob vàJacqué Monod tìm ra cơ chế điều hoà sinh tổng hợp Protein và đạt giải Nobel cùng với

Hình 5: Từ trái qua phải: Miescher, Beadle, Tatum, Jacob và Monod

Hình 6: Từ trái qua phải: Avery, Franklin, Wilkins và Chargaff

Andrre Lwoff năm 1965 ; S Brenner, Jacob và Meselson khám phá ra ARN thông tin ;S.Brenner và F.Crick chứng minh mã di truyền là mã bộ ba ; công trình giải mã di truyền nàyđược hoàn tất vào tháng 6 năm 1966 bởi hai nhóm nghiên cứu của Marshall Nirenberg và HarGobind Khorana (giải Nobel năm 1968).

* Sự ra đời và phát triển của công nghệ ADN tái tổ hợp

Nền tảng của công nghệ ADN tái tổ hợp được thành lập năm 1972 khi Paul Berg tạo raphân tử ADN tái tổ hợp đầu tiên trong ống nghiệm Một năm sau, Herbert Boyer và StanleyCohen lần đầu tiên sử dụng plasmid để tạo dòng ADN Lĩnh vực ứng dụng mới này của sinhhọc phân tử đã tạo ra một cuộc cách mạng mới trong sinh học Đóng góp đang kể trong lĩnhvực này là khám phá về các enzyme giới hạn (restriction endonuclease) từ năm 1961-1969của Werner Arber, Daniel Nathans và Hamilton Smith (giải Nobel năm 978) ; đề xuất cácphương pháp xác định trình tự bazơ trong các axit nucleic năm 1977 bởi P.Berg, W.Gilbert vàFrederick Sanger (giải Nobel hoá học năm 1980) ; sự khám phá ra các gen phân đoạn năm

1977 bởi Phillip Sharp và Richard Robert (giải Nobel năm 1993) ; sự phát minh phương phápPCR của Kary B.Mullis năm 1985 và phương pháp gây đột biến định hướng của MichaelSmith từ 1978-1982 (giải Nobel háo học năm 1993)

Cùng với những thành tựu ứng dụng ly kỳ trong sản xuất và đời sống xã hội, như việcsản xuất các chế phẩm y sinh học bằng công nghệ ADN tái tổ hợp, sử dụng các liệu pháp gentrong điều trị bệnh di truyền, tạo các giống sinh vật mới bằng con đường biến đổi gen, dự án

Hình 7: Từ trái sang phải: Watson, Crick, Khorana và Nirenberg

Hình 8: Từ trái sang phải: P Berg, H.Boyer and S.Cohen, F.Sanger, W.Gilbert

6

bộ gen người cũng gây không ít hoài nghi, tranh cãi xung qanh các vấn đề về đạo lý sinh học(biothics) và an toàn sinh học (biosafety).

III BA NHÁNH NGHIÊN CỨU CHÍNH CỦA DI TRUYỀN HỌC

Trong giai đoạn đầu, đối tượng của di truyền học là thực vật, động vật, người và visinh vật Từ đó dẫn tới sự hình thành các lĩnh vực nghiên cứu tương ứng là di truyền họcthực vật, di truyền học động vật, di truyền học người và di truyền học vi sinh vật, trong đó ditruyền học tế bào là cơ sở Giai đoạn này kéo dài thời Mendel cho đến thập niên 1940, vớiđặc trưng là nghiên cứu qui luật di truyền các tính trạng qua các thế hệ Vì vậy nó thườngđược gọi là giai đoạn di truyền học Medel hay di truyền học cổ điển (Mendelian or clasicalgenetics)

Từ thập niên 1950 đên nay, với sự ra đời của di truyền học phân tử, đối tượng nghiêncứu là tổ chức, cấu trúc, chức năng và cơ chế hoạt động của các bộ gen, các gen và các sảnphẩm của chúng Đặc biệt với sự ra đời của các kỹ thuật tạo dòng gen từ thập niên 1970, việcnghiên cứu cơ bản cũng như ứng dụng trở nên hết sức thuận lợi Sự phân hoá thành cácchuyên ngành lúc này là vô cùng phong phú và đa dang như: di truyền học bệnh, di truyềnhọc ung thư, di truyền học phát triển, công nghệ sinh học

Một hướng khác của di truyền học là chuyên nghiên cứu cấu trúc di truyền của cácquần thể và giữa các quần thể Đó là di truyền học quần thể mà nguyên lý cơ sở của nó đượcG.Hardy (Anh) và W.Weinberg (Đức) độc lập đưa ra năm 1908 Tuy nhiên lĩnh vực nghiêncứu này chỉ thực sự bắt đầu từ thập niên 1930 với các công trình của R.A.Fisher,J.B.S.Haldane và Sewall Wright Ngày nay các nhà di truyền học không còn thiên về nghiêncứu sự biến đổi ở mức kiểu hình mà tập trung vào sự biến đổi phân tử trong một quần thểnhằm tìm hiểu ý nghĩa tiến hoá của các biến đổi đó Và di truyền học quần thể trở thành nềntảng cho các thuyết tiến hoá hiện đại

IV CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CỦA DI TRUYỀN HỌC

* Các phương pháp kinh điển đặc thù

- Phương pháp tự thụ phấn dùng để chọn cácdòng thuần làm bố mẹ trong các phép lai,các phương pháp lai một hoặc đồng thời nhiều tính trạng giữa các bố mẹ do Mendel đề xuất.Trong đó bao gồm cả các hình thức lai thuận nghịch và lai phân tích nhằm kiểm tra kiểu genhoặc dung để thiết lập bản đồ di truyền

- Đối với nghiên cứu di truyền người và một số vật nuôi giao phối cận huyết, đặc trưng

là phương pháp phân tích phả hệ nhằm xác định đặc điểm di truyền trội lặn của một tính trạnghoặc bệnh tật; nghiên cứu trẻ sinh đôi cùng trứng và khác trứng nhằm xác định hệ số ditruyền của tính trạng; phương pháp gây đột biến kết hợp lai hữu tính dùng trong nghiên cứu

và chọn tạo giống, đặc biệt là ở thực vật…

* Phương pháp toán học

Toán thống kê và sác xuất được dùng để phân tích định lượng và lý giải các kết quảnghiên cứu Chính điều này làm cho di truyền học trở thành một khoa học chính xác và mangtính dự báo Điều này thể hiện rõ trong các công trình nghiên cứu của Mendel, Morgan cũngnhư các nghiên cứu di truyền số lượng và di truyền quần thể

* Phương pháp vật lý và hoá học

Trong nghiên cứu di truyền, đặc biệt là di truyền phân tử và tế bào đòi hỏi phải sửdụng các kỹ thuật và phương pháp của vật lý và hoá học Chảng hạn, trong nghiên cứu hìnhthái NST không thể thiếu các loại kính hiển vi quang học và điện tử, các kỹ thuật nhuộmbăng; nghiên cứu thành phần hoá học và cấu trúc ADN đòi hỏi các phương pháp sắc ký vànhiễu xạ tia X…

* Phương pháp tế bào học

Trong nghiên cứu di truyền tế bào có rất nhiều phương pháp được sử dụng để quan sáthình thái NST và thiết lập kiểu nhân của các loài cũng như để chẩn đoán các bệnh tật liênquan đến sự biến đổi số lượng và cấu trúc NST

Ngoài ra còn có các kỹ thuật nuôi cấy mô, kỹ thuạt hiện băng, kỹ thuật lai huỳnhquang tại chỗ và các kỹ thuật miễn dịch tế bào…

* Phương pháp sinh học phân tử

Sự tiến bộ nhanh chóng của sinh học phân tử và công nghệ sinh học là nhờ sự pháttriển mạnh mẽ của các kỹ thuật ADN tái tổ hợp, lai phân tử,sử dụng các mẫu dò và phươngpháp đánh dấu khác nhau, kỹ thuật PCR, kỹ thuật dấu vân ADN, các phương pháp xác địnhtrình tự axit nucleic, phương pháp biến đổi vật liệu di truyền…Chính những công cụ kỹ thuậthiện đại này cho phép đi sâu nghiên cứu tổ chức và cấu trúc của các gen và của cả bộ gen, các

cơ chế điều hoà và biến đổi di truyền ở mức phân tử cũng như các thành tựu ứng dụng mớitrong y sinh học, nông nghiệp và các lĩnh vực khác

V CÁC NGUYÊN TẮC NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN HỌC

- Tế bào là đơn vị cấu trúc, chức năng và phát triển của mọi cơ thể sống, nghĩa là cótính toàn năng

- Thông tin di truyền chứa trong bộ gen của tế bào chi phối mọi biểu hiện sống của nó

mà các gen là đơn vị di truyền cơ sở

- Sự hoạt động của các gen trong quá trình phát triển cá thể là đặc trưng cho từng gentrong từng giai đoạn cụ thể

- Các quá trình trong hệ thống sống được điều hoà và kiểm soát để đảm bảo cho sự tồntại của nó là liên tục, phổ biến là sự tự điều chỉnh bằng cơ chế phản hồi thông tin

8

- Tính thống nhất giữa cấu trúc và chức năng biểu hiện ở tất cả các mức độ tổ chứckhác nhau của sự sống.

- Tất cả các tổ chức và quá trình sống đều tuân theo các quy luật vật lý và hoá học

- Sự sống trên trái đất trải qua quá trình tiến hoá khoảng 3.5 tỷ năm qua, vì vậy khi sosánh, những nét tương đồng giữa chúng cho thấy tính thống nhất về mặt nguồn gốc và nhữngnét dị b iệt cho thấy tính phát trỉên, sự phân hoá đa dạng tất yếu của chúng

10

CHƯƠNG I.

VẬT CHẤT DI TRUYỀN

Mục tiêu:

- Trình bày và phân tích được các tiêu chuẩn của vật chất di truyền

- Khái quát được các thí nghiệm chứng minh VCDT là Axit nucleic

- Trình bày được cấu tạo và cấu trúc của VCDT; phân tích được mối quan hệgiữa cấu trúc, hình dạng và chức năng của VCDT

- Phân tích được sự tiến hóa của VCDT

- Trình bày và phân tích được sự tái bản AND, quá trình phirn mã ngược,nguyên phân, giảm phân

- So sánh được cấu trúc và chức năng của AND và ARN, Nguyên phân vàGiảm phân

- Vận dụng lý thuyết để giải được các bài tập liên quan

I CÁC TIÊU CHUẨN CỦA VẬT CHẤT DI TRUYỀN (VCDT)

VCDT đóng vai trò trọng yếu trong cấu tạo và hoạt động của tế bào và cơ thể, do đó nóphải có đầy đủ các tiêu chuẩn sau:

I.1 Mang thông tin di truyền đặc trưng cho loài (Đặc tính thông tin – information)

VCDT phải chứa đựng thông tin ở dạng bền vững cần thiết cho việc sản sinh ra các phân

tử cần cho cấu tạo và hoạt động của tế bào

Tiêu chuẩn này bao gồm:

+ Tính chất của gen cấu trúc: VCDT phải có khả năng đặc trưng cho cấu trúc của các

phân tử khác trong tế bào Từng đoạn các nucleotide trên ADN gen cấu trúc với thành phần

và trình tự sắp xếp riêng, qui định từng đoạn axit amin trên một polypeptid

+ Tính chất của gen điều hoà: VCDT phải có khả năng điều hoà hoạt động của gen.

Một số vùng của ADN trên một operon, có các gen điều hoà và gen khởi động, hoạt động như

các khoá hãm để ngắt ( kìm hãm, ức chế) hoặc mở ( kích thích, cảm ứng) hoạt động của gen

I.2 Tính chất tự sao, có khả năng tái bản một cách chính xác (Đặc tính tái bản –

Replication)

VCDT phải có khả năng tự tái tạo một cách chính xác để thông tin di truyền của thế hệsau giống như của thế hệ trước

I.3 VCDT phải có khả năng biến đổi (Đặc tính đột biến – mutation)

VCDT trong quá trình tái bản dù cho chính xác đến đâu vẫn phải xảy ra các sai sót (độtbiến) vì đột biến là nguồn biến đổi cơ sở cần thiết cho sự tiến hoá của một loài, trong khi vẫnduy trì sự ổn định cần thiết

I.4 Thông tin di truyền chứa trong VCDT phải được sử dụng để tạo ra những phân tử cần thiết cho tế bào (Đặc tính truyền thông tin đến sản phẩm – transmission)

II AXIT NUCLEIC

II 1 Chứng minh axit nucleic mang thông tin di truyền

Trong một thời kỳ dài, một số nhà nghiên cứu, đặc biệt là nghiên cứu protein, tin rằngchính gen là protein, nhiễm sắc thể chứa các mô hình điều khiển mọi protein cần thiết cho tếbào, các enzim và protein hoạt động trong tế bào được sao chép từ các mô hình điều khiểnnày

Những năm sau đó, giả thuyết này không còn đứng vững vì nhiều thực nghiệm đãchứng minh protein không có khả năng tái sinh - một tiêu chuẩn cơ bản của VLDT

II.1.1 Thí nghiệm Griffith

Năm 1928, Frederick Griffith, một nhà vi khuẩn học đã làm thí nghiệm trên

Pneumococcus, vi khuẩn gây viêm phổi.

Vi khuẩn này có hai dạng:

Qua mổ xác chuột để phân tích, ông các nhận các chuột này chết chính là do yếu tốđộc của vi khuẩn độc, có vỏ, tuy đã chết nhưng vẫn truyền được yếu tố độc này cho vi khuẩnlành và sống, biến các vi khuẩn sống này từ chỗ lành, không vỏ, thành dạng độc, có vỏ và gây

ra viêm phổi ở chuột thí nghiệm

Vài năm sau, các thí nghiệm này được lặp lại trong ống nghiệm, đã phát hiện chínhxác là những chất tách ra từ vi khuẩn chết, có vỏ, độc đem bổ sung cho vi khuẩn lành, không

vỏ, sẽ có khả năng biến những vi khuẩn lành này thành dạng độc và có vỏ Khi đã được biếnđổi, các vi khuẩn mới này có khả năng truyền lại các đặc điểm mới thu nhận cho thế hệ sau

12

Hình 1.1 : Thí nghiệm của Griffith năm 1928 (A), của Avery và cộng sự năm 1944 (B)

Năm 1944, O.T.Avery và cộng sự đã xác định chất hoá học trong dịch chiết tế bào của

vi khuẩn chết truyền sang cho vi khuẩn sống chính là ADN

II.1.2 Các chứng minh trên thực thể khuẩn

Năm 1940, Max Delbruck và Salvador Luria đã bắt đầu sử dụng một loại đối tượngmới là các virut lây nhiễm, kí sinh trong các vi khuẩn, gọi là thực thể khuẩn (Bacteriophage,hay gọi đơn giản là phage)

Thí nghiệm được tiến hành trên 7 loại virut gây nhiễm E Coli, được gọi là nhóm thực

thể khuẩn T, đánh số từ T1 đên T7 Tế bào vi khuẩn bị nhiễm virut này, của khoảng sau 20phút là bị tan vỡ, giải phóng hàng trăm virut mới, tất cả đều là những bản sao chính xác củavirut ban đầu

(A)

(B)

Các phân tích hoá học trên thực thể khuẩn cho thấy chúng gồm có ADN và protein,nhưng những năm 1940, người ta vẫn chưa rõ về hai loại chất này, chất nào là VCDT, người

ta chưa rõ các gen của virut, VCDT mà từ đó sinh ra các virut mới trong tế bào vi khuẩn lànằm trên ADN hay protein

II.1.3 Thí nghiệm Hershey – Chase

Một dòng E.Coli nuôi cấy được lây nhiễm phage đánh dấu 32P, dòng kia 35S Sau khi

chu trình lây nhiễm bắt đầu, các tế bào lây nhiễm được ly tâm để tách các mảng virut cònbám ngoài tế bào Hai mẫu, một chứa vật chất bên trong tế bào và một chứa vật chất ngoài tếbào, được đem phân tích phóng xạ Người ta phát hiện 35S nằm lại ngoài tế bào vi khuẩn với

vỏ bọc virut trống rỗng và 32P thì nằm bên trong tế bào, trong số này sau khi lây nhiễm vào

vi khuẩn sinh sản cho thế hệ virut mới Chứng minh VCDT của T2 là ADN

II.2 Cấu trúc phân tử của ADN và ARN

II.2.1 ADN (axid deoxyribonucleic)

Lịch sử nghiên cứu cấu trúc ADN gắn liền với lịch sử phát triển của di truyền học hiệnđại và sự ra đời của di truyền học phân tử

1890, Mise (Đức) đã phát hiện phân tử ADN cùng với những protein kết hợp với nótrong nhân tế bào

Năm 1952, A.D.Hershey

và trợ lý của ông là M.Chase

dùng hai mẫu virut, một mẫu

trên ADN được đánh dấu bằng

đồng vị phóng xạ 32P, mẫu kia

trên protein được đánh dấu

bằng động vị phóng xạ 35S

E.Coli là vật chủ, được phát

triển trên môi trường đồng vị

phóng xạ Sau một chu kỳ sinh

trưởng, các virut mới sinh ra

đều chứa một đồng vị phóng xạ

32P và 35S, được dùng là chất

đánh dấu đặc thù để phân biệt

ADN với protein

Hình 1.2 : Thí nghiệm Hershey – Chase

14

1924, R.Feulgen bằng phương pháp nhuộm màu và định vị ADN đã cho thấy ADNnằm trong Nhiễm sắc thể.

1944, Avery, Macleod, Mc Carti đã chứng minh được ADN là VCDT

Wilkin bằng phương pháp nhiễu xạ chiếu các chùm ronghen qua ADN tinh khiết chothấy rằng các nucleotide trong ADN được phân bố từng cặp

Sau đó, Năm 1953, Watson (Mỹ) và Crick (Anh) đã nghiên cứu tiếp và nêu ra mô hìnhcấu trúc phân tử ADN dưới dạng chuỗi xoắn kép

ADN là một phân tử trùng hợp (polymer), gồm nhiều đơn phân (monomer) gọi là cácnucleotide

Một nucleotide có cấu tạo gồm 3 thành phần:

- Đường pentose, 5 carbon,là đường deoxyribose ( C5H10O4)

- Dẫn xuất của purin, gồm Adenin (A) và Guanin (G)

- Dẫn xuất của pyrimidin gồm Timin (T) và Xytodin (X)

Một bazơ nitơ liên kết cộng hoá trị với gốc đường ở vị trí thứ nhất tạo nên nucleoside.Nucleoside liên kết với một nhóm phosphate tạo nên nucleotide Các nucleotide được nối vớinhau thành chuỗi polynucleotide, qua các nhóm phosphat và đường pentose - mỗi gốc axitphosphoric liên kết với nguyên tử carbon số 5’ của một gốc đường khác, qua các liên kếtphosphodieste

Hai mạch đơn polynucleotide xoắn nhau thành một chuỗi xoắn kép, trong đó bazơ nitơcủa mạch này liên kết với bazơ nitơ của mạch kia bằng cầu nối hyđro, theo nguyên tắc bổsung:

+ A của mạch này liên kết với T của mạch kia bằng 2 liên kết Hydro

+ G của mạch này liên kết với X của mạch kia bằng 3 liên kết Hydro

Mô hình ADN dạng B của Watson và Crick cho thấy mỗi vòng của chuỗi xoắn képgồm 10 cặp bazơ nitơ và có chiều dài 34A0, vì khoảng cách giữa 2 cặp bazơ liền nhau là3.4A0

Hai sợi trong phân tử ADN có tính chất định hướng ngược chiều và đặc biệt của liênkết 3’-5’ phosphodieste, dẫn đến tính chất phân cực đối ngược, song song ngược chiều nhaucủa 2 sợi, từ 3’-5’ và ngược lại 5’-3’

ADN có cấu tạo đa phân, do nhiều đơn phân hợp lại, có cấu tạo nhiều bậc, dẫn đếntính đa dạng và đặc trưng của sinh giới Ở mỗi loài, ADN có trình tự nuceotide riêng đặc thù

và có số lượng nucleotide khác nhau, có thể từ 5000 ở một virut đơn giản nhất đến 5000 tỷtrong bộ 46 nhiễm sắc thể ở người

Trong hai chuỗi polynucleotide, đường carbon và phosphat đều giống nhau ở mọi phân

tử ADN Tính đặc thù của từng loại ADN là do các kiểu liên kết khác nhau của 4 loại bazơnitơ A, G, T, X

E Chargaff, qua thực nghiệm thuỷ phân ADN, đã phát hiện “Bao giờ tổng số các bazơpurin trong bất kỳ phân tử ADN nào cũng bằng tổng số các bazơ pyrimidin”

Trong các loại tổ chức ở động vật và thực vật, luôn luôn về mặt số lượng đều có:

A=T, tức A/T=1G=X, tức G/X=1Như vậy bao giờ cũng có tỷ lệ: A+G/T+X=1

Điều này chứng minh rằng: Trong phân tử ADN, bao giờ một bazơ purin cũng đứngtrước một bazơ pyrimidin và ngược lại

Tỷ số A+T/G+X khác 1 trong phần lớn trường hợp rất khác nhau trong các loại ADNcủa các loài sinh vật, nhưng lại là đặc trung cho loài Ở mỗi loài tỷ số này lại là một hằng số.Người ta gọi đây là tỷ số bazơ

Nguyên lý bổ sung có tầm quan trọng đặc biệt đối với hiện tượng di truyền, đảm bảocấu trúc đặc trưng của axit nucleic, biểu hiện không chỉ trong cấu trúc của ADN mà còn trongcác cơ chế tự sao ADN, cơ chế sao mã, dịch mã

Ngày nay người ta đã phát hiện trên 20 dạng xoắn phải khác (điển hình là các dạngA,C,D ) phân biệt với ADN dạng B về khoảng cách giữa các bazơ, cũng như độ nghiêng củacác bazơ so với trục và sự phân bố của chúng trên chuỗi xoắn kép

Gần đây người ta còn phát hiện một dạng ADN có bộ khung ziczắc, cả phân tử đóngxoắn theo chiều xoắn trái và trên mỗi vòng xoắn có đến 12 cặp bazơ Cấu trúc này được gọi

là ADN dạng Z (Theo Watson và Rich, đây là một dạng chuyển dạng của ADN dạng B )

II.2.2 ARN (Axit Ribonucleic)

ARN là vật chất mang thông tin di truyền ở một số đối tượng sinh vật, như ở virus

khảm thuốc lá (Tabaco mosaic virus, TMV), là virus chỉ chứa lõi ARN và vỏ Protein Thông

tin di truyền của virus này chứa trong ARN, không phải trong protein

ARN có vai trò trung gian, làm cầu nối giữa ADN với protein

Về mặt cấu trúc, ARN cũng là một chất trùng hợp, gồm nhiều nucleotide gắn nhau,giống như chuỗi đơn của phân tử ADN, hình thành một chuỗi đơn polynucleotide

Cấu trúc phân tử ARN khác với ADN ở 3 đặc điểm:

- Đường của ARN là đường ribose (C5H10O5)

- Một trong 4 loại bazơ nitơ có khác trong ADN, thay vào Timin(T) là Uraxyl (U).

- ARN chỉ là một sợi đơn polynucleotide.

Ở prokaryote và Eukaryote đều có 3 loại ARN được phiên mã, sau đó được sửa đổi để tham gia vào quá trình dịch mã

Hình 1.4 Mô hình liên kết hydro và cấu trúc xoắn kép dạng A, B và dạng Z

II.2.2.1 ARN thông tin (messenger RNA, mARN)

Là loại ARN quan trọng nhất, có cấu trúc mạch thẳng, được dùng làm khuôn mẫu đểtổng hợp chuỗi polypeptid Mỗi mARN nói chung có 3 phần chính:

Hình 1.6 : Sơ đồ cấu trúc chung của mARN ở prokaryote và eukaryote

- Đoạn dẫn đầu (leader): Nằm ở đầu 5’, không được dịch mã nhưng cần thiết để cho

tiểu đơn vị bé ribosome bám vào

- Đoạn mã hoá (coding): Nằm kế cạnh đoạn dẫn đầu, chứa thông tin cấu trúc của

chuỗi polypeptid được tổng hợp Đoạn này ở các mARN khác nhau thì khác nhau về sốlượng, thành phần, trật tự các ribonucleotid

Phân tử mARN eukaryote chỉ mang thông tin cấu trúc của một polypeptid(monocistron) vì vậy trình tự mã hoá của mARN trưởng thành là liên tục, nhưng phân tử

Hình 1.5 Sơ đồ cấu trúc của đoạn phân tử ARN

18

mARN prokaryote nói chung thường mang thông tin cho nhiều polypeptid (polycistron) Vìvậy trong đoạn mã hoá có nhiều đoạn đệm tách biệt giữa chúng.

- Đoạn theo sau (trailer): Nằm ở phía 3’, ngay sau đoạn dịch mã, không được mã

hoá

II.2.2.2 ARN vận chuyển (transfer RNA, tARN)

Các tARN có chức năng chính là vận chuyển các axit amin đến vị trí tổng hợp proteintrên phức hệ mARN-ribosom trong quá trình dịch mã tARN có số lượng nucleotid khoảng75-90 Trong thành phần của nó thường có một số bazơ hiếm như Inosin(I),ribotimidin(T) tập trung ở các “vòng “ (loop) là nơi không có hiện tượng kết cặp bazơ nộiphân tử

Về cấu trúc, tARN có cấu hình không gian ba chiều dạng “lá chẻ ba” vững chắc là nhờ

sự kết cặp của các bazơ ở một số đoạn sau khi phiên mã Nói chung, các tARN thường rấtgiống nhau ở nhiều đoạn và sai khác chủ yếu là ở anticodon Mỗi tARN thường có 3 – 4 vòngchức năng như sau:

+ Vòng 1 chứa 8-12 bazơ, còn gọi là vòng DHU, có chức năng nhận biết enzymaminoaxyl-tARN synthetase ( kết hợp a.amin vào đầu 3’ của tARN)

+ Vòng 2 chứa 7 bazơ, gọi là vòng đối mã, có chức năng đọc mã trên tARN bằng cáchkết cặp các bazơ của anticodon với codon

+ Vòng 3 còn gọi là tay phụ, có thể không có ở một số tARN

+ Vòng 4 chứa 7 bazơ, gọi là vòng TYC có chức năng nhận biết ribosom để đi vàođúng vị trí tiếp nhận aminoaxyl-tARN

Đoạn mạch thẳng –CCA-OH (3’) là nơi gắn a.amin vào

Hình 1.7 Cấu trúc tổng quát của một phân tử tARN II.2.2.3 ARN ribosom (Ribosom RNA, rARN) và ribosom

Các rARN là thành phần cùng với các protein đặc trưng cấu tạo nên ribosom Ở vikhuẩn có 3 loại rARN khác nhau với hệ số lắng là 23S,16S,5S Ở các eukaryote có 4 loạirARN với hệ số lắng là 28S,18S,5.8S,5S.

Mỗi ribosom gồm có hai tiểu đơn vị: tiểu đơn vị bé là nơi bám của mARN trong quátrình dịch mã và tiểu đơn vị lớn chứa enzym peptidyl transferase có hai vị trí là A (nơi bámcủa aminoaxyl-tARN) và P (nơi đính của peptidyl-tARN) Hai tiểu đơn vị này chỉ hợp nhấttạo ra ribosom trong quá trình dịch mã

* Ngoài các loại ARN tế bào chất, ở eukaryote còn có hai loại ARN nhân: ARN nhânnhỏ (snARN) có trọng lượng phân tử thấp, là thành phần của enzym cắt nối quan trọng trongquá trình chế biến ARN thông tin sơ cấp; ARN nhân không đồng nhất (HnARN) có kíchthước rất khác nhau (5000-50000 nucleotid) và dài gấp 10-100 lần so với mARN tế bào chất,chúng chính là tiền thân của mARN sau này

* Các dạng ARN này đều thực hiện chức năng chung là truyền thông tin di truyền từADN đến protein (thể hiện tính trạng di truyền) Đặc biệt chỉ có mARN là bản phiên mã ditruyền chứa các mã bộ ba (codon) tương ứng với một axit amin của phân tử protein Thựchiện chức năng trực tiếp chuyển tải thông tin di truyền từ phân tử ADN đến bản dịch mã biểuhiện ở phân tử protein

II.3 Tái bản ADN (Replication)

Sự tái bản của ADN, còn gọi là tự sao, tự nhân đôi của ADN, dựa trên cơ sở sự tái sinhcủa nhiễm sắc thể (NST), bảo đảm cho sự tái tạo trong nhân tế bào con mới được hình thànhqua phân bào toàn bộ thông tin di truyền đặc trưng của tế bào ban đầu

Quá trình tái bản ADN trong tế bào sống đã được chứng minh qua thực nghiệm làkhông mang tính chất tự động Để thực hiện quá trình này thì trong tế bào chất của tế bào đãphải có những quá trình sinh tổng hợp mới, các nucleotide được tạo ra trong tế bào do sự kết

Hình 1.8 Sơ đồ cấu tạo các ribosom của prokaryote và eukaryote

20

hợp các chất đường ribose, axit amin, CO2 và NH3, hoặc bằng cách hình thành từ các axitnucleic trong tế bào bị phân huỷ, chuyển hoá trở lại thành các nucleotide cần thiết cho tổnghợp axit nucleic.

II.3.1 Hệ enzym tái bản ADN

Trong toàn bộ hệ thống enzym sửa đổi điều chỉnh axit nucleic đã được phát hiện trong

tế bào thì hệ enzym tham gia tái bản ADN chiếm vị trí quan trọng nhất, trong đó chủ yếu phải

kể đến ADN polymerase

II.3.1.1 ADN polymerase ở E.Coli

Gồm có 3 loại là: ADN polymerase I, ADN polymerase II, ADN polymerase III được

ký hiệu là Pol I, Pol II, Pol III Pol III là enzym có hoạt tính polymerase cao nhất và đóng vaitrò chủ chốt trong tổng hợp kéo dài các sợi ADN mới; Pol II có hoạt tính thấp nhất và vai tròtrong tái bản không rõ ràng; Pol I có hai vai trò chính là tổng hợp ADN thay thế và cắt bỏđoạn mồi nhờ hoạt tính polymerase và exonuclease 5’-3’

Bảng 1.1 Đặc tính của các ADN polymerase ở E.Coli

cópolA

1120.000rất thấpcókhôngpolB

3175.000rất caocócópolC (hoặc dnaE)

II.3.1.2 ADN polymerase ở sinh vật nhân chuẩn

Ở sinh vật nhân chuẩn, sự tái bản ADN cũng cần có sự xúc tác của enzym polymerase,

cụ thể đã được xác định có 3 loại ở các sinh vật bậc cao Trong tổng số 3 loại enzyme này,người ta đã phát hiện trong nhân tế bào có hai loại là ADN polymerase α và ADN polymerase

β, còn ADN polymerase γ được phát hiện trong ti thể Nói chung, các enzym này rất biếnđổi, khác nhau về nhiều đặc tính, như đặc tính sắc kí, tính mẫn cảm với muối, trọng lượngphân tử ….Đồng thời có sự sai khác giữa các loài sinh vật, và có chức năng khác nhau

ADN polymerase α có chức năng tái bản ADN của nhân

ADN polymerase β được sử dụng vào việc sửa đổi ADN

ADN polymerase γ chỉ làm nhiệm vụ tái bản hệ gen ADN ti thể

Cả 3 loại ADN polymerase trên đều không có hoạt tính đọc sửa

II.3.2 Cơ chế tái bản ADN theo phát hiện của Okazaki: tái bản nửa gián đoạn

(semidiscontinous replication)

II.3.2.1 Hiện tượng duỗi xoắn

Dưới tác dụng của enzym duỗi xoắn hoặc mở xoắn (enzym derulase hoặc pivotase),xảy ra hiện tượng biến tính và dãn xoắn của chuỗi xoắn kép ADN, có sự đứt liên kết hydrogiữa các bazơ nitơ, dẫn đến giải phóng các chuỗi đơn polynucleotide của ADN, tạo nên chạctái bản (replication fork) hình chữ Y Ở sinh vật nhân nguyên thuỷ thì có vòng tái bản(replycation bubble)

Ở bước này có sự tham gia của một enzym gọi là enzym SSB(single-strand binding),tức là một protein bám sợi đơn, gắn trên ADN một sợi để sợi luôn luôn ở tình trạng mở xoắn

và được bền vững Mỗi SSB bám vào 8 bazơ nitơ của sợi đơn ADN Mỗi chạc tái bản cókhoảng 250 SSB

II.3.2.2 Bước khởi đầu tái bản ADN bằng ARN mồi

Các ADN polymerase không thể thực hiện việc khởi đầu cho sự tái bản ADN, do đógiai đoạn này đòi hỏi có một yếu tố mồi (primer) làm chức năng khởi động

Như ta đã biết, sự lắp ráp nucleotide tự do trong môi trường tế bào vào sợi khuôn, baogiờ cũng chỉ bắt đầu từ đầu 3’ của sợi, nói cách khác, sự kéo dài (elongation) được thực hiện

do gắn thêm nucleotide vào đầu OH của carbon 3’ tự do ADN polymerase chỉ xúc tác sự gắncủa một deoxyribonucleotide triphosphat trên cực 3’ OH, không có khả năng xúc tác sự gắncủa nucleotide trên cực 5’P của chuỗi đối diện, nhưng ngay lúc đầu, chưa có đầu OH tự do ởngay điểm gốc tái bản Vì thế, enzym ARN polymerase hoạt động tổng hợp nên đoạn ARNmồi ngắn, tạo đầu 3’OH tự do, để sau đó enzym ADN polymerase III bắt đầu hoạt động tái

bản Ở E.Coli, đoạn mồi là một đoạn ARN ngắn được sinh ra bởi enzym privase Trình tự các

bazơ nitơ của đoạn mồi được định hướng theo trình tự nucleotide của sợi ADN khuôn

II.3.2.3 Loại bỏ ARN mồi và hình thành những phân đoạn Okazaki

Sau khi ARN mồi được tổng hợp thì ADN polymerase I có hoạt động loại bỏ ARNmồi nhờ cắt từ đầu 5’ – 3’ và thay vào chỗ của ARN mồi một đoạn ADN khác

Sau khi ARN mồi được tổng hợp thì ADN polymerase I có hoạt động loại bỏ ARNmồi nhờ cắt từ đầu 5’ – 3’ và thay vào chỗ của ARN mồi một đoạn ADN khác

R.Okazaki (Nhật), 1969 là người đầu tiên phát hiện kiểu tái bản nửa gián đoạn củaADN, do đó người ta còn gọi cơ chế này là sự tổng hợp Okazaki Okazaki đã chứng minhphần lớn ADN mới tái bản đều là nhữngt đoạn ngắn từ 1000-2000 nucleotit Người ta gọi đây

là những phân đoạn Okazaki được bắt đầu bằng một đoạn ARN mồi ngắn, khoảng 10 đơn vị.Đoạn mồi này được dùng là chất mồi để kéo dài chuỗi polydeoxyribonucleotit, nucleotit đượcgắn vào đầu 3’OH tự do và nối dài chuỗi ra theo chiều 5’-3’ Sau khi loại bỏ đoạn mồi và lấp

22

đầy khoảng trống bằng tác dụng của ADN polymerase I thì các phân đoạn Okazaki được nốilại với nhau bằng enzym nối ADN ligase.

Hình 1.9 Tái bản kiẻu nủa gián đoạn.

Sợi ADN được tổng hợp bằng cách nối các đoạn Okazaki với nhau được gọi là sợi rachậm (lagging strand), hoặc sợi đi theo, là sợi được tổng hợp không liên tục, dùng khuôn sợi

cũ có định hướng 5’-3’

Sợi kia đựơc tổng hợp liên tục, dựa trên khuôn sợi cũ theo chiều 3’-5’, chiều mở củachạc ba, gọi là sợi dẫn đầu (leading strand) Đây là sợi mang đoạn mồi

Kiểu tái bản như trên đã trình bày, một sợi mới được tổng hợp liên tục theo khuôn sợi

cũ, theo chiều 3’-5’, chiều mở của chạc ba, sợi mới kia được tổng hợp gián đoạn, không liêntục, dùng khuôn sợi cũ có định hướng 5’-3’, được gọi là kiểu tái bản nửa gián đoạn

II.3.2.4 Nối các phân đoạn Okazaki nhờ enzym nối ligase

Khi sợi đi theo được hình thành thì đoạn mồi ARN được loại bỏ bởi ARN nuclease vànhững đầu tận cùng 5’ và 3’ của ADN được đồng thời đóng lại bởi ADN polymerase Cuốicùng các phân đoạn Okazaki được nối lại bởi ligase, tạo thành một sợi ADN mới liên tục nhưsợi dẫn đầu

Về các bước của quá trình nối các phân đoạn, khi xem xét cơ chế nối hai phân đoạn kếtiếp nhau, người ta thấy đầu 3’ của phân đoạn vừa mới được tổng hợp chỉ tiếp cận chứ khôngnối liền ngay với đoạn mồi ở đầu 5’ của phân đoạn được tổng hợp trước ADN polymerase III

vừa hoàn thành tổng hợp phân đoạn mới sẽ tách khỏi ADN, ADN polymerase I sẽ thế chỗ,tiếp tục tổng hợp phân đoạn mồi theo chiều 5’-3’, đồng thời do có hoạt tính exonuclease, nólại loại bỏ đoạn mồi của phân đoạn Okazaki trước đó theo chiều 5’-3’ Khi ADN polymerase

I kết thúc, thì tồn tại một khe hở giữa 2 phân đoạn Okazaki kế tiếp nhau Khe hở này được lấpkín bởi sự xúc tác của enzym nối ADN ligase

* Ở prokaryote, quá trình tái bản được xảy ra tại một khởi điểm, gọi là điểm OriC.Trong khi đó, hệ gen ở sinh vật nhân chuẩn (Eukaryote) là một hệ gen có kích thước lớn, do

đó trong một thời gian ngắn, đòi hỏi phải có nhiều khởi điểm được tái bản gần như đồng thời

để đảm bảo cho cả phân tử ADN của hệ gen được nhân đôi, trên cùng một NST có nhiều khởiđiểm tái bản

II.3.3 Những đặc điểm chung về tái bản ADN ở các prokaryote và eukaryote

- Sự tái bản ADN diễn ra theo kiểu bán bảo toàn (semiconservative)

- Quá trình tái bản ADN diễn ra với sự tham gia của nhiều protein và enzym khácnhau, quan trọng nhất là các ADN-polymerase

- Quá trình tái bản ADN được khởi đầu tại một hoặc một số vị trí đặc thù trên ADNgọi là khởi điểm (Origin)

- ADN polymerase tự nó không thể khởi đầu việc tổng hợp ADN mới mà cần phải cóđoạn mồi (primer), là một đoạn ARN ngắn (50-100 ribonucleotit) được tổng hợp trước bởienzym primase

- Vì ADN polymerase chỉ hoạt động theo chiều 3’- 5’, trong khi ADN khuôn có haisợi ngược chiều nhau cho nên ít nhất trên một sợi khuôn diễn ra sự tổng hợp không liên tục(gián đoạn) các đoạn ADN ngắn 1000-2000 nucleotit, gọi là tổng hợp Okazaki

- Một ADN polymerase khác tiến hành cắt bỏ đoạn ARN mồi và tổng hợp ADN thaythế, và các đoạn Okazaki cũng sẽ được nối liền nhờ ADN ligase

II.3.4 Các hình thức tái bản ở các ADN khác nhau

Hình 1.10: (a) Sự sao chép ADN bắt đầu từ một điểm, (b)Nhiễm sắc thể nhân chuẩn

có nhiều chạc tái bản

24

II.3.4.1 Tái bản ADN ở các hệ ADN vòng nhỏ: ADN plasmid và ADN virus

Ngoài ra, đối với hệ ADN vòng nhỏ còn có một hình thức tái bản nữa, đó là sự tái bản

kiểu Theta (()) ở vi khuẩn, như E.Coli, plasmid có dạng vòng, phân tử ADN trong đó cũng

có dạng vòng, sự tái bản bắt đầu tại một điểm mở đầu và đi theo hai chiều quanh vòng tròn, vìthế còn gọi là kiểu tái bản hai chiều (bidirectional) Đây còn gọi là kiểu tái bản theta vì cácphân tử tái bản giống chu Hy Lạp theta Riêng đối với virus HSV có cả hai hình thức tái bảnnói trên

II.3.4.2 Sao chép ở E coli- NST vi khuẩn chỉ có một điểm khởi đầu tái bản duy nhất

Hệ gen vi khuẩn của E coli chỉ chứa sợi ADN dài 4.6x106bp Sự nhân đôi ADN bắtđầu tại một điểm khởi đầu tái bản, hai chạc tái bản được hình thành ở đó và di chuyển về 2hướng (tốc độ khoảng 500 - 1000 Nu/giây) đối diện nhau cho đến khi gặp nhau ở điểm đối

diện bên kia của vòng ADN Chỉ ở điểm này, E coli có thể điều khiển sự tái bản là điểm khởi

đầu origin Sau khi hai chạc tái bản được hình thành chúng di chuyển gần như với tốc độkhông đổi cho đến khi kết thúc quá trình tự sao Hình thành một cấu trúc kiểu Theta (()) Vìthế sự khởi đầu tự sao là một quá trình điều hoà rất chặt chẽ, bắt đầu khi protein khởi đầu gắn

Hệ ADN này sử dụng cơ chế vòng

lăn (hay còn gọi là lăn đai thùng) để thực

hiện quá trình sao chép Bước đầu tiên trong

cơ chế này là hình thành một vết cắt trên

một sợi đơn cho phép tháo xoắn sợi ADN

chứa đầu 5’

Đầu tự do này nhanh chóng được

phủ bởi protein SSB theo sau là sự kết hợp

của primosome để tổng hợp mồi ARN và

khởi đầu tổng hợp ADN nhờ ADN

polymerase Đầu 3’ được mở rộng như hình

thức sợi dẫn đầu trong sao chép ADN thông

thường Đầu 5’ được tiếp tục “bóc” ra khỏi

vòng lăn và các đoạn Okazaki mới được

tổng hợp sẽ được nối lại với nhau Sau khi

hoàn thành xong một vòng lăn, một sợi

ADN vòng mới sẽ được tổng hợp, các đầu

cuối của ADN thẳng sẽ được nối lại hình

thành vòng thứ hai Và mỗi ADN mới cũng

chứa một sợi cũ theo nguyên tắc bán bảo

vào vị trí khởi đầu đặc hiệu trong origin, và quấn ADN quanh chúng hình thành phức hợpADN - protein Sau đó phức hợp này gắn vào helicase Cụ thể là phức hợp này đưa enzymelên vùng ADN đơn ngay gần kề, các base của nó được bộc lộ ra trong quá trình hình thànhphức hệ ADN - protein khởi đầu ADN primase kết hợp với helicase di chuyển ra xa chạc táibản để tổng hợp đoạn mồi Ngay lập tức các protein còn lại cũng sẽ tập hợp hình thành 2 chạctái bản với các phức hệ protein di chuyển về hai hướng ngược nhau tính từ origin Tiếp theophức hệ enzyme này sẽ tiếp tục tổng hợp ADN cho đến khi toàn bộ sợi ADN phía sau originđược hoàn tất Sau đó enzyme topo II sẽ hoàn thành nốt công việc còn lại là phân ly hai sợiADN cài xen vào nhau.

Ở E coli có sự điều hoà rất nghiêm ngặt mối quan hệ tương tác giữa protein khởi đầu

và origin tái bản, sao cho sự khởi đầu tái bản chỉ xảy ra trong điều kiện môi trường giàu dinhdưỡng, phức hệ origin - protein có thể hình thành trên phân tử ADN ngay khi chưa tổng hợpxong Bên cạnh sự điều hoà của protein khởi đầu, sự metyl hoá cũng góp phần vào sự kiểmsoát này (sự tự sao bị ngăn chặn khi các Nu A bị metyl hoá)

II.3.5 Tái bản của các bộ gen ARN

Phương thức tái bản ở các bộ gen ARN của virus khác với hệ thống tái bản ADN đãbiết Trước hết, các enzyme tổng hợp ARN không cần mồi, vì vậy không có cơ hội cho việcđọc sửa Ngoài ra về mặt di truyền, ARN là một phân tử kém bền vững so với ADN bởi nhómhydroxyl có mặt ở nguyên tử C2 của gốc đường cho phép thuỷ phân liên kết photphodiestergiữa hai ribonucleotide và tạo thành dạng photphodiester vòng giữa các nhóm hydroxyl của

Hình 1.12 : Cơ chế tái bản ở E Coli

26

C2 và C3 trong cùng một gốc đường; sau đó cấu trúc vòng này mở ra và để lại nhómphosphate ở vị trí C3 Sự kết hợp của hai đặc điểm trên là nguyên nhân hạn chế kích thướccủa bộ gen ARN Các bộ gen này không thể sinh trưởng quá lớn hoặc không thể tránh khỏi tỷ

lệ sai sót cao qua quá trình tái bản (10-3-10-4) Trên thực tế, bộ gen ARN có kích thước lớnnhất là bộ gen của virus gây bênh viêm phổi cấp (SARS) thuộc họ coronavirus có kích thước29.000bazơ Đây cũng chính là lý do tại sao các virus ARN cho nhiều biến thể khác nhau đếnvậy, mặc dù kích thước bộ gen không lớn Điều này thực sự trở thành mối hiểm hoạ bởi vìchúng có thể tiến hoá nhanh để xâm nhập vào các hệ thống miễn dịch của vật chủ Chẳnghạn, các bộ gen HIV có nhiều biến thể gây khó khăn cho việc bào chế các vaccine và thuốcchống lại tất cả các biến thể của nó

Có hai phương thức tái bản chính ở bộ gen ARN:

III NHIỄM SẮC THỂ VÀ SỰ PHÂN BÀO

Nhiễm sắc thể là những cấu trúc hiển vi trong nhân tế bào, có khả năng tự nhân đôi,bắt màu và giữ được màu basic, nhìn thấy được qua kính hiển vi thường trong quá trình tếbào phân chia, bao gồm ADN và các phân tử khác nằm trong một tổ chức phức tạp, chứa cácgen của cá thể sinh vật

Qua các phương pháp nuôi cấy tế bào ngoài cơ thể và phân tích tế bào học các tổ hợpnhiễm sắc thể đã cho phép, qua khảo sát thực nghiệm, xác định rằng nhiễm sắc thể mang tínhchất đặc trưng cho từng loài sinh vật, về mặt số lượng, hình thái, cấu trúc, đây là kết quả quátrình tiến hoá lịch sử lâu đổi của từng loài Nhiễm sắc thể tồn tại trong nhân tế bào soma củasinh vật nhân chuẩn bao giờ cũng thành từng cặp, gồm hai nhiễm sắc thể giống nhau về hìnhdạng, kích thước và cấu trúc đặc trưng được gọi là cặp nhiễm sắc thể cùng nguồn (hay cặpnhiễm sắc thể đồng dạng), trong đó có một nhiễm sắc thể có nguồn gốc từ mẹ, nhiễm sắc thểkia có nguồn gốc từ bố

III.1 Sinh sản hữu tính và sự ổn định bộ nhiễm sắc thể

Ở các Eukaryote có hai kiểu sinh sản chính, vô tính và hữu tính Sự sinh sản vô tính(asexual reproduction) xảy ra khi một cá thể đơn độc tạo ra một cá thể mới giống nó; đây làphương thức sinh sản phổ biến ở thực vật và động vật đơn bào Sự trinh sinh(parthenogenesis) là một trường hợp đặc biệt, sinh con không qua thụ tinh, con cái sinh ragiống với bố mẹ về mặt di truyền Sự sinh sản hữu tính (sexual reproduction) xảy ra khi các

cá thể tạo ra các tế bào sinh dục đực và cái, hay gọi là các giao tử (gametes), đến lượt chúngkết hợp với nhau tạo thành một tế bào trứng được thụ tinh gọi là hợp tử (zygote), là một tếbào hoàn chỉnh mà từ đó phát triển thành một cá thể mới Hình thức sinh sản này xảy ra ởtoàn bộ các nhóm sinh vật, kế cả các động vật đơn giản nhất, các thực vật, và thậm chí cả visinh vật Thông thường các giao tử đực và cái bắt nguồn từ các cá thể khác nhau, cho nên đờicon sinh ra khác với bố mẹ chúng về nhiều chi tiết

Bảng 1.2 Số lưỡng bội (2n) nhiễm sắc thể của một số loài

Mỗi bộ đơn bội chứa n nhiễm sắc thể khác nhau nằm trong tế bào sinh dục, mỗi chiếcchỉ có mặt một lần và chứa các gen khác nhau Tập hợp toàn bộ các gen trong một bộ nhiễmsắc thể đơn bội như thế được gọi là bộ gen (genome) Số lượng 2n nhiễm sắc thể trong tế bàosoma được gọi là lưỡng bội, các nhiễm sắc thể tồn tại theo từng cặp gồm hai chiếc giống nhau

về hình dạng, kích thước và trật tự phân bố các gen - một có nguồn gốc từ bố và một cónguồn gốc từ mẹ gọi là các nhiễm sắc thể tương đồng (homologus chromosomes) Ở sinh vật

đa bào, hợp tử tăng số lượng nhờ quá trình nguyên phân (mitosis), là kiểu phân chia tế bàotạo ra các tế bào con có số lượng nhiễm sắc thể 2n được giữ nguyên Khi cơ thể đạt đến độthành thục sinh dục, một số tế bào ở cơ quan sinh sản trải qua giảm phân (meiosis), tức kiểuphân chia tế bào tạo ra các phân tử có số lượng nhiễm sắc thể giảm đi một nửa(n) Quá trìnhnày được gọi là phát sinh giao tử (gametogenesis) ở động vật và phát sinh bào tử(sporogenesis) ở thực vật Sau đó, trong quá trình thụ tinh (fertilization), các giao tử cái haytrứng (egg) và giao tử đực hay tinh trùng (sperm) hợp nhất với nhau tạo thành các hợp tử đờicon Các hợp tử mới này lại bắt đầu đi vào một chu kỳ mới y hệt như vậy

Nhiễm sắc thể là sản phẩm của sự tiến hoá, có số lượng đặc trưng cho loài Bộ nhiễmsắc thể là một khái niệm đồng nghĩa với số lượng nhiễm sắc thể, chỉ số nhiễm sắc thể có thựctrong nhân tế bào

Ong mật (Apis mallifera)

Chuột nhà (Mus musculus)

Ruồi dấm (Drosophila melanogaster)

Thực vật:

Lúa gạo (Oryza Saviva)

Ngô (Zea mays)

Khoai tây (Solanum tuberosum)

Cà rốt (Brassica oleracea)

Củ cải (Beta vulgaris)

Cà chua (Lycopersicum osculentum)

46

4860

38 hoặc 4078387832:16408

242048181824

28

Người ta đã thấy là các loài sinh vật khác biệt nhau về mặt tiến hoá, không phải ở sốlượng nhiễm sắc thể, mà chủ yếu là về bản chất di truyền, thành phần gen chứa trong bộnhiễm sắc thể.

III.2 Hình thái và các loại nhiễm sắc thể Eukaryote

Trong từng bộ nhiễm sắc thể của từng loài, các cặp nhiễm sắc thể cùng nguồn cũng cóhình dạng, kích thước khác nhau giữa các cặp, có thể dễ dàng, qua kính hiển vi, đo, đếm,phân loại, sắp xếp theo cặp và đánh số thứ tự các cặp Để mô tả bộ nhiễm sắc thể của một loài

và xác định các nhiễm sắc thể của nó, cần phải thiết lập kiểu nhân (karyotype) và sử dụngmột hệ thống các quy ước dựa trên kích thước của chúng, vị trí tâm động và các kiểu băng.Kiểu nhân là một khái niệm đồng nghĩa một phần với bộ nhiễm sắc thể, nhưng trong kiểunhân, ngoài só lượng còn có cả hình dạng, kích thước của nhiễm sắc thể Hình vẽ hay hìnhchụp bộ nhiễm sắc thể ở kỳ giữa nguyên phân được phóng đại, cắt rời từng chiếc, sắp xếptheo thứ tự từng cặp tương đồng (vai ngắn quay lên trên và vai dài quay xường dưới) rồi sắpxếp, đánh số theo thứ tự từ chiếc lớn nhất đến chiếc nhỏ nhất về kích thước Ví dụ ở người,các nhiễm sắc thể không phải giới tính gọi là nhiễm sắc thể thường được đánh số từ 1-22, cácnhiễm sắc thể giới tính được xếp riêng và đánh số 23; vai ngắn của nhiễm sắc thể được biểuthị bằng p và vai dài được biểu thị bằng q dựa trên vị trí tâm động; mỗi vai được chia thànhnhiều vùng và sau đó được xác định bằng các băng Ví dụ ký hiệu 9q34 nghĩa là vai dài củanhiễm sắc thể số 9, vùng 3, băng 4-là nơi khư trú của gene xác định hệ nhóm máu ABO

Các nhiễm sắc thể thường khác nhau về vị trí tâm động-vị trí hạt trung tâm(centromere), là nơi bám của sợi thoi vô sắc trong các chu kỳ phân bào, nhìn rõ ở kỳ giữa và

kỳ sau của nguyên phân Thường thì mỗi nhiễm sắc thể chỉ có một eo thắt chứa một tâm độnggọi là eo sơ cấp (primary constriction), dựa người ta phân biệt 3 kiểu hình thái:

+ Nhiễm sắc thể tâm cân, hình chữ V, có hai cánh bằng nhau

+ Nhiễm sắc thể tâm lệch, 1 cánh ngắn, 1 cánh dài

+ Nhiễm sắc thể tâm mút, một cánh hết sức ngắn

Ngoài eo sơ cấp, một số nhiễm sắc thể còn có eo thứ cấp (secondary constriction), nếu

eo này nằm ở gần đầu mút và xảy ra sự thắt sâu sẽ tạo nên một vệ tinh của nhiễm sắc thể (ởngưới, đó là các nhiễm sắc thể 13, 14, 15, 21 và 22) Eo thứ cấp thường chứa các gen tổng

Hình 1.15 Bộ NST Ruồi giấm đực và cái

Hình thái nhiễm sắc thể đặc trưng

cho từng loài, được xác định rõ nhất là ở

kỳ giữa và các giai đoạn đầu của kỳ sau

trong nguyên phân, khi mà nhiễm sắc thể

ở trạng thái kết xoắn, co ngắn, mập ra và

phân bố trên mặt phẳng xích đạo

Kích thước nhiễm sắc thể sai khác

nhau rất lớn Giữa các loài khác nhau sự

sai khác này có thể lên tới 100 lần

hợp rARN, tích tụ tạm thời và hình thành nên cấu trúc gọi là hạch nhân (nucleolus) Hai đầumút của nhiễm sắc thể ở eukaryote có cấu trúc đặc biệt gọi là telomere.

Hình 1.16 Kiểu nhân bộ nhiễm sắc thể người

Bằng các kỹ thuật tế bào học hiện đại, căn cứ các mặt chức năng, cấu trúc, hình thái vàđặc thù trong hoạt động, người ta đã phân biệt các loại nhiễm sắc thể khác nhau:

+ Nhiễm sắc thể thường, tức nhiễm sắc thể A (Autosomes) giống nhau ở cả hai giớiđực và cái

+ Nhiễm sắc thể giới tính (sex chromosomes) khác nhau giữa giống đực và giống cái.+ Nhiễm sắc thể B còn được gọi là nhiễm sắc thể bổ sung hoặc nhiễm sắc thể phụ,được phát hiện ở một số loài thực vật như Ngô, mạch đen, ngoài số nhiễm sắc thể A bìnhthường

Các nhiễm sắc thể B ít gặp hơn trong các giống đã được chọn lọc của các loài nói trên.Nhiễm sắc thể B cũng có ở nhiều sâu bọ, giun dẹt, nhưng bé và không có hiệu quả di truyền

rõ rệt

Ngoài ra ở một số tổ chức, cơ quan ở một số loài, có dạng nhiễm sắc thể đặc biệt nhưnhiễm sắc thể khổng lồ, nhiễm sắc thể kiểu chổi đèn

* Nhiễm sắc thể khổng lồ (polytene chromosome)

Đây là một loại nhiễm sắc thể có hình dạng và hoạt động đặc trưng có trong một số cơ

quan, tuyến nước bọt, tuyến Manpighi, màng ruột một số côn trùng bộ 2 cánh (Diptera).

E Balbiani, người Ý, năm 1881 phát hiện đầu tiên nhiễm sắc thể khổng lồ ở tuyến

nước bọt ấu trùng Chironomus.

Người ta còn gọi đây là nhiễm sắc thể đa sợi (polytene) vì chúng có số lượng sợinhiễm sắc thể nhiều gấp hàng ngàn lần so với nhiễm sắc thể thường, có thể chứa tới 1500-

30

1600 sợi nhiễm sắc, mỗi sợi này tương đương với một chromatide Nguyên nhân của hiêntượng này là do cơ chế nội nguyên phân hay nội phân bào (endomitosis), nhiễm sắc thể tựnhân đôi, tái bản bình thường, nhưng sau đó lại không phân ly, nhân tế bào không phân chia,

do đó mà bộ nhiễm sắc thể khổng lồ có dạng chùm nhiều sợi nhiễm sắc (chromoeme), bềngang to phình ra thành dạng bó sợi, đường kính lớn, chiều dài của những nhiễm sắc thểkhổng lồ có thể tới 250-300µm, do các nhiễm sắc thể này không đóng xoắn mà luôn ở dạngdây đôi dài, có thể gấp 100-200 lần nhiễm sắc thể thường

Các sợi nhiễm sắc thể ở trạng thái xoắn không đồng đều, dọc theo trục của nhiễm sắcthể khổng lồ, phân hoá rõ rằng theo chiều dài thành những khoanh bắt màu xẫm, nhạt, khôngđồng nhất, dẫn đến tính có vân, dọc theo chiều dài nhiễm sắc thể khổng lồ, như các đĩa sangtối xen nhau Người ta cho rằng các đĩa xẫm màu là nơi tích luỹ nhiều ADN, được tạo ra hoặc

do độ xoắn định khu dày đặc hoặc do tập trung nhiều hạt nhiễm sắc (chromomere) Quan sát

ruồi dấm D melanogastes thấy rằng các biến dị cấu trúc có liên quan với vị trí các đĩa màu cụ

thể Trình tự sắp xếp của các gen trên nhiễm sắc thể, tức các locus của chúng, có trùng vớicác đĩa màu nhất định- ở mỗi loài có hình ảnh về sự sắp xếp và hình dạng các đĩa màu đặc thùcủa loài

Với sự phát hiện của nhiễm sắc thể khổng lồ, di truyền tế bào học đã mở rộng khảnăng kiểm tra về mặt tế bào học các quá trinh di truyền Nghiên cứu tế bào học nhiễm sắc thểkhổng lồ tuyến nước bọt ruồi dấm đã cho phép xác định đúng vị trí của hàng loạt gen trênnhiễm sắc thể để thiết lập bản đồ tế bào học

* Nhiễm sắc thể kiểu chổi đèn

Được phát hiện trong nhân các tế bào trứng động vật có xương sống ở kỳ trước I giảmphân Mỗi nhiễm sắc thể chổi đèn gồm hai nhiễm sắc thể tương đồng gắn nhau bởi tâm động,mỗi nhiễm sắc thể tương đồng gồm 2 chromatid chị em, mỗi chromatid có một số các vòng ở

Hình 1.17 Hình ảnh NST khổng lồ (trái) và NST chổi đèn (phải)

bên, che nhánh ở trục chính Các vòng này quấn cả trong và ngoài nhiễm sắc thể (giống nhưcác bọng trên nhiễm sắc thể khổng lồ - là nơi tổng hợp nhiều ARN)

III 3 Cấu trúc nhiễm sắc thể

Những năm gần đây nhất đã có nhiều thực nghiệm theo hướng làm rõ vấn đề cấu trúc,

tổ chức của nhiễm sắc thể, đảm bảo cho chức năng di truyền quan trọng của chúng, là cơquan trong nhân tế bào, mang ADN, chứa thông tin di truyền đặc trưng của loài

Về chức năng, người ta thấy rõ vai trò của nhiễm sắc thể, phải tạo ra được môi trườngvật lý cho các phân tử ADN trong đó, có thể tác động qua lại với cả hệ thống trao đổi chấttrong tế bào

Vấn đề mấu chốt, quyết định là nhiễm sắc thể phải có một tổ chức, một kiểu sắp xếpđặc biệt mới tạo thuận lợi cho hoạt động của ADN chứa trong đó, bảo đảm cho quá trình táibản ADN và phân phối các bản sao ADN về các tế bào con, được hình thành qua nguyênphân và giảm phân

Hệ thống sắp xếp, cách tổ chức, bố trí ADN trong nhiễm sắc thể rõ ràng vô cùng phứctạp, tinh tế, mới đảm bảo để một tế bào, nhất là tế bào ở sinh vật nhân chuẩn, có thể chứanhiều nhiễm sắc thể , trong đó bao gồm cả một độ dài tổng số cực lớn ADN, dài gấp nhiều lần

so với kích thước của tế bào

Nghiên cứu , thực nghiệm để làm rõ cách sắp xếp của ADN trong nhiễm sắc thể cónhiều khó khăn vì:

- Tính chất phức tạp của cấu trúc nhiễm sắc thể

- Các phương pháp, kỹ thuật để nghiên cứu nhiễm sắc thể thường lại làm mất đi hoặcgiảm hoạt tính của nhiễm sắc thể

- Từ trước đến nay, các nghiên cứu tế bào học ở sinh vật nhân chuẩn thường chỉ tậptrung trên các tế bào đang phân chia ( nguyên phân và giảm phân)

Tuy vậy, cho đến nay, người ta cũng đã thu được nhiều kết quả qua thực nghiệm, nêu

ra được giả thuyết về cách sắp xếp của ADN trong nhiễm sắc thể

Các kết quả thực nghiệm còn cho thấy cách tổ chức, cấu trúc nhiễm sắc thể tiêu biểucho một mối tương tác phức tạp nhất giữa cấu trúc và chức năng trong tế bào sống

III.3.1 Tổ chức của ADN trong nhiễm sắc thể sinh vật nhân nguyên thuỷ:

nucleoic (vùng nhân)

Nhân trong tế bào sinh vật nhân nguyên thuỷ chỉ mới ở dạng nucleoic (vùng nhân), làvùng chứa ADN, trong đó ADN được gấp và cuộn thành nhiều vòng xoắn: Qua kính hiển viđiện tử, người ta thấy được dạng siêu xoắn của ADN này, tính chất siêu xoắn ở đây chịu sựkiểm soát của enzym topoisomerase

Bằng thực nghiệm, người ta đã tách được ADN từ tế bào E.Coli thành khối đặc, tức

nucleoic, trong đó có tác động lẫn nhau giữa ARN với ADN để hình thành cuộn gấp

32

Nhiễm sắc thể của sinh vật nhân nguyên thuỷ cũng có phần protein gắn ở trong đó.Đây là loại histon có một đoạn axit amin tương ứng với histon 2B của sinh vật nhân chuẩn, làhiston ổn định nhất, vì đoạn axit amin này là chung cho mọi sinh vật nhân chuẩn.

Một trong các vai trò của histon có thể là để bảo vệ ADN khỏi bị thuỷ phân bởi nhiềunuclease có mặt trong tế bào Vì vậy, ta thấy mọi ADN trong tế bào sinh vật nhân nguyênthuỷ đều có histon kết hợp Người ta cũng thấy virut SV-40 ở động vật có vú cũng có ADNhai sợi kết hợp với histon

III.3.2 Tổ chức ADN trong nhiễm sắc thể sinh vật nhân chuẩn: nucleosome ( thể

nhân)

Việc nghiên cứu cách tổ chức, sắp xếp của ADN trong nhiễm sắc thể đã được tiếnhành bởi Wood-Cock, Oluis 1974 và Oudet, 1975 Ngày nay, người ta đã xác định rõ trongnhân eukaryote có ít nhất 2 nhiễm sắc thể với hàm lượng ADN lớn hơn nhiều Các ADN liênkết với nhiều loại protein khác nhau, chủ yếu là các histon (có bản chất bazơ) và các proteinphi histon (có bản chất axit), để tạo ra phức hợp nucleoprotein gọi là chất nhiễm sắc(chromatin)

Protein histon trong các tế bào sinh vật nhân chuẩn gồm có 5 loại, với tỷ lệ gần nhưnhau, bao gồm H1, H2A, H2B, H3, H4 Riêng hàm lương H1 chỉ bằng khoản ½ các loại kia

Trong nhiễm sắc chất, ADN được cuộn xoắn, co ngắn lại ít nhất trên hàng 100 lần, cónhiều mức độ cuộn vòng, co xoắn khác nhau Mức đơn giản nhất là thể nhân, tức nucleosomeđược xem là đơn vị cấu tạo cơ sở theo chiều dọc của nhiễm sắc thể, có phần protein là 8 phân

tử histon (octamer), được cuộn quanh bởi ADN

Trong nucleosome, octamer histon gồm:

- 2 phân tử H3 và 2 phân tử H4 liên kết ở vùng trung tâm

- 2 phân tử H2A và 2 phân tử H2B liên kết ở phía ngoài

Trong mỗi nucleosme, octamer histon được quấn bởi 13/4 vòng sợi ADN, ứng vớikhoảng 140-160 bp Mỗi nucleosome có đường kính 100A0 Nucleosome này nối vớinucleosome kia bằng một đoạn ADN nối dài 15-100bp, có gắn các phân tử histon H1 tạothành một dãy nhiều nucleosome tạo nên sợi cơ bản của nhiễm sắc thể có đường kính khoản100A0

Sợi cơ bản này được xoắn tiếp một mức nữa là xoắn bậc 2, tạo nên sợi nhiễm sắc, cóđường kính khoảng 250A0 Bước cuộn xoắn này liên quan đến vai trò của histon H1, có vaitrò đặc biệt quan trọng tạo ra sự bền vững trong liên kết của các nucleosome, để hình thànhcuộn xoắn bậc 2, còn được gọi là solenoit Trong kỳ trung gian, solenoit được cuộn xoắn mộtlần nữa, tạo nên một ống rỗng, đường kính khoảng 2000A0, cuối cùng là một lần cuộn xoắntiếp của ống rỗng, tạo thành cuộn xoắn lớn hơn, có đường kính 6000A0, đây là cácchromatide ở kỳ giữa

Cấu trúc nucleosome được giữ trong suốt chu kỳ của tế bào Các phân tử histon trong

đó được duy trì suốt quá trình tiến hoá, chứng tỏ vai trò quan trọng của chúng đối với cấu trúccủa nhiễm sắc thể, chúng luôn có số lượng ổn định

Hình 1.17 Tổ chức sắp xếp của ADN trong nhiễm sắc thể ở

sinh vật nhân chuẩn

III.3.3 Dị nhiễm sắc chất và đồng nhiễm sắc chất

Trong chiều dài của nhiễm sắc thể, nhiễm sắc chất cũng không đồng đều Có đoạn là

dị nhiễm sắc chất (heterochromatin)-là dạng nhiễm sắc chất kết xoắn nhiều nhất, được pháthiện quanh tâm động và trên nhiễm sắc thể Y, nhuộm màu nhanh hơn, giữ màu lâu hơn Phầnnày của nhiễm sắc thể chỉ giữ vai trò cấu trúc trong sự vận động của nhiễm sắc thể trongnguyên phân và giảm phân Đoạn dị nhiễm sắc chất kết xoắn trước các đoạn khác, khôngmang hoặc mang ít gen, hầu như không có hoạt tính di truyền, tự sao muộn hơn, không sao

mã, duy trì trạng thái cuộn xoắn cả trong kỳ trung gian Người ta chia làm hai loại dị nhiễmsắc chất: Loại dị nhiễm sắc chất không ổn đinh và loại dị nhiễm sắc chất ổn định

Những đoạn khác trên nhiễm sắc thể là những đoạn đồng nhiễm sắc chất(euchromatin) bắt màu bình thường, ngưng kết, đóng xoắn bình thường, có hoạt tính sao mã,mang gen, tái bản sớm hơn trong giai đoạn tổnghợp ADN

III 4 Chu kỳ tế bào và nguyên phân

34

Nguyên phân (mitosis) là quá trình phân chia tế bào trong đó các tế bào con được tạo

ra có số lượng nhiễm sắc thể giống với các tế bào bố mẹ Kiểu phân bào này đặc trưng chocác tế bào soma, kế cả các tế bào sinh dục (2n) ở pha sinh sản của sự phát sinh giao tử, xảy ratheo cấp số nhân với bội số bằng 2, nghĩa là từ một tế bào mẹ ban đầu, qua k lần nguyên phân

sẽ tạo ra 2k tế bào giống nó Nhờ vậy cơ thể lớn lên và các tế bào trong cơ thể thường xuyênđược đổi mới

III.4.1 Chu kỳ tế bào (cell cycle)

Các quá trình sinh sản, sinh trưởng và phát triển của tế bào diễn ra vừa có tính liên tụcvừa có tính đồng thời và trong một thời gian nhất định có tính chu kỳ, đó là chu kỳ tế bào

Chu kỳ này gồm các pha của sự phân chia tế bào nguyên nhiễm (M) và kỳ trung gian(interphase) với 3 pha G1, S và G2 Thời gian của toàn bộ quá trình này thay đổi phụ thuộcvào loại tế bào

Toàn bộ một chu kỳ tế bào gồm 4 pha theo thứ tự sau đây :

III.4.2 Nguyên phân (mitosis)

Quá trình nguyên phân được chia thành 4 giai đoạn khác nhau, diễn biến theo mộttrình tự: kỳ trước (prophase), kỳ giữa (metaphase), kỳ sau (anaphase) và kỳ cuối (telophase).Mỗi giai đoạn có một nét đặc trưng riêng và gắn liền với tập tính của nhiễm sắc thể

+ Thời kỳ trước tổng hợp G1 (giai đoạn

G1-first gap) : Thời kỳ này thực hiện việc tổng

hợp các protein đặc trưng và các quá trình khác

để chuẩn bị cho việc tổng hợp ADN

+ Giai đoạn S (DNA synthesis): ADN

được nhân đôi đồng thời với nhân đôi của histon

và một số protein khác

+ Giai đoạn G2 (second gap): ADN tiếp

tục sữa chữa các sai sót khi nó tự nhân đôi, chuẩn

bị cho quá trình nguyên phân

+ Giai đoạn M (mitosis): Thực hiện quá

trình nguyên phân

Hình 1.19 Sơ đồ mô tả chu kỳ tế bào.

giai đoạn này, hạch nhân thường biến mất và màng nhân bắt đầu tan vỡ Trung thể (centriole)phân chia và hình thành xung quanh nó một cấu trúc mới gồm rất nhiều sợi thoi trải dài tớicác cực của tế bào, một số sợi thoi đính trực tiếp vào tâm động của nhiễm sắc thể.

III.4.2.2 Kỳ giữa

Vào kỳ giữa, màng nhân tan biến hoàn toàn, các sợi thoi đính vào tâm động của cácnhiễm sắc thể và đẩy chúng về mặt phẳng xích đạo của tế bào và xếp thành một vòng Lúcnày các nhiễm sắc thể đóng xoắn cực đại với cấu trúc điển hình đặc trưng cho từng loài

III.4.2.3 Kỳ sau

Vào đầu kỳ sau, tại mỗi nhiễm sắc thể xảy ra sự phân tách tâm động, các chromatid chị

em rời nhau và được gọi là các nhiễm sắc thể con Kế đó, các sợi thoi co rút và gây ra sựchuyển động của các nhiễm sắc thể con giống nhau về hai cực Chính sự sắp xếp thành mộtvòng của nhiễm sắc thể ở kỳ giữa và sự phân ly đồng đều của chúng về hai cực ở kỳ sau làquy luật đặc trưng cho quá trình nguyên phân

Hình 1.20 Chu trình nguyên phân Theo thứ tự A, B, C, D-E, F: Kỳ trung

gian, kỳ trước, kỳ giữa, kỳ sau, kỳ cuối

36

III.4.2.4 Kỳ cuối

Vào kỳ cuối, hai bộ nhiễm sắc thể con đã về tới các cực đối diện và bắt đầu mở xoắn.Lúc này màng nhân xuất hiện trở lại và bao bọc các bộ nhiễm sắc thể, các thoi vô sắc tanbiến, hạch nhân và các nhân được hình thành trở lại

Kế đó, ở động vật, màng tế bào hình thành một eo thắt từ ngoài vào trong; ở thực vật,một phiến tế bào phát triển từ trung tâm ra ngoài Điều này làm phân cách hai bộ nhiễm sắcthể con và tế bào chất giữa hai tế bào con Các tế bào con có số lượng nhiễm sắc thể giốngvới tế bào ban đầu Như vậy, nguyên phân gồm hai quá trình phân chia: phân chia nhân vàphân chia tế bào chất; nhưng về thực chất là sự phân chia nhân

III.5 Giảm phân, phát sinh giao tử và thụ tinh

III.5.1 Giảm phân (meiosis)

Giảm phân là kiểu phân bào đặc trưng cho các tế bào sinh dục, trong đó các tế bào consinh ra (gọi chung là các giao tử) có số lượng nhiễm sắc thể giảm đi một nửa

Giảm phân xảy ra ở pha trưởng thành sau khi bộ nhiễm sắc thể đã được nhân đôi ở kỳtrung gian thuộc pha sinh trưởng Quá trình giảm phân gồm hai lần phân chia nối tiếp nhau,giảm phân I và giảm phân II Mỗi lần phân chia này cũng được chia làm bốn kỳ: Giảm phân Icòn được gọi là phân bào giảm nhiễm vì số lượng nhiễm sắc thể 2n giảm xuống còn n Tronggiảm phân I, các chromtid chị em vẫn còn dính nhau trong khi các nhiễm sắc thể tương đồngphân ly Giảm phân II còn gọi là phân chia đồng đều và rất giống với nguyên phân ở chỗphân tách các chromatid chị em và số lượng nhiễm sắc thể giữ nguyên

Hình 1.21 Kết quả của giảm phân với hai lần phân chia Sơ đồ này còn cho thấy hiậu quả

của sự tái tổ hợp và phân chia giảm nhiễm trong giai đoạn giảm phân I

Giảm phân là quá trình di truyền căn bản và quan trọng nhất ở cấp độ tế bào, là sơ sởcho việc lý giải các qui luật di truyền và biến dị Giảm phân cùng với sự thụ tinh sau đó chophép duy trì số lượng nhiễm sắc thể ở các loài sinh sản hữu tính; giảm phân I cho phép các

nhiễm sắc thể bố và mẹ khác nhau phân ly ngẫu nhiên về mỗi giao tử; sự trao đổi chéo giữacác chromatid trên các cặp nhiễm sắc thể tương đồng ở kỳ trước trong giảm phân I tạo ra các

tổ hợp alen mới ở các gene khác nhau

III.5.1.1 Giảm phân I

a Kỳ trước I (prophase I)

Đây là pha phức tạp nhất của toàn bộ quá trình giảm phân, được chia thành 5 giai đoạnkhác nhau:

+ Leptitene (sợi mảnh): các nhiễm sắc thể xuất hiện ở dạng sợi mảnh

+ Zygotene (sợi kết hợp): các nhiễm sắc thể tương đồng tiến lại gần nhau và các gentương ứng đứng đối diện nhau Quá trình kết hợp của các nhiễm sắc thể tương đồng sau đógọi là sự tiếp hợp, là nét đặc trưng phân biệt giữa nguyên phân và giảm phân Cấu trúc gồmhai nhiễm sắc thể tương đồng chứa 4 chromatid chị em gọi là thể lưỡng trị

+ Pachytene (sợi dày): các thể lưỡng trị ngắn lại, dày lên và sự tiếp hợp hoàn tất.Trong giai đoạn này có thể xảy ra sự trao đổi chéo hay tái tổ hợp

+ Diplotene (sợi kép): các nhiễm sắc thể tương đồng bắt đầu tách ra, đặc biệt là ở cácvùng nằm hai bên tâm động Thông thường mỗi cặp nhiễm sắc thể tương đồng có thể có mộthoặc hai vùng trong đó chúng vẫn còn kề sát nhau hoặc tiếp xúc với nhau, gọi là các hìnhchéo-là bằng chứng cho sự tái tổ hợp xảy ra sau khi các nhiễm sắc thể tương đồng đã tiếphợp Dọc trên các nhiễm sắc thể có thể có một số hình chéo

+ Diakinesis: các nhiễm sắc thể co ngắn lại và chấm dứt các hình chéo Điều đó cónghĩa là các hình chéo bị đẩy về các đầu mút của nhiễm sắc thể Hạch nhân và màng nhânbiến mất

b Kỳ giữa I (metaphase I)

Trong kỳ này, các nhiễm sắc thể xếp trên mặt phẳng xích đạo thành 2 vòng và các tâmđộng được đính vào các sợi thoi vô sắc sao cho cứ hai nhiễm sắc thể của mỗi cặp tương đồng(thể lưỡng trị) nằm đối diện nhau qua mặt phẳng xách đạo với các hình chéo xếp thẳng hàngdọc theo nó Là cơ sở cho sự phân chia giảm nhiễm và phân ly ngẫu nhiên của các nhiễm sắcthể ở kỳ sau I

c Kỳ sau I (anaphase I)

Ở kỳ sau I, hai tâm động trong các nhiễm sắc thể tương đồng của mỗi thể lưỡng trị đẩynhau ra xa, sao cho một nhiễm sắc thể của mỗi cặp tương đồng đi về một cực Khi các nhiễmsắc thể tương đồng đẩy nhau ra, các hình chéo hoàn toàn chấm dứt Các chromatid chị emvẫn còn dính nhau ở tâm động

d Kỳ cuối I (telophase I)

Ở hầu hết các sinh vật, sau khi các nhiễm sắc thể di chuyển tới các cực thì màng nhânhình thành xung quanh chúng và tế bào này phân chia thành 2 tế bào con Tuy nhiên, các chitiết chính xác về mặt tế bào học của kỳ cuối I vẫn còn nhiều sai biệt, đặc biệt ở thực vật

38

III.5.1.2 Giảm phân II

Giữa giảm phân I và giảm phân II có một kỳ trung gian rất ngắn gọi là interkinesis,không xảy ra sự tổng hợp ADN, mỗi tế bào chứa một bộ nhiễm sắc thể đơn bội (n), trong đómỗi nhiễm sắc thể chứa hai chromatid chị em Kỳ trước II thường xảy ra rất nhanh và không

rõ nét; các kỳ còn lại tương tự như trong nguyên phân Cụ thể, ở kỳ giữa II, các tâm độngdính vào các sợi thoi và di chuyển về mặt phẳng xích đạo; vào đầu kỳ sau II, các nhiễm sắcthể tách nhau ở tâm động và sau đó các nhiễm sắc thể con phân ly về các cực đối diện; kỳcuối II bắt đầu khi tại mỗi cực có một bộ nhiễm sắc thể đơn bội đơn (n) và màng nhân hìnhthành xung quanh chúng

III.5.2 Sự phát sinh giao tử

Giảm phân là thời kỳ quan trọng nhất của quá trình phát sinh giao tử ở động vật vàphát sinh bào tử ở thực vật Hai quá trình này về căn bản là giống nhau nhưng cũng có sựkhác nhau cơ bản

III.5.2.1 Sự phát sinh giao tử ở động vật

Ở động vật, sự tạo thành giao tử đực hay tinh trùng gọi là sự sinh tinh xảy ratrong tinh hoàn-cơ quan sinh sản đực Quá trình này bắt đầu với sự sinh trưởng của một tếbào lưỡng bội chưa biệt hoá gọi là tế bào mẹ tinh trùng Tại pha sinh sản, tế bào này thực hiệnnhiều lần nguyên phân để gia tăng số lượng tế bào mẹ tinh trùng (2n) sau đó, các tế bào nàychuyển qua pha sinh trưởng, biệt hoá thành một tinh bào sơ cấp (2n kép) Kế đó, tế bào nàytrải qua pha trưởng thành với hai lần phân chia liên tiếp của giảm phân Sau giảm phân I, mộttinh bào sơ cấp cho ra hai tinh bào thứ cấp (n kép) Sau giảm phân II, mỗi tế bào này phânchia thành 2 tinh tử (n) Bước cuối cùng là sự biệt hoá tinh tử thành các tế bào tinh trùng cócấu tạo đầy đủ các bộ phận như đầu, cổ và đuôi dài

Sự sinh trứng ở động vật xảy ra trong các buồng trứng, cơ quan sinh sản cái Quá trìnhnày cũng bắt đầu bằng một tế bào mẹ của trứng (2n) Sau khi trải qua pha sinh sản, mỗi tế bàosinh noãn này biệt hoá thành noãn bào sơ cấp (2n kép) ở pha sinh trưởng với kích thước tăngtrưởng một cách đặc biệt Tại pha trưởng thành, sau giảm phân I, từ noãn bào sơ cấp tạo ramột noãn bào thứ cấp (n kép) và thể cực thứ nhất Sau lần giảm phân II, từ oãn bào thứ cấptạo

ra một noãn tử (n) và một thể cực, còn thể cực kia tạo ra hai thể cực thứ hai Kết quả của cảquá trình nói trên là từ một tế bào sinh noãn tạo ra 1 noãn có kích thước rất lớn và 3 thể cựckích thước rất nhỏ

Hình 2.22 Sơ đồ minh hoạ quá trình sinh tinh và sinh trứng ở động vật.

III.5.2.2 Sự phát sinh giao tử ở thực vật

Ở thực vật bậc cao, sự hình thành các giao tử được gọi là sự hình thành hạt phấn hayphát sinh tiểu bào tử Sự hình thành noãn còn gọi là sự hình thành túi phôi hay phát sinh đạibào tử Các quá trình này tương tự như giảm phân ở động vật, nhưng sản phẩm của chúng có

sự khác nhau đáng kể

Hình 1.23 Vòng đời của hoa Lys, một đại diện của thực vật bậc cao.

a Sự hình thành hạt phấn

Trong các bao phấn của cơ quan sinh sản đực (nhị), mỗi tế bào mẹ hạt phấn hay tế bào

mẹ tiểu bào tử (2n) trải qua giảm phân với 2 thoi vô sắc thẳng góc nhau tạo ra một cụm bốn

40